Name: מניפולציה גנטית בתיווך פאגים של מחלת ליים ספירוכטה בורליה בורגדורפרי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: למדו שיטת שיבוש גנטי חלופית ל-Borrelia burgdorferi באמצעות פאג φBB-1. הפרוטוקול מאפשר העברת DNA ללא אלקטרופורציה, ומסייע בחקר מנגנוני המולקולריים של מחלת ליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר מבקש להודות לשאונה ריד, ד. סקוט סמואלס ופטריק סקור על הדיון המועיל שלהם ולווריון (פאם) צ'ונוואראוונג על עזרתם הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה למדעים ביו-רפואיים ומענקי מחקר מהפקולטה לכריסטיאן ה. אגרס מבית הספר למדעי הבריאות באוניברסיטת קוויניפיאק.

למחבר אין מה לחשוף.

השימוש בהתמרה יכול לייצג שיטה אחת להתגבר לפחות על חלק מהמחסומים הביולוגיים והטכניים הקשורים לאלקטרו-טרנספורמציה של B. burgdorferi 1,4,13,37. במערכות רבות, בקטריופאג' יכול להעביר דנ"א מארח (שאינו נבוא) בין תאי חיידקים על ידי התמרה כללית או מיוחדת של 22,23,24,49,50.<...

