Name: במבחנה מבחני ביקוע באמצעות מפלי דרוזופילה רקומביננטיים מטוהרים לבדיקת מצעים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: למדו פרוטוקול לטיהור קספאזות רקומביננטיות מדרוזופילה ומבחני ביקוע בתוך מבחנה לזיהוי מצעים פוטנציאליים עבור Dronc. שיטה זו מאפשרת סינון בקיבול גבוה של מצעים לקספאזות בתאי חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד"ר אליף קמבר-קאיה על עזרתה בגיבוש הפרוטוקול במעבדה. ד"ר גיא סלבסן סיפק בחביבות את המוטציהDrice C211A 9. עבודה זו מומנה על ידי פרס MIRA מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת מענק מספר 2R35GM118330. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על פרסומו או בהכנת כתב היד.

1. ביטוי קספאז רקומביננטי בחיידקים
<ol><li>שכפלו את הגן המעניין (Caspase או substrate putative) לווקטור ביטוי חיידקי עם תגי N- ו/או C-terminal באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים23. הערה: תגים יכולים להגדיל את המסיסות של החלבונים הרקומביננטיים ומשמשים לטיהור החלבונים הרקומביננטיים. כאן, Dronc, Drice, והמוטציות הקטליטיות שלהם משוכפלות לתוך הווקטור pET28a, המספק תג N-terminal 6xHis (pET28a-6xHis-Dronc wt, pET28a-6xHis-Dronc C318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-DriceC211A); (למידע ראשוני ראו טבלה משלימה 1).</li>
	<li>הפוך את הווקטורים עם הגנים המעניינים לתאי BL21 (DE3) pLysS E. coli מוסמכים באמצעות נהלים סטנדרטיים23,24. צלחת את תערובת הטרנספורמציה על צלחות אגר LB עם אנטיביוטיקה מתאימה (kanamycin במקרה של pET28a) כדי לבחור חיידקים מותמרים. (עיין בטבלה משלימה 2.)</li>
	<li>בחרו מושבה מהצלחת וחסנו ב-5 מ"ל של מדיום LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה כדי לגדול בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-220 סל"ד על פלטפורמת טלטול.</li>
	<li>למחרת, הכינו 30-50 מ"ל (לכל דגימה) של מדיום LB עם אנטיביוטיקה והוסיפו 1 מ"ל מהתרבית שגדלה בן לילה. הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600) באמצעות ביו-פוטומטר/ספקטרופוטומטר צריכה להיות בין 0.1 ל-0.2.</li>
	<li>הגדל את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס ב-220 סל"ד על פלטפורמת רעידות עד ש-OD600 יגיע ל-0.6. בדוק את OD600 כל שעה עד שהוא מגיע 0.6. זה לוקח בערך 2 עד 3 שעות.</li>
	<li>כדי לגרום לביטוי חלבון (caspase), הוסף IPTG לריכוז סופי של 0.1-0.2 mM (יש לדלל 1:1,000-1:500 ממלאי IPTG, ראה טבלה משלימה 2).</li>
	<li>הגדל את התרביות במשך 3 שעות ב-30°C ב-220 סל"ד. הערה: הזמן והטמפרטורה תלויים בסוג החלבון המתבטא ובמסיסותו. ייתכן שיהיה צורך להתאים תנאים אלה אם באים לידי ביטוי קספאזות או מצעים שונים.</li>
	<li>לאחר 3 שעות, סובב את התרביות בצינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ב-2,000 x גרם. השליכו את הסופר-נטנט והמשיכו עם הכדור. הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול בשלב זה ולהמשיך מאוחר יותר. כדוריות חיידקים ניתן להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. מיצוי קספאזות רקומביננטיות בקנה מידה קטן
<ol><li>הסר את הצינורות הקפואים עם תרביות הכדורים מאחסון של -80 מעלות צלזיוס ושמור אותם על קרח למשך 10 דקות כדי לרכך את הכדור.</li>
	<li>לאחר 10 דקות, הוסיפו 0.6 מ"ל של חיץ תזה של תאי חיידקים (טבלה משלימה 2) בתוספת מעכבי פרוטאז טריים שנוספו, 10 מ"ג/מ"ל של ליזוזים ו-50 U/mL של בנזונאז לתוך הצינורות המכילים גלולות באמצעות בקר פיפטה עם פיפטה סרולוגית של 1 מ"ל.</li>
	<li>בעזרת אותו קצה פיפטה, ממיסים את הכדור על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עד שנראית תמיסה צלולה-צהובה-בהירה ללא חלקיקי גלולה. דגירה במשך 30 דקות על קרח.</li>
	<li>מעבירים את הליזאט לצינורות צנטריפוגה מתאימים ואת הצנטריפוגה בליזאטים ב-17,000 x גרם למשך 40 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>העבירו את הסופרנאטנטים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. זוהי התמצית הגולמית המכילה את הקספאזות.</li>
	<li>שמור את הצינורות על הקרח והמשך לטיהור עם Ni-NTA agarose.</li>
</ol>3. טיהור קספאזות מתויגות בקנה מידה קטן
<ol><li>הוסיפו 0.2 מ"ל מתוך 50% ה-50% של אגרוז Ni-NTA לכל שפופרת של תמציות הקספאז משלב 2.5. סובב את הצינורות על סיבוב מקצה לקצה במשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר 1 שעות, להוסיף את התמצית עם Ni-NTA agarose ל 1 מ"ל פוליפרופילן עמודים עם קצה שלם, ממוקם במתלה. תן לזה לעמוד במשך 5 דקות.</li>
	<li>לאחר 5 דקות, הסר את מכסה העמודים ותן לסופר-נאטנט לזרום החוצה על ידי זרימת כוח הכבידה.</li>
	<li>הוסיפו בזהירות 1 מ"ל ממאגר הכביסה (טבלה משלימה 2) לעמודים מבלי להפריע לשרף הארוז הארוז של Ni-NTA ושטפו אותו בזרימת הכבידה.</li>
	<li>בצעו את שלב הכביסה שלוש פעמים.</li>
	<li>עבור elution של caspases, למקם 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge מתחת לזרבובית איסוף של העמודים לאחר ניקוז מלא של חיץ לשטוף.</li>
	<li>יש להוסיף 0.5 מ"ל של חיץ האלוציה (בתוספת מעכבי פרוטאז 1x מיד לפני השימוש) לכל עמודה ולאסוף את האלואט בצינורות המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הערה: הצבע המטוהר העדין יהיה שקוף.</li>
