במבחנה בחירת מדכאי שעתוק מהונדסים להשתקה אפיגנטית ממוקדת

טכנולוגיית ההשתקה האפיגנטית שפיתחנו שייכת לזירה רחבה יותר של טכנולוגיות, שהן טכנולוגיות להשתקת גנים. לפני שהתחלנו לפתח את הצורך בהשתקה אפיגנטית היו שתי חלופות רבות בתחום. האחד הוא הרס גנים על ידי התערבות RNA, והשני היה שיבוש גנים על ידי נוקלאזות מלאכותיות.

ושיבוש הגנים על ידי נוקלאזות מלאכותיות פועל ברמת הדנ"א. אז יש לך את גן המטרה שלך שאתה רוצה להשבית, ואתה מעביר לתא כמה נוקלאזות מלאכותיות, אשר גורמות לשבירת חוט כפול. סוג זה של שבירת מחרוזת כפולה עשוי לבצע את הסכום הניווני, מוטציית הסטת מסגרת, שלבסוף כופה או ניוון של חלבון לא פונקציונלי, או השפלה בו זמנית של שעתוק.

אז השתקה אפיגנטית עובדת על ידי העברת התא, מה שנקרא מדכאי שעתוק מהונדסים. אלה הם כמה חלבונים קטנים שמסוגלים להיקשר לדנ"א המטרה שלך, ואז להטיל רק על גן המטרה שלך, מה שנקרא מרקס אפיגנטי. אלה הם כמה שינויים כימיים, כי ברגע שהופקד על הדנ"א, יכול להוביל דחיסת כרומטין.

דחיסת הכרומטין מובילה לעיכוב שעתוק, כך שאין לך יותר את הביטוי של גן המטרה שלך. וחשוב מאוד, סוג זה של מצב דיכוי שעתוק יכול להיות מאוחד לאורך זמן על ידי התאים. כדי לזהות קווי תאים המבטאים את גן המטרה שיש להשתיק, עיין בגן המטרה באטלס החלבונים האנושי, ונווט דרך אזור קו התא כדי לזהות קווי תאים המייצגים את הרקמה הסומטית המעניינת.

מתוך קווי התאים שזוהו, תעדף את אלה שעבורם קיימים פרוטוקולים יעילים להעברת גנים חולפים. לאחר מכן, פתח מציג גנים וזהה את האזור של גן המטרה כדי לשלב את קלטת ביטוי פלואורופור. לאחר מכן השתמש ב- CHOPCHOP כדי לזהות ולבחור GNRA, שיחתוך באזור היעד באינטרון הראשון של הגן Beta-2M.

לאחר מכן, עצבו תבנית תורם לאתר חיתוך GNRA, המורכבת מזרוע הומולוגיה שמאלית, קלטת ביטוי טרנסגנים חופשית של מקדם וזרוע הומולוגיה ימנית. ספק את מערכת הנוקלאז CRISPR Cas9 ואת תבנית התורם בתוך קו התאים K-562 באמצעות נוקלאופקציה, בהתאם להוראות היצרן. תרבית את תאי K-562 במשך 14 יום לפחות.

נטר את רמות הביטוי של כתב הפלואורסצנט לאורך זמן באמצעות ציטומטר זרימה. הפעל את ערוץ האתרין FICO כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של כתב tdTomato. עיין בגן המטרה בדפדפן הגנום של UCSC וחלץ את רצף הנוקלאוטידים של אזורים, שעשויים לווסת את פעילות השעתוק שלו, כגון איי CpG ואתרים מועשרים לאצטילציה H3K27.

הדבק את הרצפים שנבחרו בכלי המקוון CHOPCHOP, ובחר דיכוי כמטרת ה- GNRAs שיש לאחזר. CHOPCHOP יספק רשימה של GNRAs ממופים על הרצף הגנטי של עניין ורשומים על פי ניקוד, בהתחשב במספר התאמות מחוץ למטרה ואת החזוי על יעילות המטרה. בחר לפחות 10 GNRAs לכל רצף יעד.

נסו לבחור GNRAs המשתרעים על פני כל האזור כדי להיות משולבים ללא התאמה מלאה עם רצפים אינטרגניים אחרים ברחבי הגנום. לאחר הפיכת הפלסמידים המקודדים עבור ETRS בתאי E.coli בעלי כשירות כימית, סנן את המושבות לנוכחות פלסמיד נושא ETR על ידי הגבלת עיכול אנזים וריצוף Sanger. כדי לשכפל את ה-GNRAs בתוך עמוד השדרה phU6 GNRA, ראשית, צור אוליגוס באמצעות תוכנת תכנון ביולוגיה מולקולרית.

יש לצרף רצף של חמישה נוקלאוטידים במעלה הזרם של הפרוטו-ספייסר ולתייג אוליגו ארוך זה של 25 נוקלאוטידים. באופן דומה, יש לצרף רצף של חמישה נוקלאוטידים של המשלים ההפוך של הפרוטו-ספייסר וציטוזין במורד הזרם, כדי ליצור אוליגו ארוך של 25 נוקלאוטידים ולתייג אותו. מסונתז את האוליגוס הזה כאוליגוס DNA חד-גדילי ללא מלח המרחפים מחדש במים ב-100 מיקרו-טוחנים.