פיתוח כלים למניפולציה גנטית של החיידק הספירוכטלי Borrelia burgdorferi הוסיף ערך לאין שיעור להבנת טבעה של מחלת ליים 1,2,3,4. ל-B. burgdorferi יש גנום מורכב במיוחד המורכב מכרומוזום ליניארי קטן ופלסמידים ליניאריים ומעגליים 5,6. אובדן פלסמיד ספונטני, סידור מחדש תוך-גני (תנועה של גנים מפלסמיד אחד למשנהו בתוך אותו אורגניזם) והעברת גנים אופקית (HGT, תנועת הדנ"א בין שני אורגניזמים) הולידו כמות מסחררת של הטרוגניות גנטית בקרב B. burgdorferi (לדוגמה, ראו Schutzer et al.7). הגנוטיפים המתקבלים (או "זנים") הם כולם בני אותו המין, אך יש הבדלים גנטיים המשפיעים על יכולתם להעביר ולהדביק פונדקאים שונים שליונקים 8,9,10,11. בדו"ח זה, המונח "זן" ישמש להתייחסות ל- B. burgdorferi בעל רקע גנטי טבעי מסוים; המונח "שיבוט" ישמש להתייחסות לזן שעבר הנדסה גנטית למטרה מסוימת או כתוצאה ממניפולציה ניסיונית.
ארגז הכלים המולקולרי הזמין לשימוש ב- B. burgdorferi כולל סמנים הניתנים לבחירה, כתבי גנים, וקטורים של מעבורת, מוטגנזה טרנספוזונית, מקדמים אינדוקטיביים וסמנים הניתנים לבחירה נגדית (לסקירה, ראו Drektrah ו- Samuels12). השימוש היעיל במתודולוגיות אלה מחייב החדרה מלאכותית של דנ"א הטרולוגי (זר) לתוך זן עניין של B. burgdorferi. ב- B. burgdorferi, הכנסת דנ"א הטרולוגי מושגת כמעט אך ורק באמצעות אלקטרופורציה, שיטה המשתמשת בפולס של חשמל כדי להפוך קרום חיידקי לחדיר באופן זמני לפיסות דנ"א קטנות שהוכנסו למדיה1. רוב התאים (הנאמדים ב-≥99.5%) נהרגים על ידי הדופק, אך לתאים הנותרים יש תדירות גבוהה של שמירה על הדנ"א ההטרולוגי13. למרות שנחשב לאחת השיטות היעילות ביותר להחדרת דנ"א לחיידקים, תדירות האלקטרופורציה לתוך B. burgdorferi נמוכה מאוד (החל מטרנספורמציה אחת ב-5 × 104 עד 5 × 106 תאים)13. נראה כי המחסומים להשגת תדרים גבוהים יותר של טרנספורמציה הם טכניים וביולוגיים כאחד. מחסומים טכניים לאלקטרופורציה מוצלחת של B. burgdorferi כוללים הן את כמות הדנ"א (>10 מיקרוגרם) הדרושה והן את הדרישה של הספירוכטים להיות בדיוק בשלב הגדילה הנכון (אמצע יומן, בין 2 × 10 7 תאים·mL−1 ו-7× 107 תאים·mL−1) בעת הכנת תאים אלקטרו-מוכשרים12,13. עם זאת, מחסומים טכניים אלה עשויים להיות קלים יותר להתגבר מאשר על המחסומים הביולוגיים.
חוקרי מחלת ליים מכירים בכך שניתן לחלק את שיבוטי B. burgdorferi לשתי קטגוריות רחבות ביחס ליכולתם להיות מניפולציה גנטית13,14. מבודדים בעלי מעבר גבוה ומותאמים למעבדה משתנים לעתים קרובות בקלות, אך בדרך כלל איבדו את הפלסמידים החיוניים להדבקה, מתנהגים בצורה סוטה מבחינה פיזיולוגית, ואינם מסוגלים להדביק פונדקאי יונק או להתמיד בתוך וקטור קרציות12,13. בעוד ששיבוטים אלה היו שימושיים לניתוח הביולוגיה המולקולרית של הספירוצ'ט בתוך המעבדה, הם בעלי ערך מועט לחקר הספירוצ'ט בהקשר הביולוגי של המחזור האנזוטי. מבודדים זיהומיים בעלי מעבר נמוך, לעומת זאת, מתנהגים באופן פיזיולוגי המשקף מצב זיהומי ויכולים להשלים את מחזור ההדבקה אך בדרך כלל הם סרבנים להכנסת דנ"א הטרולוגי ולכן קשה לתמרן אותם למחקר12,13. הקושי בהתמרת מבודדים בעלי מעבר נמוך קשור לפחות לשני גורמים שונים: (1) מבודדים בעלי מעבר נמוך לעיתים קרובות מתגבשים זה לזה בחוזקה, במיוחד בתנאי הצפיפות הגבוהה הנדרשים לאלקטרופורציה, ובכך חוסמים תאים רבים מיישום מלא של המטען החשמלי או מגישה לדנ"א במדיה13,15; ו-(ii) B. burgdorferi מקודד לפחות שתי מערכות שונות לשינוי הגבלה (R-M) המועברות על ידי פלסמידים, שעלולות ללכת לאיבוד במבודדים בעלי מעבר גבוה14,16. מערכות R-M התפתחו כדי לאפשר לחיידקים לזהות ולחסל דנ"אזר 17. ואכן, מספר מחקרים ב- B. burgdorferi הראו כי יעילות הטרנספורמציה עולה כאשר מקור הדנ"א הוא B. burgdorferi ולא Escherichia coli13,16. למרבה הצער, רכישת הריכוז הגבוה הנדרש של דנ"א לאלקטרופורציה מ- B. burgdorferi היא אפשרות יקרה וגוזלת זמן. חשש פוטנציאלי נוסף בעת אלקטרופולציה ובחירה במבודדים בעלי מעבר נמוך הוא שנראה שהתהליך מעדיף טרנספורמטורים שאיבדו את הפלסמיד הקריטי הקשור לווירולנציה, lp2514,18,19; לפיכך, עצם הפעולה של מניפולציה גנטית של מבודדי B. burgdorferi במעבר נמוך באמצעות אלקטרופורציה עשויה לבחור עבור שיבוטים שאינם מתאימים לניתוח רלוונטי ביולוגית בתוך המחזור האנזואטי20. בהתחשב בבעיות אלה, מערכת שבה דנ"א הטרולוגי יכול לעבור אלקטרופורמציה לשיבוטים של B. burgdorferi בעלי מעבר גבוה ולאחר מכן להעביר אותם למבודדים זיהומיים בעלי מעבר נמוך בשיטה שאינה אלקטרופורציה יכולה להיות תוספת מבורכת לאוסף ההולך וגדל של כלים מולקולריים הזמינים לשימוש בספירוכטה של מחלת ליים.
בנוסף לטרנספורמציה (קליטת דנ"א עירום), ישנם שני מנגנונים נוספים שבאמצעותם חיידקים תופסים באופן קבוע דנ"א הטרולוגי: הצמדה, שהיא חילופי דנ"א בין חיידקים במגע פיזי ישיר זה עם זה, והתמרת, שהיא חילופי דנ"א בתיווך בקטריופאג'21. ואכן, היכולת של בקטריופאג' לתווך HGT שימשה ככלי ניסיוני לניתוח התהליכים המולקולריים בתוך מספר מערכות חיידקים22,23,24. B. burgdorferi אינו כשיר באופן טבעי לקליטת דנ"א עירום, ויש מעט ראיות לכך ש- B. burgdorferi מקודד את המנגנון הדרוש לקידום הצמדה מוצלחת. דוחות קודמים תיארו, עם זאת, זיהוי ואפיון ראשוני של φBB-1, בקטריופאג' ממוזג של B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 חבילות משפחה של פלסמידים של 30 קילובייט שנמצאו בתוך B. burgdorferi25; בני משפחה זו נקראו CP32S. בהתאם לתפקידו של φBB-1 בהשתתפות ב-HGT בקרב זני B. burgdorferi, סטיבנסון ואחרים דיווחו על cp32 זהה שנמצא בשני זנים עם cp32s שונים זה מזה, מה שמרמז על שיתוף לאחרונה של cp32 זה בין שני זנים אלה, ככל הנראה באמצעות התמרה29. יש גם עדויות לרקומבינציה משמעותית באמצעות HGT בקרב cp32s בגנום יציב יחסית 30,31,32,33. לבסוף, היכולת של φBB-1 לתמר גם cp32s וגם דנ"א וקטורי הטרולוגי בין תאים מאותו זן ובין תאים של שני זנים שונים הוכחה בעבר27,28. לאור ממצאים אלה, φBB-1 הוצע ככלי נוסף שיש לפתח לניתוח הביולוגיה המולקולרית של B. burgdorferi.
מטרת דו"ח זה היא לפרט שיטה לגרימה וטיהור של פאג φBB-1 מ- B. burgdorferi, כמו גם לספק פרוטוקול לביצוע בדיקת התמרה בין שיבוטים של B. burgdorferi ובחירה וסינון של מתמרים פוטנציאליים.