	<li>שמור את האלואטים על הקרח ומדוד את ריכוז החלבונים על ידי מבחן ברדפורד25. אשר טוהר/הומוגניות של הקספאזות המטוהרות על ידי SDS-PAGE ואחריו כתם כחול של Coomassie26. הערה: התפוקה של תרבית LB של 50 מ"ל נעה בין 0.5 ל-1.5 מ"ג של חלבון קספאז. בהתחשב בכך 0.5 מ"ל של חיץ elution משמש elution, הריכוז נע בין 1 ל 3 מ"ג / מ"ל. חשוב להשתמש ב-caspase המטוהר eluates עבור מבחני ביקוע במבחנה באותו יום של תזה וטיהור, שכן תכשירי קספאזה אלה מאבדים פעילות במהלך הלילה.</li>
</ol>4. ביטוי של מצע הקספאזה הפוטטיבי במערכות ביטוי נטולות תאים
הערה: בפרוטוקול זה, Drice, המצע הטבעי של Dronc, מוכן הן על ידי ביטוי רקומביננטי ב- E. coli (ראה סעיף 3 לעיל) והן על ידי ביטוי ב- reticulocyte lysate ארנב (RRL), מערכת ביטוי ללא תאים של יונקים (סעיף זה, ראה להלן).
<ol><li>שכפלו את הגן של המצע הפוטטיבי לווקטור ביטוי המכיל מקדם T7, T3 או SP6 באמצעות פרוצדורות סטנדרטיות23. הערה: בפרוטוקול זה, DriceC211A משמש כמצע המודל ושוכפל לווקטור pT7CFE1-N-Myc, הנושא מקדם T7 לביטוי גנים ומתייג את מצע החלבון הפוטטיבי עם תג Myc מסוף N לזיהוי על ידי אימונובלוטציה.</li>
	<li>ב- RRL, מצעים מועמדים יכולים להיות מסונתזים באופן רדיואקטיבי או לא רדיואקטיבי.<ol><li>סינתזה לא רדיואקטיבית: בצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל, הוסף 25 μL של RRL, 2 μL של מאגר תגובה, 0.5 μL של תערובת חומצות אמינו - מינוס לאוצין (1 mM), 0.5 μL של תערובת חומצות אמינו - מינוס מתיונין (1 mM), 1 μL של מעכב ריבונוקלאז (40 U / μL), 2 μL של תבנית DNA (0.5 מיקרוגרם / μL), ו 1 μL של T7-RNA פולימראז. הוסיפו מים נטולי נוקלאז כדי להתאים את הנפח הסופי של התגובה ל-50 μL. ערבבו בעדינות את הרכיבים על ידי פיפטינג או ערבוב עם קצה הפיפטה, וסובבו מעט כלפי מטה. הערה: ליזאט RRL מכיל 100-200 מ"ג/מ"ל של החלבונים האנדוגניים. לתגובות תרגום חוץ-גופי , הוסף את ה-RRL בריכוז של 50% (כאן תגובת 25 μL/50 μL).</li>
		<li>סינתזה רדיואקטיבית: בצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל, הוסף 25 μL של ליזאט RRL, 2 μL של מאגר תגובה, 0.5 μL של תערובת חומצות אמינו-מינוס מתיונין (1 mM), 1 μL של מעכב ריבונוקלאז (40 U/μL), 2 μL של תבנית DNA (0.5 μg/μL), 2 μL של S35 שכותרתו מתיונין (1000 Ci/mmol ב-10 mCi/mL) ו-1 μL של T7-RNA פולימראז. הוסיפו מים נטולי נוקלאז כדי להתאים את הנפח הסופי של התגובה ל-50 μL. ערבבו בעדינות את הרכיבים על ידי פיפטינג או ערבוב עם קצה הפיפטה, וסובבו מעט כלפי מטה. יש להשליך טיפים וצינורות במיכל פסולת רדיואקטיבי. הערה: אין להוסיף את תערובת חומצות האמינו ללא לאוצין. וקטור pT7CFE1 משתמש במקדם T7 לביטוי חלבונים. וקטורים אחרים משתמשים במקדמי T3 או SP6. במקרה כזה, יש להשתמש בפולימראזות T3 או SP6 RNA במקום T7 RNA פולימראז. אנא וודאו שתבנית הדנ"א היא בעלת טוהר גבוה.</li>
	</ol></li>
	<li>לדגור את התגובה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.</li>
	<li>סובבו לזמן קצר במשך 10 שניות והניחו את הצינורות על קרח. בדוק את רמת הביטוי של המצע הפוטטיבי ב- RRL על ידי SDS-PAGE ואימונובלוטינג / אוטורדיוגרפיה. הערה: כמות תמצית RRL שנוספה לתגובת המחשוף צריכה להתבסס על כמות החלבון שניתן לזהות בשיטת הגילוי (או אימונובלוטינג או אוטורדיוגרפיה S35 ). המשך לבדיקת המחשוף במבחנה (הקטע הבא) או אחסן אותה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>5. בדיקת מחשוף במבחנה עם מצעים שנוצרו עם RRL
<ol><li>קח את המצע(ים) הפוטטיביים שנוצרו, כמתואר בסעיף 4. בפרוטוקול זה, N-Myc-DriceC211A משמש כמצע מודל.</li>
	<li>בהתאם לרמת הביטוי של המצע הפוטטיבי (שייקבע בנפרד על ידי ניתוח אימונובלוט או אוטורדיוגרפיה, ראה שלב 4.4), השתמש ב- 1-10 μL של RRL המתוכנת עם החלבון המעניין בבדיקת המחשוף.</li>
	<li>הוסיפו 10 מיקרוגרם של חלבון קספאז מטוהר שנוצר בסעיפים 1, 2 ו-3.</li>
	<li>הבא את נפח התגובה הכולל ל-50 μL באמצעות מאגר בדיקת קספאז.</li>
	<li>לדגור את התגובות באמבט מים ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. הקפד לכלול את הפקדים המתאימים בבדיקת המחשוף. כאן, המוטציה הקטליטית DroncC318A משמשת כבקרה.</li>
	<li>לאחר 3 שעות, להפסיק את התגובות על ידי העברת צינורות על קרח.</li>
	<li>הוסף אמצעי אחסון אחד של מאגר דגימת LDS המכיל DTT של 50 mM. התגובה נעצרת לחלוטין עם תוספת של מאגר מדגם LDS.</li>
	<li>דגירה של הדגימות ב-75 מעלות צלזיוס בבלוק חום למשך 10 דקות.</li>
	<li>סובב במהירות, ערבב על ידי הבהוב, טען 24 μL לכל דגימה והפעל את ה- SDS-PAGE (ראה סעיף 7) או אחסן את הדגימות ב- -20 °C.</li>
</ol>6. בדיקת מחשוף במבחנה עם חלבון מצע רקומביננטי המתבטא באופן חיידקי
<ol><li>הוסף 10 מיקרוגרם של מצע מועמד מטוהר (כאן 6xHis-DriceC211A, שנוצר בסעיפים 1, 2 ו -3) לצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל.</li>
	<li>הוסיפו 10 מיקרוגרם של חלבוני הקספאז המטוהרים שנוצרו בסעיפים 1 ו-2. הבא את הנפח הכולל ל- 50 μL באמצעות מאגר בדיקת קספאז.</li>
	<li>בצע את שלבים 5.5 עד 5.9.</li>
</ol>7. SDS-PAGE ואימונובלוטינג
<ol><li>טען את תגובות המחשוף (24 μL) על 4%-12% טריס-גליצין או ביס-טריס ג'ל הדרגתי (טבלת חומרים) ובצע אלקטרופורזה של חלבונים ואימונובלוטינג (או אוטורדיוגרפיה אם משתמשים במצעים בעלי תוויתS 35) כדי להמחיש את התוצאות באמצעות נהלים סטנדרטיים27,28. הערה: כאן, בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בג'לים הדרגתיים של Bis-Tris עם מאגר פועל של Mops ומאגר טעינה של LDS. באופן כללי, פרוטוקולי PAGE הנפוצים של ג'ל Tris-Glycine פועלים באמצעות מאגר הריצה Tris-Glycine-SDS ומאגר טעינת ה-SDS פועלים היטב.</li>
</ol>

