הערכה של תפקוד דו-חדרי Ex Vivo Murine במודל לנגנדורף
23 בדצמבר 2022
מוצג כאן פרוטוקול לכימות אמין של תפקוד החדר הימני והשמאלי של לבבות תורמים לאחר שימור קר באמצעות מערכת זילוח ex vivo .
בעזרת הפרוטוקול המתואר, אנו יכולים להשוות בין הלב התורם, החדר השמאלי ותפקוד החדר לאחר השימור, ואנו יכולים לבחון את ההבדל בביולוגיה של שימור בשני החדרים במהלך תהליך שימור זה. טכניקה זו משתמשת במערכת זילוח ex vivo כדי לבחון את תפקודי הלב לאחר השימור. הוא מספק כלים חזקים ואמינים לסינון טיפולים חדשים לשיפור תפקודי הלב של התורם לאחר השימור.
מתחילים בהכנת בצק כמתואר בטקסט ומעצבים חתיכה קטנה מהבצק לצורה אליפסה כדי לקבל את הראש. חברו אותו לקצה גדיל ספגטי יבש. טובלים את הראש בתמיסת הסוכר שכבר מוכנה ומסירים אותה לאט ברגע שהיא מצופה היטב בסרט דק של התמיסה.
לאחר מכן, השהו את גדיל הספגטי על גוש קצף פוליסטירן או על מחזיקים אחרים כדי לאפשר היווצרות כיסוי אחיד ומבריק מעל הראש וייבשו אותו למשך הלילה. למחרת, טובלים את התבנית באלסטומר סיליקון המפוזר בקסילן ומחזירים את גדיל הספגטי לגוש קצף הפוליסטירן בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים או עד לייבוש. חזור על שלב זה פעם נוספת.
לאחר מכן, הכניסו את התבנית למים כדי להפריד ולאסוף את הבלון. אחסנו את הבלון ב-0.02% נתרן אזיד. כעת, חתכו קצה קהה של שני קהות ממחט של 22 מד והרכיבו קצה קהה אחד לבלון הסיליקון ואילו הקצה השני קהה לצינור PE.
השתמש בתפר משי 4-0 כדי לקשור את הבלון במקומו על המחט. קח את העכבר C57Black/6 והזריק תוך צפקית 200 יחידות של הפרין לתוך הבטן של החיה עבור נוגדי קרישה. לאחר אישור הרדמה תקינה עם צביטת בוהן, לבצע חתך ממש מתחת עצם החזה.
ובאמצעות מספריים, לפתוח את החזה על ידי חיתוך הסרעפת בצלעות. לאחר מכן, קפלו את דופן החזה הקדמית כדי לחשוף את החזה במלואו לפני ביצוע חתך באבי העורקים היורד קרוב לקשת אבי העורקים. כעת, העבירו את הלב, הריאות ובלוטת התימוס של העכבר להיסטידין-טריפטופן-קטוגלוטרט קר כקרח, או מאגר HTK, כדי לבודד את האיברים.
חשוף את אבי העורקים על ידי הסרת כל רקמת חיבור. חברו את קצה אבי העורקים למחט בעלת 22 מד וקשרו אותה בתפר משי 6-0. ודא שהצינורית נמצאת מעל שורש אבי העורקים, כדי לא להפריע לשסתום אבי העורקים.
מחוררים את אבי העורקים למשך כ-10 דקות עם 10 מיליליטר של חיץ HTK, מקורר מראש לארבע מעלות צלזיוס. בהתאם לסוג הניסוי, או לאחסן את הלב בצינור 50 מיליליטר עם HTK קר כקרח במשך שמונה שעות או מיד לבצע את השפע. כדי לבצע שפע, חבר את הלב המורכב על המחט לצינורית במנגנון לנגנדורף וקשר אותו בתפר משי.
התחל את השפע במצב זרימה קבועה בשלושה מיליליטר לדקה, ולאחר מכן לאחר שינוי למצב לחץ קבוע ב 70 עד 80 מילימטר כספית, להתאים את קצב הזלוף לכשישה מיליליטר לדקה. לאחר מכן, חברו בלון סיליקון מנופח מלא מים למתמר לחץ ולמזרק מלא מים באמצעות ברז תלת-כיווני. לאחר 15 עד 20 דקות של תקופת שיווי משקל לאחר הזילוח הקודם, חתכו את האטריום הימני, או RA, והכניסו את הבלון לחדר הימני, או RV, דרך RA. השתמש בסרט כדי להחזיק את הבלון בתוך הקרוואן ולמזער את השטח הפתוח של RA כדי לעזור להגביל את הבלון בחדר.
לאחר 20 דקות של איסוף נתונים פונקציונליים עבור הקרוואנים, חתכו את האטריום השמאלי, או LA, והכניסו בלון מלא מים מנופח לחדר השמאלי, או LV, דרך לוס אנג'לס. השתמשו בנייר דבק כדי להחזיק את הבלון בתוך LV.To לכייל את מתמר הלחץ, מלאו תחילה מזרק 10 מיליליטר במי מלח חמים וחברו את המזרק לכיפה דרך ברז משולש. פתחו את הברז ומלאו לאט את הכיפה במי מלח לפני סגירת כל הברזים והוצאת המזרק. לאחר מכן, חבר את הכיפה המלאה למתמר על ידי חיבור מד הלחץ לקצה השלישי של הברז התלת-כיווני.