<table><tbody><tr><td>יחידות סינון 1 ליטר (PES, 0.22 ומיקרו; m גודל נקבוביות)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>S2GPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>צינור 12 מ"מ x 75 מ"מ (מכסה מיקום כפול) (פוליפרופילן)</td> <td>USA Scientific</td><td>1450-0810</td><td>מכיל 4 מ"ל עם נפח ריק נמוך (לאינדוקציה)</td></tr> <tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים (פוליפרופילן)</td> <td>USA Scientific</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)</td> <td>Millipore Sigma</td><td></td><td>זהירות: מסרטן פוטנציאלי; כבר לא זמין, לא בדקתי תחליף מוצע</td></tr><tr><td>5.75 אינץ' פסטר פיפטות (כותנה מחוברת / זכוכית בורוסיליקט / לא סטרילית)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-8A</td><td>אוטוקלאב לפני השימוש</td></tr><tr><td>בצינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"ל (פוליפרופילן)</td> <td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td></td><td></td><td></td>מוחלט</tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Dot Scientific inc.</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Neopeptone</td><td>Gibco</td><td>DF0119-17-9</td><td></td></tr><tr><td>Bacto TC Yeastolate</td><td>Gibco</td><td>255772</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (דרגת החלפת סרום)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>700-104P</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם (לביולוגיה מולקולרית)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td>זהירות: אורגני נדיף; יש להשתמש רק בקולטים אדים כימיים</td></tr><tr><td>CMRL-1066 w/o L-גלוטמין (אבקה)</td> <td>ארה"ב ביולוגי</td><td>C5900-01</td><td>תרבית תאים בדרגת</td></tr><tr><td>אריתרומיצין</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>Corp E57000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ריאגנט ג'נטמיצין</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז (דקסטרוז נטול מים)</td> <td>תרמו פישר מדעי</td><td>BP350-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>קנמיצין סולפט</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS (0.22 ומיקרו; גודל נקבוביות M)</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGSM33SS</td><td>לסינון אנטיביוטיקה לעיקור ותמיסות אחרות בנפח קטן</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP25312</td><td>זהירות: מסרטן פוטנציאלי; השתמש רק במכסה אדים כימי</td></tr><tr><td>N-acetyl-D-glucosamine</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>100068</td><td></td></tr><tr><td>אוליגונוקלאוטידים (פריימרים ל-PCR)</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OmniPrep (ערכת מיצוי גנומי כולל)</td><td>G Biosciences</td><td>786-136</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי (100 מ"מ ופעמים; 15 מ"מ)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירה פטרוף-האוסר</td><td>מדעי Hausser</td><td>HS-3900</td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser כיסוי תא ספירה זכוכית</td><td>Hausser Scientific</td><td>HS-5051</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול 8000 (PEG)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>סרום ארנב לא סטרילי עקבות המוליז צעירים (NRS)</td> <td>Pel-Freez Biologicals</td><td>31119-3</td><td>השבתת חום לפי הוראות היצרן</td></tr><tr><td>קובטות שקופות UV למחצה מיקרו</td><td>ארה"ב סיינטיפיק</td><td>9750-9150</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8674-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spectronic Genesys 5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin סולפט תמיסת</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6501-50G</td><td></td></tr><tr><td>טריסודיום ציטראט דיהידראט</td><td>Millipore Sigma</td><td>S1804-500G</td><td>נתרן ציטראט עבור BSK</td></tr></tbody></table>