<ol><li>Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+function+in+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspase function in programmed cell death.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (1), 32-43 (2007).</li>
<li>Hawkins, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+DRONC+cleaves+following+glutamate+or+aspartate+and+is+regulated+by+DIAP1%2C+HID%2C+and+GRIM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase DRONC cleaves following glutamate or aspartate and is regulated by DIAP1, HID, and GRIM.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 27084-27093 (2000).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+and+dATP-dependent+formation+of+Apaf-1%2Fcaspase-9+complex+initiates+an+apoptotic+protease+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade.</a> Cell. 91 (4), 479-489 (1997).</li>
<li>Meier, P., Silke, J., Leevers, S. J., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+DRONC+is+regulated+by+DIAP1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase DRONC is regulated by DIAP1.</a> EMBO Journal. 19 (4), 598-611 (2000).</li>
<li>Timmer, J. C., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspase substrates.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (1), 66-72 (2007).</li>
<li>Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+APAF-1.cytochrome+c+multimeric+complex+is+a+functional+apoptosome+that+activates+procaspase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11549-11556 (1999).</li>
<li>Zou, H., Henzel, W. J., Liu, X., Lutschg, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apaf-1%2C+a+human+protein+homologous+to+C.+elegans+CED-4%2C+participates+in+cytochrome+c-dependent+activation+of+caspase-3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3.</a> Cell. 90 (3), 405-413 (1997).</li>
<li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li>
<li>Snipas, S. J., Drag, M., Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+and+substrate+specificity+of+the+Drosophila+initiator+caspase+DRONC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism and substrate specificity of the Drosophila initiator caspase DRONC.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (5), 938-945 (2008).</li>
<li>Fraser, A. G., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Drosophila+melanogaster+ICE%2FCED-3-related+protease%2C+drICE%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a Drosophila melanogaster ICE/CED-3-related protease, drICE.</a> EMBO Journal. 16 (10), 2805-2813 (1997).</li>
<li>Denton, D., Mills, K., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+protocols+for+studying+cell+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods and protocols for studying cell death in Drosophila.</a> Methods in Enzymology. 446, 17-37 (2008).</li>
<li>Dorstyn, L., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+analysis+of+the+activation+of+the+Drosophila+caspase+DRONC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A biochemical analysis of the activation of the Drosophila caspase DRONC.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (3), 461-470 (2008).</li>
<li>Aram, L., Yacobi-Sharon, K., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDPs%3A+caspase-dependent+non-lethal+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">CDPs: caspase-dependent non-lethal cellular processes.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (8), 1307-1310 (2017).</li>
<li>Arama, E., Baena-Lopez, L. A., Fearnhead, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lethal+message+from+the+Holy+Land%3A+The+first+international+conference+on+nonapoptotic+roles+of+apoptotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Non-lethal message from the Holy Land: The first international conference on nonapoptotic roles of apoptotic proteins.</a> FEBS Journal. 288 (7), 2166-2183 (2021).</li>
<li>Baena-Lopez, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+about+the+caspase-dependent+functions+without+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">All about the caspase-dependent functions without cell death.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 77-78 (2018).</li>
<li>Florentin, A., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+levels+and+execution+efficiencies+determine+the+apoptotic+potential+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell.</a> Journal of Cell Biology. 196 (4), 513-527 (2012).</li>
<li>Amcheslavsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+localization+of+apoptotic+caspases+for+non-apoptotic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane localization of apoptotic caspases for non-apoptotic functions.</a> Developmental Cell. 45 (4), 450-464 (2018).</li>
<li>Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+membranes+non-apoptotic+compartments+for+apoptotic+caspases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Are membranes non-apoptotic compartments for apoptotic caspases.</a> Oncotarget. 9 (60), 31566-31567 (2018).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cascleave%3A+towards+more+accurate+prediction+of+caspase+substrate+cleavage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cascleave: towards more accurate prediction of caspase substrate cleavage sites.</a> Bioinformatics. 26 (6), 752-760 (2010).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cascleave+2.0%2C+a+new+approach+for+predicting+caspase+and+granzyme+cleavage+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cascleave 2.0, a new approach for predicting caspase and granzyme cleavage targets.</a> Bioinformatics. 30 (1), 71-80 (2014).</li>
<li>Kamber Kaya, H. E., Ditzel, M., Meier, P., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitory+mono-ubiquitylation+of+the+Drosophila+initiator+caspase+Dronc+functions+in+both+apoptotic+and+non-apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">An inhibitory mono-ubiquitylation of the Drosophila initiator caspase Dronc functions in both apoptotic and non-apoptotic pathways.</a> PLoS Genetics. 13 (2), 1006438(2017).</li>
<li>Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+preparation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Caspases: preparation and characterization.</a> Methods. 17 (4), 313-319 (1999).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%284th+edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition)</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue staining.</a> Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).</li>
<li>Hirano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Western blot analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 926, 87-97 (2012).</li>
<li>Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Western blot techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 1606, 133-139 (2017).</li>
<li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CASBAH%3A+a+searchable+database+of+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).</li>
<li>Fogarty, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+reactive+oxygen+species+drive+apoptosis-induced+proliferation+via+Drosophila+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular reactive oxygen species drive apoptosis-induced proliferation via Drosophila macrophages.</a> Current Biology. 26 (5), 575-584 (2016).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+interactions+between+Drosophila+caspases+and+the+proapoptotic+genes+rpr%2C+hid%2C+and+grim%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic interactions between Drosophila caspases and the proapoptotic genes rpr, hid, and grim.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (8), 2907-2914 (2000).</li>
<li>Edfors, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+validation+of+antibodies+for+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhanced validation of antibodies for research applications.</a> Nature Communications. 9 (1), 4130(2018).</li>
<li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proposal+for+validation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A proposal for validation of antibodies.</a> Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li>
<li>Brizzard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Epitope tagging.</a> Biotechniques. 44 (5), 693-695 (2008).</li>
<li>Kanuka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+cell+death+pathway+by+Dapaf-1%2C+a+Drosophila+Apaf-1%2FCED-4-related+caspase+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the cell death pathway by Dapaf-1, a Drosophila Apaf-1/CED-4-related caspase activator.</a> Molecular Cell. 4 (5), 757-769 (1999).</li>
<li>Rodriguez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dark+is+a+Drosophila+homologue+of+Apaf-1%2FCED-4+and+functions+in+an+evolutionarily+conserved+death+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dark is a Drosophila homologue of Apaf-1/CED-4 and functions in an evolutionarily conserved death pathway.</a> Nature Cell Biology. 1 (5), 272-279 (1999).</li>
<li>Zhou, L., Song, Z., Tittel, J., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAC-1%2C+a+Drosophila+homolog+of+APAF-1+and+CED-4+functions+in+developmental+and+radiation-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">HAC-1, a Drosophila homolog of APAF-1 and CED-4 functions in developmental and radiation-induced apoptosis.</a> Molecular Cell. 4 (5), 745-755 (1999).</li>
<li>Weghorst, F., Mirzakhanyan, Y., Hernandez, K. L., Gershon, P. D., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Apoptotic+caspase+activity+preferentially+targets+a+novel+consensus+sequence+associated+with+cytoskeletal+proteins+in+the+developing+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-Apoptotic caspase activity preferentially targets a novel consensus sequence associated with cytoskeletal proteins in the developing auditory brainstem.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844844(2022).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