הוסיפו מיקרוליטר אחד מכל אוליגו לשני מיקרוליטרים של חיץ חישול ו-16 מיקרוליטר מים. בצע חישול אוליגו על ידי הנחת התמיסה ב thermocycler ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן מצננים בהדרגה ל-25 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות.

לדלל מיקרוליטר אחד של אוליגוס מחושל עם 99 מיקרוליטר של מים ללא נוקלאז. לאחר מכן יש למרוח מיקרוליטר אחד של דילול זה עם 50 ננוגרם של פלסמיד pU6 GNRA, שעוכל בעבר עם אנזים הגבלת Bsa1. טרנספורמציה של 20 מיקרוליטר של תאי E.coli מוכשרים כימית עם שני מיקרוליטרים של מוצר הקשירה.

בחר מושבות מרובות לייצור DNA פלסמיד ואשר שיבוט מוצלח של פרוטו ספייסר על ידי ריצוף סנגר. כדי לספק את ה-DTR מבוסס ה-GNRA וה-CRISPR dCas9 בקו תאי הכתב במערך, ראשית, הכינו שפופרות נפרדות המכילות 500 ננוגרם של כל אחד מהפלסמידים, והוסיפו 125 ננוגרם של פלסמידים שונים בקידוד GNRA לבדיקה. כלול תנאי נוקלאופקציה ללא GNRA ו- ETR כדגימה מטופלת מדומה.

הכינו לפחות שלושה עותקים טכניים משוכפלים לכל דגימה. גלולה חמש פעמים 10 לחמישית בטא-2M tdTomato K-562 תאים לכל צינור, ו nucleoffect אותם עם תערובת פלסמיד. השהה מחדש את התאים ב -200 מיקרוליטר של תרבית תאי יונקים RPMI 1640 שחוממה בעבר ומקם אותם באינקובטור.

השתמש בציטומטריית זרימה כדי למדוד את אחוז התאים המושתקים בנקודות זמן שונות לאחר מסירת ETR. השתמשו בתאים מסוג בר ללא רצף ציפוי פלורה 4. כדי להגדיר את סף התאים השליליים של המדווח.

השתמש בדגימה שטופלה בדמה כדי להגדיר את השער לתאים חיוביים של כתב. זהה את שלושת ה- GNRA המובילים במונחים של יעילות השתקה לטווח ארוך. השתמש בעובדות כדי לבחור את תת-האוכלוסיות השליליות של המדווח הנשמרות ביציבות בדגימות אלה.

כמו כן, בצע עובדות של הדגימות שטופלו בדמה תחת אותו טיפול כדי לאפשר השוואה נכונה בניתוחים הבאים. כתב פלואורסצנטי tdTomato שולב באינטרון הראשון של הגן האנושי בטא-2M על ידי CRISPR Cas9 מושרה טומולוגיה מכוונת תיקון. תאי K-562 חיוביים לכתב מופיעים במדגם שטופל לאחר האינטגרציה.

עם העברה ארעית של שילוב ETR משולש, יחד עם GNRAs, בוצע ניתוח ציטומטריית זרימה אורכית כדי להעריך את הביטוי של כתב הפלואורסצנט. שיא נצפה בדיכוי כתבים בניתוחים חריפים, אשר נספג מחדש באופן חלקי עקב דילול מיטוטי של פלסמידים מקודדי ETR לאורך זמן. שיקוע יעיל של מתילציה CpG על מוקד המטרה על ידי שילוב GNRA של ETR היה ניכר על ידי דיכוי קבוע של הכתב בחלק ניכר של תאים מטופלים.

GNRA שונים הראו יעילות השתקה משתנה לטווח ארוך. אחד השלבים המרכזיים ביותר בהשגת השתקת אפיגנום קבועה ויעילה הוא זיהוי של gRNA יחיד יעיל. כדי לעשות זאת כל סוג של יישום, צריך להתחיל עם זיהוי של רצפים מגיבים ביותר, כולל מקדם ותשובה בכל אתרים אחרים עבור רגולטורים תמלול.

לאחר זיהוי האזור שיכול להיות האזור המגיב והיעיל ביותר, כל אחד צריך לתכנן סוג אחר של בדיקת gRNA יחיד כפרט או שילוב של gRNA יחיד. אחד היישומים הברורים ביותר של עריכת אפיגנום הוא בוודאות התרגום הפרה-קליני בכל רווח של מוטציה תפקודית, שבו השתקת גן זה יכולה להיות שימושית לריפוי מחלות ספציפיות. לחלופין, עלינו לזכור בכל מקרה כי היכולת לשנות באופן ספציפי את הבקרה האפיגנטית של מקדם נתון יכולה להיות כלי שימושי במיוחד הן למדע קליני והן למדע תרגומי בסיסי.