מניפולציה גנטית בתיווך פאגים של מחלת ליים ספירוכטה בורליה בורגדורפרי

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

החדרת דנ"א זר לתוך הספירוכטה Borrelia burgdorferi הושגה כמעט אך ורק על ידי טרנספורמציה באמצעות אלקטרופורציה. לתהליך זה יש יעילות נמוכה יותר באופן ניכר במחלת ליים ספירוצ'ט בהשוואה לחיידקים גראם שליליים אחרים, המאופיינים טוב יותר. אחוזי ההצלחה של הטרנספורמציה תלויים מאוד בכך שיש כמויות מרוכזות של דנ"א באיכות גבוהה מרקעים ספציפיים וכפופים לשונות משמעותית מזן לזן. אמצעים חלופיים להחדרת דנ"א זר (כלומר, וקטורים של מעבורת, כתבים פלואורסצנטיים וסמני עמידות לאנטיביוטיקה) לתוך B. burgdorferi יכולים להיות תוספת חשובה לחימוש של כלים שימושיים למניפולציה גנטית של ספירוכט מחלת ליים. בקטריופאג' הוכר היטב כמנגנונים טבעיים לתנועת דנ"א בין חיידקים בתהליך שנקרא טרנסדוקציה. במחקר זה פותחה שיטה לשימוש בפאג' הבורליאלי φBB-1 הנמצא בכל מקום כדי להמיר דנ"א בין תאי B. burgdorferi מרקע גנטי זהה ושונה. הדנ"א המתמר כולל גם דנ"א בורליאלי וגם דנ"א הטרולוגי בצורה של וקטורים קטנים. הדגמה זו מציעה שימוש אפשרי בהתמרה בתיווך פאגים כהשלמה לאלקטרופורציה למניפולציה הגנטית של מחלת ליים ספירוכט. דו"ח זה מתאר שיטות לאינדוקציה וטיהור של פאג φBB-1 מ - B. burgdorferi, השימוש בפאג זה במבחני טרנסדוקציה, ובחירה וסינון של מתמרים פוטנציאליים.