עיקר הידע שלנו על קספאזות ותפקוד קספאז נגזר מעבודה אינטנסיבית באפופטוזיס בשלושת העשורים האחרונים. זה מבוסס היטב כי caspases יוזם לעבד באופן פרוטאוליטי אפקטים caspases, ומאות חלבונים זוהו כמו מצעי caspase effector במהלך אפופטוזיס 5,29. לעומת זאת, הרבה פחות ידוע על הפונקציה של caspases עבור תהליכים שאינם אפופטוטיים ואילו מצעים לא אפופטוטיים הם מעבדים. ניתן להעלות על הדעת כי היוזמים הם מקבלי ההחלטות המרכזיים כאן. במהלך אפופטוזיס, הם מפעילים קספאזות משפיעות הגורמות למוות תאי. עם זאת, כדי להפעיל תהליכים שאינם אפופטוטיים, הם עשויים להפעיל חלבונים שונים (מלבד קספאזות אפקטור), השולטים בתהליך הלא-אפופטוטי. פרוטוקול זה בודק חלבונים מועמדים כמצעים של היוזם קספאז דרונק בדרוזופילה 17,30.
המצעים שייבחנו בבדיקת הבקיעה יכולים להיות מיוצרים במערכת ביטוי ללא תאים של יונקים במבחנה כגון RRL או על ידי ביטוי רקומביננטי ב - E. coli. ישנם מספר יתרונות לביטוי במבחנה באמצעות RRL על פני ביטוי חיידקי. פרוטוקול הביטוי RRL הוא פשוט ומהיר, ומאפשר להכין מצעים רבים ושונים במקביל. במקרים רבים, תמצית RRL המכילה את החלבון המעניין יכולה להיות מאוחסנת ב -80 מעלות צלזיוס לפני השימוש בבדיקת המחשוף (אם כי יש לקבוע זאת בנפרד עבור כל מצע). ניתן לסמן את המצע הפוטטיבי עם S35-Met, המאפשר ניתוח קל על ידי אוטורדיוגרפיה לאחר SDS-PAGE. זה שימושי במיוחד, אם אין נוגדן ספציפי לסובסטרט זמין. לחלופין, אם אין צורך בתיוג S35-Met, ניתן לתייג את המצע הפוטטיבי באמצעות תגים נפוצים כגון תגי דגל, HA או Myc, המאפשרים זיהוי של ביקוע קספאז על ידי אימונובלוטציה.
יש להדגיש מאוד כי הצלחתו של פרוטוקול זה תלויה בטיהור זהיר ועקבי של חלבוני Dronc ו- Drice הרקומביננטיים. למרבה הצער, לא ניתן לאחסן את החלבונים האלה – אפילו לא לטווח קצר – לא במקרר ולא בהקפאה. הם מאבדים את הפעילות האנזימטית בן לילה בכל צורה מאוחסנת. לכן, הם צריכים להיות מוכנים טריים ביום של בדיקת המחשוף. ללא קשר לחלבונים המועמדים שנבדקים, DriceC211A תמיד צריך לשמש כבקרה חיובית כדי לאמת את הפעילות האנזימטית של תכשירDronc wt (ראו איור 2B,C). לחלופין, ניתן לבדוק את הפעילות של תכשירי Dronc ו- Drice גם על ידי ביקוע חוץ גופי של מצעי טטרפפטיד סינתטיים פלואורוגניים 2,9,31.
אם משתמשים בנוגדנים כדי לזהות את המצעים המועמדים, הם צריכים להיות מאומתים על ידי המשתמש32,33. זה חל גם על נוגדנים זמינים מסחרית המזהים תגי אפיטופ כגון דגל, HA, Myc או אחרים. איכות נוגדנים ירודה עלולה לטשטש תוצאות חשובות. תיוג אפיטופי כפול של מצעי המועמדים הן על מסוף N והן על C-terminus עם תגים שונים מומלץ גם34. אם מתרחש מחשוף, תיוג כפול עוזר להתחקות אחר שני מוצרי המחשוף ועשוי לעזור להבהיר אם הבקיעה מתרחשת באתר אחד או יותר.
בעוד פרוטוקול זה מאמת בקלות את המצע הביולוגי הידוע של Dronc, Drice, יש גם מגבלות. מגבלה אחת היא שמדובר בפרוטוקול במבחנה עם חלבונים רקומביננטיים. במבחנים אלה, הקספאזות נמצאות בריכוז גבוה באופן לא פיזיולוגי, מה שניכר מהתצפית שהן יכולות לעבד אוטומטית באופן ספונטני ב - E. coli. העיבוד האוטומטי הספונטני בדרך כלל אינו מתרחש בתנאים הפיזיולוגיים. ריכוז קספאז גבוה זה עלול לגרום לפעילות מופרכת וכתוצאה מכך לתוצאות חיוביות שגויות. ניתן לבטל תוצאות חיוביות כוזבות על ידי הורדת ריכוז הקספאזה בתגובת המחשוף במבחנה . יתר על כן, כפי שמתואר ביתר פירוט להלן, יש צורך בבדיקות נוספות כדי לאשר מצעים מקוריים ולמנוע תוצאות חיוביות כוזבות.
ייתכן שלקספאזות הרקומביננטיות אין את אותה הספציפיות שיש להן בסביבה התאית הרגילה שלהן in vivo. לדוגמה, ניתן לשנות את הפעילות של caspases על ידי שינויים לאחר תרגום. אלה אינם קיימים על החלבונים הרקומביננטיים. יתר על כן, in vivo, קספאזות יוזמות, כולל Dronc משולבות בקומפלקסים חלבוניים גדולים כמו האפופטוזום. בתנאים של פרוטוקול זה, היווצרות של apoptosome אינו מושגת. זה ידרוש ביטוי רקומביננטי של Drosophila Apaf-1 (aka Dark או Hac-1)35-37 שיש לו אתגרים משלו. לכן, במבחנה, Dronc לא יכול להיות את אותה ספציפיות שיש לו in vivo.
כמו כן, ניתן להעלות על הדעת כי Dronc משולב בקומפלקס חלבונים אחר עבור תהליכים שאינם אפופטוטיים. זה עשוי להעניק ספציפיות מחשוף שונה לדרונק, מה שיכול גם להסביר מדוע Dronc אינו גורם לאפופטוזיס בתנאים שאינם אפופטוטיים. בהקשר זה, CasCleave משתמש באתרי קונצנזוס המחשוף הידועים כדי לחזות מצעים קספאזיים חדשים. עם זאת, לא ידוע אם אותם אתרי קונצנזוס מחשוף משמשים גם לתהליכים שאינם אפופטוטיים. למעשה, לאחרונה, הוכח כי Caspase-3 משנה את אתר הקונצנזוס המועדף עליו במהלך תהליך לא אפופטוטי בגזע המוח השמיעתי המתפתח בעובר האפרוח38. באופן דומה, אם קספאזות יוזמות משולבות בקומפלקסים שונים של חלבונים, הן עשויות להיות בעלות ספציפיות שונה ולכן עשויות להיבקע ברצפי קונצנזוס שונים.
מגבלות אלה ממחישות כי אין די להסתמך אך ורק על מבחני המחשוף במבחנה המתוארים בפרוטוקול זה. יש להשתמש בגישות חלופיות כדי לאמת עוד יותר את התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול זה. באופן אידיאלי, יש להשתמש במבחני in vivo כדי לענות על השאלות הבאות: האם החלבון המועמד מעובד באופן פרוטאוליטי במהלך התהליך הלא-אפופטוטי in vivo? אם כן, האם אותו אתר מחשוף משמש in vivo ו - in vitro? מה התוצאה אם המחשוף נחסם על ידי מוטגנזה של אתר המחשוף? האם עיבוד המצע המועמד תלוי בקספסות, ואם כן, איזה מהם? מה תפקידם של שברי המחשוף בתהליך הלא-אפופטוטי? ניתן לטפל בשאלות אלה בקלות באורגניזמי המודל הגנטי כגון C. elegans ו - Drosophila באמצעות שיטות גנטיות וטרנסגניות סטנדרטיות.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה ועקבית לייצור קספאזות פעילות אנזימטית, במיוחד Drosophila caspases Dronc ו- Drice. המטרה הסופית של פרוטוקול זה היא לבחון אם Dronc יכול לבקע מצעים מועמדים במבחנה, שזוהו על ידי גישות גנטיות, ביוכימיות או ביואינפורמטיות. כפי שהוסבר בפסקה הקודמת, נדרשים מבחנים נוספים כדי לאמת חלבונים אלה כמצעי קספאז in vivo. בהתחשב במידת השימור של גנים קספאזיים על פני מטזואה, זה אמור להיות אפשרי להתאים את הפרוטוקול הזה לקספאזות גם מאורגניזמים אחרים.