בתוכנת ההקלטה, מהתפריט הנפתח של הערוץ המתחבר למתמר, בחר באפשרות של גשר אמפר. לחץ על 0 לפני תחילת ההקלטה כדי להגדיר את קריאת המתמר לאפס מילימטרים של כספית. לאחר מספר שניות של הקלטה, לדחוף לאט את המזרק ולהגדיל את הלחץ ל 100.
לחץ על תפסיק כדי לסיים את ההקלטה. בתיבת הדו-שיח המרת יחידות, בחר את אזור ההקלטה עבור אפס מילימטרים של כספית ולחץ על החץ ל- 1 לפני הקלדת אפס מילימטרים של כספית. באופן דומה, בחר את אזור ההקלטה עבור 100 מ"מ כספית.
לחץ על החץ ל- 2 והקלד 100 מילימטרים של כספית. כעת, לחץ על אישור כדי לכייל את המתמר. לאחר סיום הכיול, שנו את שם התעלה המתאימה למתמר הלחץ עם הבלון כלחץ חדרי, או לחץ LV, והתחילו להקליט כאשר הלב מחובר למערכת.
לאחר החדרת הבלון לחדר, התאימו את נפח המים בבלון באמצעות מזרק מיקרומטר דרך הברז התלת-כיווני כדי לשמור על הלחץ הדיאסטולי הסופי בחמישה עד 10 מילימטרים של כספית. לאחר מכן, שנה את שם הערוץ הריק כ- dP/dt ושמור על ערוץ המקור הנגזרת כלחץ חדרי. תעלה זו רושמת את יחס שינוי הלחץ בחלל החדר במהלך התכווצות.
בחר את תקופת המדידה היציבה לפני שתגדיר את מודול לחץ הדם. לאחר מכן, בחר את לחץ LV כערוץ הקלט ולחץ על בחירה לפני לחיצה על אישור. כעת, לחץ על תצוגת מסווג כדי להסיר מחזור לב חריג ועל תצוגת טבלה כדי ליצור את הטבלאות עבור הממוצע של dP/dt מרבי ו- dP/dt מינימלי עבור התקופה שנבחרה. כאשר לב העכבר אוחסן במאגר HTK במשך אפס שעות לפני הזילוח, לחץ סיסטולי גבוה יותר נרשם עבור LV בהשוואה ל- RV. בנוסף, בהשוואה ל-RV, ה-LV הציג גם התכווצות שרירים משמעותית יותר, כמו גם הרפיה.
עם זאת, כאשר בוצע זילוח על הלב לאחר שחשף אותו לשמונה שעות של אחסון קר, הן ה- LV והן ה- RV הראו ירידה תפקודית משמעותית בהשוואה לשלב שעת האפס. הירידות נצפו חמורות יותר ב-LV בהשוואה ל-RV. ההתכווצות וההרפיה של ה-LV לאחר אחסון של שמונה שעות היו 25.1% ו-30.7% מהפונקציה המתאימה לאחסון שעות אפס, בעוד שה-RV הציג 32.5% ו-29.1% של תפקוד, בהשוואה לקו הבסיס של שעת אפס. ציון תפקוד לקוי ראשוני של LV לאחר אחסון ממושך היה משמעותי יותר מזה של RV. איכות השימור תלויה במידה רבה בזילוח של HTK.
חשוב לוודא שהזילוח עקבי כדי להשוות במדויק בין טיפולים שונים. עם מדידה מדויקת של תפקוד הלב התורם של שימור, שיטה זו יכולה בקלות להסתגל לתרופות סינון שיכולות לשפר את תפקוד הלב התורם ולאחר מכן לאמת עוד יותר באמצעות מודל השתלה הטרוטופית.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לכימות תפקודי החדר הימני והשמאלי של לבבי תורם לאחר שימור בקירור באמצעות מערכת פרפוזיה ex vivo. הוא מאפשר השוואה של תפקוד החדרים לאחר השימור ובחינה של הביולוגיה של תהליך השימור.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- פיזיולוגיה של מערכת קרדיווסקולרית
- ביולוגיה של השתלות
- טכניקות של פרפוזיית לב ex vivo
רקע
- הבנת תפקוד לב התורם היא חיונית להצלחת השתלה.
- שימור בקור משפיע על התכונות הפיזיולוגיות של חללי הלב.
- מערכת הפרפוזיה ex vivo מספקת סביבה מבוקרת לצורך הערכה.
- ניתוח השוואתי של תפקוד החדר השמאלי והימני יכול להנחות אסטרטגיות טיפול.
מטרת המחקר
- לכימות מהימנה של תפקוד החדרים לאחר שימור בקור.
- לבחינת ההבדלים בהשפעות השימור על החדרים השמאלי והימני.