מוות תאי מתוכנת או אפופטוזיס מבוצע על ידי קבוצה של פרוטאזות מוות תאי מיוחדות ביותר המכונות קספאזות (נבדק בהתייחסות1). Caspases הם פרוטאזות Cys המכילות שאריות Cys באתר הקטליטי. הם הגדירו אתרי ביקוע קונצנזוס ומצעי שסעים באופן פרוטאוליטי לאחר שאריות Asp (אם כי דווח גם כי Dronc Drosophila caspase נבקע לאחר שאריות גלו2). הם מחולקים ליוזם (הידוע גם בשם apical או במעלה הזרם) ו אפקטים (תליין או במורד הזרם) caspases. caspases יוזם להפעיל caspases משפיע. לדוגמה, ביונקים, היוזם caspase Caspase-9 מבקע ומפעיל את המשפיע caspase Caspase-33. באופן דומה, בדרוזופילה מלנוגסטר, ה-caspase-9-ortholog Dronc מבקע ומפעיל את ה-caspase-3-orortholog Drice 2,4. במהלך אפופטוזיס, קספאזות משפיעות מבקעות מאות מצעים המובילים למותו של התא5.
קספאזות מסונתזות כפרו-אנזימים לא פעילים (זימוגנים) בתא. בצורה זו, הם מכילים פרודומיין N-terminal, תת-יחידה גדולה עם Cys הקטליטי בחלק המרכזי של הפרואנזים, ותת-יחידה קטנה ב-C-terminus 1 (איור 1). מנגנון ההפעלה שונה בין היזם לבין האפקטים caspases. קספאזות יוזמות (Caspase-9, Dronc) דורשות דימריזציה להפעלה, המתרחשת על ידי שילוב בקומפלקס חלבונים גדול, המכונה אפופטוזום6. עבור ההשתלבות באפופטוזום, Caspase-9 ו-Dronc נושאים תחום הפעלה וגיוס של קספאז (CARD) בפרודומיין N-terminal (איור 1). הרכיב האפופטוזום Apaf-1 מכיל גם כרטיס ומגייס את Caspase-9 או Dronc באמצעות אינטראקציה של CARD/CARD לתוך האפופטוזום 3,6,7. בעוד ש-Caspase-9 ו-Dronc ניתנים לעיבוד פרוטאוליטי באפופטוזום, עיבוד זה אינו נדרש באופן מלא לפעילות אנזימטית 8,9.
לעומת זאת, קספאזות אפקטיביות (Caspase-3, Drice) אינן נושאות כרטיס בפרודומיין שלהן ואינן משולבות בקומפלקסים חלבוניים גדולים להפעלה1. הם תלויים בביקוע פרוטאוליטי על ידי Caspase-9 פעיל או Dronc1, בהתאמה. האפקט הפעיל caspase יוצר טטרמר המורכב משתי יחידות משנה גדולות ושתי תת-יחידות קטנות, ולכן מכיל שני אתרים קטליטיים (איור 1). חשוב לציין כי עבור פרוטוקול זה, ביטוי רקומביננטי של caspases ב- E. coli גורם לעיבוד אוטומטי והפעלה של caspases, כולל Drice 10 ו- Dronc 2,8,9,11,12, גם בהיעדר Apaf-1. עיבוד אוטומטי זה מאפשר לבצע בדיקות מחשוף במבחנה של מצעים מועמדים עם חלבון קספאז רקומביננטי.
קספאזות לא רק מעורבות באפופטוזיס, אלא גם יכולות להיות להן פונקציות לא-אפופטוטיות רבות, כולל התפשטות, התמיינות תאים, נדידת תאים, גיזום עצבי, חסינות מולדת ואחרים13,14,15. כיום לא ידוע כיצד תאים יכולים לשרוד למרות שהם מכילים קספאזות פעילות במהלך תהליכים שאינם אפופטוטיים. ייתכן שתאים אלה מפעילים קספאזות רק ברמות תת-קטלניות16 או שהם מפרקים קספאזות פעילות בתאים שאינם אפופטוטיים של התא כגון קרום הפלזמה17,18. לכן, זיהוי ואימות של מצעים שאינם אפופטוטיים לא רק יגלו כיצד קספאזות מתווכות תהליכים לא-אפופטוטיים, אלא גם עשויות לסייע בהבנת האופן שבו תאים יכולים לשרוד בנוכחות קספאזות פעילות.
ניתן לזהות חלבונים מועמדים כמצעי קספאז בשיטות גנטיות וביוכימיות. חלבונים מזוהים ניתן לבדוק את נוכחותם של אתרי ביקוע Dronc קונצנזוס. ניתן לעשות זאת על ידי בדיקה חזותית של רצף החלבונים או שימוש בכלים ביואינפורמטיים מקוונים מתוחכמים יותר כגון CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20. כלים אלה משתמשים באתרי ביקוע הקונצנזוס הידועים של קספאזות ושיקולים מבניים כדי לחזות מטרות חדשות של קספאזות. בעוד CasCleave משלב את המידע של מצעים מאומתים מ Caspases-1, -3, -6, -7, ו -8, זה עשוי בכל זאת להיות שימושי גם למטרות המתוארות כאן כמו caspases אלה ואת אתרי ביקוע קונצנזוס שלהם נשמרים היטב. עם זאת, מכיוון שאתר המחשוף של Dronc אינו מוגדר היטב (שני מחקרים זיהו שני אתרי ביקוע אופטימליים שונים, TATD/E2 ו-LALD9), המצעים המועמדים נבדקים גם לנוכחות של אתר ביקוע קספאזי אחר, כולל Drice.
כדי לאמת את המצעים החזויים של קספאזות, יש צורך במבחנים נוספים. אחד המבחנים האלה הוא ההדגמה לכך שקספאז נתון יכול למעשה לבקע את החלבון המועמד במבחנה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול נוח עבור מבחני מחשוף in vitro caspase. באמצעות פרוטוקול זה, מצעים מועמדים נבדקים עם Dronc כמו caspase. הם יכולים גם להיבדק כמצעים של Drice. למרות שפרוטוקול זה נכתב עבור Drosophila caspases Dronc ו- Drice, הוא יכול להיות מותאם גם עבור caspases מאורגניזמים אחרים.
מיצוי וטיהור של Dronc ו Drice יחד עם בדיקת מחשוף במבחנה חייב להתבצע באותו יום בשל אובדן פעילות קטליטית על ידי caspases אלה. פרוטוקול זה שונה והותאם מפרסומים קודמים 8,9,11,12,21,22. בפרוטוקול זה, ארבעה חלבוני קספאז שונים באים לידי ביטוי רקומביננטי בזן E. coli BL21 (DE3) pLysS. חלבונים אלה הם: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt, ו- 6xHis-DriceC211A. כל אחד מהחלבונים האלה מתויג עם 6 שאריות היסטידין (6xHis) ב-N-terminus לצורך טיהור. Dronc wt ו- Dricewt הם חלבונים מסוג בר ויכולים לעבד אוטומטית לתוך הקספאזה הפעילה עם ביטוי רקומביננטי. DroncC318A ו-DriceC211A מקודדים צורות מוטנטיות של Dronc ו-Drice שמשנות את שאריות Cys הקטליטיות לשאריות Ala. המבנים האלה אינם פעילים באופן קטליטי ואינם יכולים לעבד אותם באופן אוטומטי (ראו איור 2A). הם משמשים כבקרות בבדיקת המחשוף. מכיוון ש- DriceC211A אינו יכול לעבד באופן אוטומטי, הוא משמש גם כמצע המודל עבור Droncwt בבדיקת המחשוף במבחנה המתוארת כאן.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד His</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG, נוגדן מקושר HRP</td><td>איתות</td><td>תאי 7076P2</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Myc</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-40</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG, איתות תאי נוגדן מקושר HRP</td><td></td><td>7074P2</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה ספסלית</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014-5KU</td><td></td></tr><tr><td>ביופוטומטר</td><td>Eppendorf</td> <td># 6131</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) pLysS תאים מוכשרים</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>רוטור צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>JA-25.50</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc עם תוכנת תמונה</td><td>Bio-Rad</td><td>מכסה מנוע אוניברסלי II</td><td>להדמיית כימילומיניסקנס</td></tr><tr><td>מצע כימילומיניסקנס</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>34095</td><td>להדמיית כימילומיניסקנס</td></tr><tr><td>דרוזופילה שסוע ICE (drICE) (Asp230) טכנולוגיית</td><td>איתות תאי</td> נוגדנים <td>9478S</td><td></td></tr><tr><td>קובטות</td> <td>חד פעמיותפישר סיינטיפיק</td><td>14955128</td><td>משמש למדידת צמיחת חיידקים וריכוז חלבון</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610610</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות Erlenmeyer, 1000 מ"ל</td><td>Millipore sigma</td><td>CLS49801L</td><td>להכנת מדיה אגר LB וחיטוי</td></tr><tr><td>צלוחיות Erlenmeyer, 250 מ"ל</td><td>Millipore sigma</td><td>CLS4980250</td><td>לצמיחה ואינדוקציה של תרבית חיידקים.</td></tr><tr><td>אתילן-דיאמין-טטרה-חומצה אצטית (EDTA)</td> ערכת מיצוי ג'ל <td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>מיכל ג'ל מערכת SDS-PAGE Thermofisher</td><td>Scientific</td><td>STM1001</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז (100x)</td> <td>Thermofisher Scientific</td><td>87786</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>His-Drice-pET28a&nbsp;</td><td>מחקר זה</td><td>לא זמין</td><td>אצל המחברים</td></tr><tr><td>His-DriceC211A-pET28a&nbsp;</td><td>מחקר זה</td><td>לא זמין</td><td>אצל המחברים</td></tr><tr><td>His-Dronc-pET28a&nbsp;</td><td>מחקר זה</td><td>לא זמין</td><td>אצל המחברים</td></tr><tr><td>His-DroncC318A-pET28a&nbsp;</td><td>מחקר זה</td><td>N/A</td><td>זמין אצל המחברים</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-&szlig;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td> <td>Thermofisher Scientific</td><td>FERR0392</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller (אבקה)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>LB מרק, מילר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>ליזוזים</td><td>תרמופישר סיינטיפיק</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>חממת צלחות מיקרוביולוגית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11-690-650D</td><td>לצמיחת מושבה לאחר טרנספורמציה</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה, 0.5 מ"ל</td><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 22363611</td><td></td><td></td>אפנדורף</tr><tr><td>, 1.5 מ"ל</td><td>22363204 אפנדורף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת Midiprep</td><td>Qiagen</td><td>12243</td><td></td></tr><tr><td>מיני צינור מסובב</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-450-127</td><td>לערבוב חיידקים ליזטים וערכת Ni-NTA agarose</td></tr><tr><td>Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>בקר פיפטה ממונע</td><td>גילסון</td><td>F110120</td><td>לשימוש בפיפטות סרולוגיות</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP330-1</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4 עד 12%, ביס-טריס, 1.0 מ"מ, ג'ל חלבון מידי, 20 בארות</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>WG1402BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS מאגר דגימה (4x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS מאגר ריצה (20x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>חממת טלטול אורביטלית עם בקרת טמפרטורה</td><td>ניו ברונסוויק סיינטיפיק</td><td>C25 אינקובטור שייקר</td><td></td></tr><tr><td>Petridish 100 מ"מ x 15 מ"מ</td><td>פישר Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי ציפוי</td><td>Zymo מחקר</td><td>S1001</td><td>להפצת תרבות על לוחות AmpR / KanR</td></tr><tr><td>עמודי פוליפרופילן (1 מ"ל)</td> <td>Qiagen</td><td>34924</td><td>לטיהור חלבונים מתויגים</td></tr><tr><td>Precision Plus תקני חלבון</td><td>Bio-Rad</td> <td># 161-0374</td><td></td></tr><tr><td>תרכיז מגיב צבע לבדיקת חלבון</td><td>Bio-Rad</td> <td>#5000006</td><td></td></tr><tr><td>pT7CFE1-NMyc</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>88863</td><td>לשיבוט מצעים לביטוי RRL</td></tr><tr><td>קרום PVDF</td><td>Invitrogen</td><td>LC2007</td><td></td></tr><tr><td>14 מ"ל פוליפרופילן צינורות תחתונים עגולים</td><td>Fisher Scientific</td><td>352029</td><td>לגידול תרביות פלסמיד</td></tr><tr><td>QiaRack</td><td>Qiagen</td><td>19095</td><td>להחזקת עמודי פוליפרופילן במהלך הטיהור</td></tr><tr><td>צנטריפוגה בקירור במהירות גבוהה</td><td>בקמן קולטר</td><td>Avanti J-25</td><td></td></tr><tr><td>rRNasin מעכב ריבונוקלאז</td><td>Promega</td><td>N251A</td><td>לביטוי RRL</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בז סטריליים, 15 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בז סטריליים, 50 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S70903-250G</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל צנרת סרולוגית, תא סטרילי</td><td></td><td>229001B</td><td>לליזה של תאים חיידקיים בצינורות 50 מ"ל</td></tr><tr><td>TnT מצמד Reticulocyte ליזאט -T7</td><td>Promega</td><td>L4611</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Fisher Scientific</td><td>2340</td><td></td></tr><tr><td>קלטת העברה רטובה מערבית</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>STM2001</tr></tbody></table>

במבחנה מבחני ביקוע באמצעות מפלי דרוזופילה רקומביננטיים מטוהרים לבדיקת מצעים

In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening

קספזות הן פרוטאזות מוות תאי ספציפיות מאוד המעורבות בתהליכים אפופטוטיים ולא אפופטוטיים. בעוד שתפקידם של הקספאזות במהלך אפופטוזיס הוגדר היטב ומצעים פרוטאוליטיים אפופטוטיים רבים של קספאזות זוהו ואופיינו, תפקידן של הקספאזות לתהליכים שאינם אפופטוטיים אינו מובן היטב. בפרט, מעט מצעים לא אפופטוטיים של קספאזות זוהו עד כה. כאן, על מנת להקל על זיהוי ואפיון של מצעי קספאזה פוטנציאליים, מתואר פרוטוקול המאפשר בדיקה של מצעים מועמדים במבחני ביקוע קספאזה במבחנה . פרוטוקול זה כולל ייצור וטיהור של חלבוני קספאז רקומביננטיים, ייצור המצעים המועמדים באופן רקומביננטי או במערכת ביטוי נטולת תאים, ותגובת המחשוף במבחנה בפועל ואחריה SDS-PAGE ואימונובלוטציה. פרוטוקול זה מותאם לדרוזופילה קספאזות דרונק ודריס, אך ניתן להתאים אותו בקלות לקספאזות מאורגניזמים אחרים, כולל יונקים.