- לפיתוח שיטה חזקה לסריקת טיפולים לשיפור תפקוד לב תורם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת לבבות תורם באמצעות תמיסת HTK לשימור.
- פרפוזיה של לבבות ex vivo להערכת פרמטרים תפקודיים.
- החדרת מתמירים של לחץ למדידת לחצים חדרתיים.
- איסוף נתונים וניתוח של מדדי תפקוד סיסטולי ודיאסטולי.
תוצאות עיקריות
- לחץ סיסטולי גבוה יותר נרשם בחדר השמאלי בהשוואה לחדר הימני.
- החדר השמאלי הפגין התכווצות והרפיה שרירית חזקות יותר מאשר החדר הימני.
- להשפעות של משך האחסון בקירור על תפקוד החדרים הייתה משמעות סטטיסטית.
- איסוף נתונים תפקודיים סיפק תובנות לגבי ביולוגיית השימור.
מסקנות
- הפרוטוקול מציע שיטה מהימנה להערכת תפקוד לב תורם.
- הודגשו הבדלים בתגובות של החדר השמאלי והימני לשימור.
- מחקר זה תורם להבנת טכניקות לשימור לב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה אמינה ex vivo של תפקוד דו-חדרי עכברי במודל Langendorff מאפשרת בחינה מדויקת של חיוניות לב התורם לאחר שימור בקירור, ובכך נותנת מענה ישיר לסיכון של תפקוד לקוי ראשוני של הש Transplant (primary graft dysfunction) במחקרים של השתלות. מדידה כמותית של תגובות החדר השמאלי והימני תומכת בהפחתת סיכונים מנקודת מבט מכניסטית ומספקת מידע לסריקה בשלב מוקדם של אסטרטגיות שימור או תרופות מועמדות. פלטפורמה זו מגבירה את הביטחון החזוי בנקודת המפנה הפרה-קלינית, ובכך תומכת בקידום תיק פיתוחים מותאם סיכונים במחקר ופיתוח (R&D) של השתלות לב.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה&ד'
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של מנגנוני פגיעה המושרים על ידי שימור בתאי לב טבעיים.
- תומך בתיקוף תפקודי של יעדים עבור התערבויות שמטרתן להפחית תפקוד לקוי של הש移植.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי הבחנה בין תגובות שימור של החדר השמאלי לעומת הימני.
- מספק פלטפורמה חזקה לסריקה של חומרים מגני לב (cardioprotective agents) המונחית על ידי השערות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מדידה סטנדרטית וניתנת לשחזור של תפקוד החדרים לאחר שימור.
- מייצר פלטים כמותיים (dP/dt, יחסי לחץ-נפח) לצורך ניתוח השוואתי.
- מאפשר סריקה בקנה מידה רחב של פרוטוקולי שימור ותרכובות מועמדות במודלים של עכברים טרנסגניים.
- תומך במוכנות הבדיקה לצורך תיקוף (validation) במراحل הבאות של תהליכי העברה (transplantation workflows).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה של תפקוד לקוי ראשוני של הש transplanted graft (primary graft dysfunction) לצורך רצף תרגומי.
- מגשר בין ממצאים משלב הגילוי לאימות פרה-קליני באמצעות מדדי קצה תפקודיים של הלב.
- מנחה קידום מותאם-סיכון של אסטרטגיות שימור ומועמדים טיפוליים.
- תומך בפיתוח סמנים ביולוגיים על ידי קורלציה בין קריאות תפקודיות לחתימות מולקולריות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
מודל Langendorff ex vivo זה מציב את הערכת השמירה על הלב בממשק שבין גילוי מוקדם, זיהוי מולקולות מובילות (lead identification) ותיקוף פרה-קליני במחקר השתלה.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי מנגנוני פגיעה בשמירה ותוצאות תפקודיות.
- סריקה: מספקת נתונים כמותיים הניתנים לשחזור על תפקוד החדרים לצורך הערכת פרוטוקולים ותרכובות.
- אנליטיקה: תומכת בהשוואה סטטיסטית של משכי שמירה והשפעות טיפול באמצעות מדדי dP/dt ולחץ.
- מחקר תרגומי: מקלה על הרצף מגילוי מנגנונים למודלים פרה-קליניים של השתלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה לשימוש חוזר לצורך סריקה ותיקוף איטרטיביים על רקעים גנטיים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באסטרטגיות שימור ובתיקוף מטרות לתפקוד השתל.
- ערך תפעולי: מנרמל את ההערכה התפקודית, ובכך מאפשר הדירות ויכולת הרחבה במחקרי פרה-קליניקה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטאות לגבי המשך או הפסקת התערבויות מועמדות, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם-סיכון של פרוטוקולי שימור ומובילים טיפוליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד לב עכברי ובטכניקות של פרפוזיה ex vivo.
- מחייב מכשור מדויק למדידת לחץ ורכישת נתונים.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי שימור ופרפוזיה.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של עכברים טרנסגניים לצורך מחקרים מכניסטיים.
- תלוי באיכות פרפוזיה עקבית ובכיול להשגת נתונים מהימנים.