פרוטוקול זה מספק הוראות שלב אחר שלב להשראת חלבון הקספאזה ב- E. coli, טיהור של Drosophila caspases Dronc ו- Drice הרקומביננטי, סינתזה של מצעים מועמדים, ותגובת המחשוף במבחנה עם מצעים מועמדים (כאן DriceC211A) ו- caspase Dronc. המוטציה הקטליטית DriceC211A שימשה כמצע מודל בבדיקה זו מאחר שאין לה פעילות עיבוד אוטומטי (איור 2A) והיא נשארת באורך מלא עד שהיא נבקעת על-ידי Droncwt. DriceC211A צריך תמיד לשמש כבקרה חיובית כדי לאמת כי תכשירDronc wt יש פעילות אנזימטית.
איור 2A מספק דוגמה מייצגת לביטוי ולטיהור של קספאזות רקומביננטיות. ארבעה קספאזות רקומביננטיות שונות הושרו וטוהרו: 6xHis-Droncwt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt ו-6xHis-DriceC211A. הקספאזות המטוהרות נוהלו על ידי SDS-PAGE, שעברו אימונובלוטציה, והכתם נבדק עם נוגדן אנטי-His (מדולל 1:5,000; ואחריו IgG נגד עכבר, נוגדן המקושר ל-HRP (1:10,000)). ה-6xHis-Dronc הלא מעובד (proDronc) פועל במשקל מולקולרי יחסי (MWr) של 55 kDa (נתיב 2) ו-6xHis-Drice (proDrice) הלא מעובד הוא בעל MWr של 35 kDa (נתיב 4). עיבוד אוטומטי של הקספאזות נראה לעין על-ידי הופעתן של להקות של MWr קטנות יותר, אשר בשל נוכחותו של תג ה-His-ter ב-N-terminus מייצגות את יחידות המשנה הגדולות של הקספאזות (איור 1). במקרה של 6x-Dronc, ליחידת המשנה הגדולה ישMW r של 40 kDa (נתיב 1). יחידת המשנה הגדולה של 6x-Drice פועלת במהירות של 23 kDa (נתיב 3). המוטנטים הקטליטיים 6xHis-DroncC318A ו-6xHis-DriceC211A אינם מצליחים לעבור עיבוד אוטומטי וניתנים לזיהוי רק כחלבונים באורך מלא (נתיבים 2 ו-4).
תרשים 2B כדי להדגים כי לתכשיר 6xHis-Droncwt המיוצר באופן חיידקי ומטוהר יש פעילות אנזימטית, בוצעה בדיקת מחשוף במבחנה כמתואר בפרוטוקול זה. כבקרה שלילית, נעשה שימוש במוטציה הקטליטית 6xHis-DroncC318A. המצע היה N-Myc-DriceC211A שנוצר על ידי RRL, אשר מתויג עם תג Myc ב-N-terminus. לאחר תגובת המחשוף במבחנה, החלבונים הופרדו על ידי SDS-PAGE, חיסוניים והכתמים דוגרו עם נוגדן אנטי-Myc (מדולל 1:1,000) ואחריו IgG נגד עכבר, נוגדן המקושר ל-HRP (1:10,000)) כדי לזהות N-Myc-DriceC211A. ניתן להדגים ביקוע מוצלח ולכן פעילות אנזימטית של הקספאז על ידי הופעתו של לפחות פס אחד שלMW r קטן יותר בהשוואה לצורה המלאה והלא מעובדת של המצע. N-Myc-Drice C211A לא מעובד באורך מלא הוא בעל MWr של 40 kDa (נתיבים 2 ו-4), ואילו יחידת המשנה הגדולה של N-Myc-DriceC211A המעובד פועלת במהירות של 30 kDa (נתיב 3). נתיב 1 מייצג את ליזאט RRL לא מתוכנת (לא נוסף פלסמיד/תמליל). נתיב 2 מדגים ייצור במבחנה של DriceC211A על ידי ביטוי RRL. נתיב 3 מכיל את תגובת המחשוף במבחנה עם 6xHis-Droncwt. נתיב 4 מכיל את תגובת המחשוף במבחנה עם 6xHis-DroncC318A.
תרשים 2C תגובת ביקוע במבחנה המשתמשת הן בקספאז רקומביננטי והן במסוע מטוהר (6xHis-Droncwt ו-6x-His-DroncC318A) ובמצע (6xHis-DriceC211A) על פי פרוטוקול זה, נותחה על ידי SDS-PAGE ואימונובלוט. לצורך ניתוח תגובת הבקיעה, נעשה שימוש בנוגדן Drice נגד שסעים (מדולל 1:5,000; ואחריו IgG נגד ארנב, נוגדן המקושר ל-HRP (1:10,000)) באימונובלוט זה. הנוגדן Drice נגד שסעים מזהה את הניאו-אפיטופ שלו בתת-היחידה הגדולה (23 kDa) של 6xHis-DriceC211A רק לאחר עיבוד על ידי 6xHis-Droncwt (נתיב 1). המוטציה הקטליטית 6xHis-DroncC318A אינה מסוגלת לעבד את 6xHis-Drice C211A בבדיקה זו ובאורך מלא 6xHis-DriceC211A מופיע כפס קלוש לא מעובד של 35 kDa (נתיב 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64392/64392fig01.jpg"> איור 1: מבנה התחום של הקספאזות היוזמות Caspase-9 ו-Dronc ו-effector caspases Caspase-3 ו-Drice. CARD - תחום הפעלה וגיוס caspase; Cys - מיקום יחסי של שאריות ציסטאין קטליטי; L - יחידת משנה גדולה; S - יחידת משנה קטנה. המיקום של פרודומיינים N-terminal מצוין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/64392fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64392/64392fig02.jpg"> איור 2: תוצאות מייצגות. (A) ניתוח אימונובלוט של תכשירי רקומביננט מטוהרים 6xHis-Dronc ו-6xHis-Drice, עם נוגדן אנטי-היס. לא מעובד (proDronc ו- proDrice) ו 6xHis-Dronc ו- 6xHis-Drice מסומנים על ידי חצים. סמני MW מסומנים בצד שמאל. (B) ניתוח אימונובלוט של תגובת המחשוף במבחנה של N-Myc-Drice שנוצר על ידי RRL עם קספאזות 6xHis-Droncwt (נתיב 3) או 6x-His-DroncC318A (נתיב 4) נבדק עם נוגדן אנטי-Myc. תגובות RRL לא מתוכנתות ומתוכנתות (N-Myc-DriceC211A) נטענות ומופרדות בנתיבים 1 ו-2. לא מעובד (proDrice) ו N-Myc-Drice מפוצל מסומנים על ידי חצים. סמני MW מסומנים בצד שמאל. (C) ניתוח אימונובלוט של תגובת המחשוף במבחנה של רקומביננטי 6xHis-Drice C211A עם קספאזות 6xHis-Droncwt (נתיב 1) או 6x-His-DroncC318A (נתיב 2), נבדק עם נוגדן Drice נגד שקועים. אורך מלא (proDrice) ו 6xHis-DriceC211A קרוע מסומנים על ידי חצים. סמני MW מסומנים בצד שמאל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/64392fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
טבלה משלימה 1: טבלה זו מכילה פריימרים המשמשים לשיבוט בווקטור pET28a. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/Supplementary%20Table1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
טבלה משלימה 2: טבלה זו מכילה את הרכב המאגרים והמדיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/Supplementary%20Table2.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביטוי וטיהור של Drosophila caspases Dronc ו- Drice, והשימוש בהם במבחני מחשוף במבחנה .

Caspases are very specific cell death proteases that are involved in apoptotic and non-apoptotic processes. While the role of caspases during apoptosis ...

קספאזות הן פרוטאזות ציסטאין שמבקעות מצעים במהלך אפופטוזיס ותהליכים לא אפופטוטיים. פרוטוקול זה מתאר בדיקת ביקוע במבחנה לזיהוי מצעים פוטטיביים של היזם caspase Dronc מדרוזופילה. אם עוקבים אחריו בזהירות, פרוטוקול זה מספק הליך אמין לסינון תפוקה גבוהה של מצעים פוטטיביים של ה- caspase Dronc, או כל קספאזה אחרת.בעוד שפרוטוקול זה תוכנן עבור מבחני ביקוע במבחנה באמצעות Drosophila caspase Dronc, ניתן להתאים אותו בקלות לקספאזות מאורגניזמים אחרים, כולל יונקים. חשוב כי טיהור של caspases רקומביננטי ואת בדיקות מחשוף במבחנה מבוצעים באותו יום כי תכשירים caspase אלה לאבד פעילות אנזימטית במהירות. מי שתדגים את ההליך תהיה ד"ר פראתיבה יריקיפאטי, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי.כדי להתחיל, להסיר את הצינורות הקפואים עם תרביות גלולה מ מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון ולשמור אותם על קרח במשך 10 דקות כדי לרכך את הכדור. לאחר 10 דקות, הוסיפו 0.6 מיליליטר של חיץ תזה של תאי חיידקים בתוספת מעכבי פרוטאז טריים שנוספו, 10 מיליגרם למיליליטר של ליזוזים, ו-50 יחידות למיליליטר של בנזונאז, לתוך הכדור המכיל צינורות באמצעות בקר פיפטה עם פיפטה סרולוגית של מיליליטר אחד. עם אותו קצה פיפטה, ממיסים את הכדור על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עד שתמיסה צהובה בהירה וחיוורת, ללא חלקיקי כדוריות, נראית לעין ודוגרת במשך 30 דקות על קרח.להעביר lysates לתוך צינורות צנטריפוגה מתאים צנטריפוגה אותם ב 17, 000 G במשך 40 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופרנאטנטים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, שהוא התמצית הגולמית המכילה את הקספאזות, ושומרים את הצינורות על קרח. הוסף 0.2 מיליליטר של 50% slurry של חומצה Ni-nitriloacetic agarose לכל צינור של תמציות caspase, ולסובב את הצינורות על סיבוב מקצה לקצה במשך שעה אחת ב 4 מעלות צלזיוס.לאחר שעה אחת, מוסיפים את התמצית עם חומצה Ni-nitriloacetic agarose לעמודי פוליפרופילן מיליליטר אחד עם קצה שלם, ממוקם במתלה, ולתת לו לעמוד במשך חמש דקות כדי לאפשר חומצה Ni-nitriloacetic agarose לשקוע. לאחר חמש דקות, הסירו את מכסה העמודים, ותנו לסופר-נאטנט לזרום החוצה על ידי זרימת כוח הכבידה. לאחר מכן הוסיפו בזהירות מיליליטר אחד של חיץ הכביסה לעמודים מבלי להפריע לשרף הארוז של חומצה Ni-nitriloacetic, ושטפו אותו דרך זרימת הכבידה.עבור elution של caspases, למקם צינורות microcentrifuge 1.5 מיליליטר מתחת לזרבובית איסוף של העמודים, לאחר ניקוז מלא של חיץ לשטוף. לאחר מכן, הוסף 0.5 מיליליטר של חיץ elution לכל עמודה ולאסוף את eluant בצינורות microcentrifuge 1.5 מיליליטר. שמור את האלואנטים על הקרח ומדוד את ריכוז החלבונים על ידי בדיקת ברדפורד.בהתאם לרמת הביטוי של המצע putative, להשתמש 1 עד 10 microliters של ארנב reticulocyte lysate מתוכנת עם החלבון של עניין במבחן המחשוף ולשמור אותו על קרח. הוסיפו 10 מיקרוגרם של חלבון קספאז מטוהר שנוצר בעבר, והביאו את נפח התגובה הכולל ל-50 מיקרוליטרים עם מאגר בדיקת קספאז. לדגום את התגובות באמבט מים ב 30 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות, תוך הקפדה לכלול את הבקרות המתאימות בבדיקת המחשוף.לאחר שלוש שעות, עצרו את התגובות על ידי העברת הצינורות על קרח, והוסיפו נפח אחד של מאגר דגימת LDS המכיל 50 מילימולר DTT. לדגום את הדגימות ב 75 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 10 דקות. סובב במהירות, ערבב על ידי הבהוב, טען 24 מיקרוליטרים לדגימה והפעל את דף ה- SDS או אחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס.ארבעה קספאזות רקומביננטיות שונות הושרו, טוהרו ונותחו על ידי SDS-PAGE, חיסון, והכתם נבדק עם נוגדן אנטיהיסטידין. ה-6x-Histidine Dronc הלא מעובד פועל במשקל מולקולרי יחסי של 55 קילודלטון וה-6x-His DRICE הלא מעובד הוא בעל משקל מולקולרי של 35 קילו-דלטון. עיבוד אוטומטי של caspases גלוי על ידי המראה של להקות בעלות משקל מולקולרי קטן יותר.עבור Dronc שסוע, זוהי רצועה של 40 קילודלטון. עבור Drice שסוע, זוהי רצועה של 23 קילודלטון. לאחר תגובת המחשוף במבחנה, החלבונים הופרדו על ידי SDS-PAGE, אימונובלוט, והכתמים הודגמו עם נוגדן אנטי-Myc כדי לזהות Amino סופני Myc מתויג Drice C211A.התוצאות הראו כי לתכשיר ה-6x-histidine Dronc המיוצר באופן חיידקי ומטוהר יש פעילות אנזימטית. ניתן לראות זאת על ידי נוכחותה של הלהקה הקטנה יותר של Drice השסוע בהשוואה ל- proDrice המנוקד. תגובת המחשוף במבחנה המשתמשת הן בקספאז רקומביננטי והן במצע נותחה על ידי SDS-PAGE ואימונובלוט.לצורך ניתוח תגובת המחשוף, נעשה שימוש בנוגדן Drice נגד שסוע באימונובלוט זה. התוצאות הראו כי לתכשיר 6x-His Dronc המיוצר באופן חיידקי ומטוהר יש פעילות אנזימטית. ניתן לראות זאת על ידי נוכחותה של הלהקה הקטנה יותר של Drice השסוע בהשוואה ל- proDrice המדולד.יש לזכור כי קספאזות רקומביננטיות מאבדות פעילות אנזימטית במהירות. הם לא יכולים להיות מאוחסנים, אפילו לא במינוס 80 מעלות צלזיוס. מבחני המחשוף במבחנה צריכים להתבצע באותו היום.יש לאמת פגיעות חיוביות בבדיקת המחשוף במבחנה in vivo. זה יכול להיעשות בתאים או באורגניזמים מודל גנטי כגון Drosophila או C.elegans.

in-vitro-cleavage-assays-using-purified-recombinant-drosophila

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים פרוטוקול יעיל להפקת "פילה" ההכנות של עוברים תסיסנית של גנוטיפים מסוימים. פרוטוקול זה מאפשר ביצוע יעיל של מגוון רחב של מסכי גנטית. זה גם מאפשר הדמיה מצוינת של מבנים בעובר מאוחר.

Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

סרטון זה מתאר שיטת סינון לזיהוי זבובי דרוזופילה טרנסגניים, שהגנום שלהם שונה באמצעות CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 הוא כלי רב עוצמה לעריכת גנום שחולל מהפכה באופן שבו מדענים יכולים לתמרן את הגנום של אורגניזם. בפרוטוקול לדוגמה, נראה כיצד לזהות מוטציות שנוצרו על ידי קריספר, שבו החדרה של רצף טרנסאקטיבציה מחליפה את האקסון הראשון של הגן חסר הענף (bnl), ובכך יוצרת קו דרייבר ספציפי לגן bnl, bnl-LexA.

סינון שינויים גנומיים: שיטה לזיהוי מוטציות שנוצרו על ידי קריספר בדרוזופילה

מבוא של מולקולות קטנות לעובר דרוזופילה הפיתוח מציע פוטנציאל גדול לאפיון פעילות ביולוגית של תרכובות רומן, סמים ורעלים כמו גם לחיטוט מסלולים התפתחותיים בסיסיים. שיטות שתוארו במסמך זה מתארים את שלבים שלהתגבר על מחסומים טבעיים לגישה זו, המרחיב את התועלת של מודל עובר דרוזופילה.

שיטה של ​​permeabilization של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים למבחנים של מולקולה קטנה פעילות

כדי לזהות תאים בריאים בחיות כולה המכילות רמות נמוכות של פעילות caspase, את biosensor הרגישות הגבוהה המיועד CaspaseTracker נוצרה עבור תסיסנית. Caspase-תלוי בפעילות biosensor מזוהית בתאים בריאים האריך ימים ברחבי האיברים הפנימיים של בעלי חיים בוגרים שגדלו בתנאים אופטימיזציה בהיעדר גירויי מוות.

In vivo biosensor Tracks ללא אפופטוטיים caspase פעילות תסיסנית

Anastasis הוא מאתגר מבחינה טכנית כדי לזהות ויוו כי התאים יש להפוך תהליך מוות של תאים יכולים להראות מורפולוגית תאים בריאים נורמלי. כאן נתאר פרוטוקולים עבור זיהוי ומעקב אחר תאים עוברים anastasis בבעלי חיים באמצעות פיתח ויוו CaspaseTracker ביוסנסור המערכת שלנו.

גילוי Anastasis In Vivo מאת CaspaseTracker ביוסנסור

מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה פשוטה וזולה לאיסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם) והכנת תמציות חלבון שניתן להשתמש ביישומים proteomic במורד הזרם, כגון זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS ).

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

אנו כאן לתאר assay phagocytosis באמצעות תאים עובריים מפוזרים של תסיסנית . זה מאפשר לנו בקלות ובמדויק לכמת רמות phagocytosis vivo , וכדי לזהות מולקולות חדשות הנדרשות phagocytosis של תאים אפופטוטיים.

Assay Phagocytosis עבור תאים אפופטוטיים ב תסיסנית עוברים

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות גישה גנטית הקדמי למסך עבור מוטציות המציגות ניוון נוירוזוסופילה מלאנוגסטר. היא משלבת שיטת טיפוס, ניתוח היסטולוגיה, מיפוי גנים ורצפי דנ א בסופו של דבר לזהות גנים חדשניים הקשורים לתהליך של הגנה עצבית.

ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster

דרוזופילה הוא מודל ניסיוני נפוץ המתאים לסינון תרופות עם יישומים פוטנציאליים לטיפול בסרטן. כאן, אנו מתארים את השימוש של דרוזוהילה מגוונים העין פנוטיפים כשיטה להקרנה תרכובות קטנות מולקולה לקדם את היווצרות הטרוכרומטין.

שיטת הקרנה לזיהוי הטרוכרומטין-קידום תרופות באמצעות דרוזוהילה

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

למדו פרוטוקול לטיהור קספאזות רקומביננטיות מדרוזופילה ומבחני ביקוע בתוך מבחנה לזיהוי מצעים פוטנציאליים עבור Dronc. שיטה זו מאפשרת סינון בקיבול גבוה של מצעים לקספאזות בתאי חיים.

במבחנה מבחני ביקוע באמצעות מפלי דרוזופילה רקומביננטיים מטוהרים לבדיקת מצעים

גלה סרטונים נוספים