השימוש בבקטריופאג' כדי להעביר דנ"א בין זנים של B. burgdorferi הניתנים לשינוי בקלות רבה יותר או שיבוטים שהם סרבנים לאלקטרו-טרנספורמציה מייצג כלי נוסף להמשך החקירה המולקולרית של הגורמים המשפיעים על מחלת ליים. ניתן לשנות את בדיקת ההתמרה המתוארת כאן לפי הצורך כדי להקל על תנועת הדנ"א בין כל שיבוט מעניין באמצעות אנטיביוטיקה אחת או שתיים לבחירת מתמרים פוטנציאליים. ההתמרות של דנ"א נבואי ושל וקטורים הטרולוגיים E. coli/B. burgdorferi בין שיבוט זן CA-11.2A בעל מעבר גבוה לבין שיבוט זן B31 בעל מעבר גבוה ושי...

היכולת של בקטריופאג' להעביר דנ"א בין תאי חיידקים הופכת אותם לכלים יעילים למניפולציה גנטית של החיידקים המארחים שלהם. מוצגת כאן מתודולוגיה לגרום, לשקם ולהשתמש ב-φBB-1, בקטריופאג' של בורליה בורגדורפרי, כדי להמיר דנ"א הטרולוגי בין זנים שונים של ספירוצ'טה של מחלת ליים.

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

פרוטוקול זה משמעותי משום שהוא מתאר כלי חשוב נוסף לניתוח הביולוגיה המולקולרית של סוכן מחלת ליים Borrelia burgdorferi. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי באמצעות התמרת פאגים, היא מספקת שיטה חלופית להחדרת DNA ב Borrelia burgdorferi ללא צורך ביישום של פולס חשמלי, כמו אלקטרופורציה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לספק תובנה נוספת על המנגנונים המולקולריים המשמשים את Borrelia burgdorferi כדי להתמיד במחזור האנזוטי שלה ובסופו של דבר לגרום למחלת ליים בבני אדם.כדי להתחיל, לחסן 150 מיקרוליטרים של שיבוט Borrelia burgdorferi המתאים לתוך 15 מיליליטר של BSK בצינורות צנטריפוגה חרוטית סטרילית סגורה היטב עבור פרוטוקול הטרנסדוקציה. לאחר מכן, השלימו את המדיום עם הריכוז המתאים של אנטיביוטיקה או שילוב של אנטיביוטיקה לבחירה ותחזוקה של דנ"א הטרולוגי בתוך שיבוט Borrelia burgdorferi ודגירה של הדגימה ב 33 מעלות צלזיוס. לאחר שהתרבות גדלה, צנטריפוגה את נפח התרבות המתאים ב 6, 000 G במשך 10 דקות.לאחר פירוק הסופרנטנט, יש להשעות את הכדור בארבעה מיליליטר ב-BSK טרי ולהעביר את הדגימה לצינור הסטרילי הקטן ביותר שקיים כדי להחזיק את הדגימה עם שטח ראש מינימלי. לאחר מכן, הוסיפו את הכמות המתאימה של חומר משרה לריכוז המומלץ בהתבסס על נפח תרבית של ארבעה מיליליטר כדי לגרום לייצור פאגים, כסו את הצינור בחוזקה וערבבו היטב. לדגום את הדגימה ב 33 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עד ארבע שעות.לאחר מכן, העבר את הדגימה לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. צנטריפוגה המדגם ב 6, 000 G במשך 10 דקות. לאחר decanting supernatant, להשעות את כדור התא ב 15 מיליליטר של BSK.השלימו את התרבית המוכנה עם ריכוז האנטיביוטיקה המתאים המתואר בכתב היד, תוך דגירה של הדגימה בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס למשך 72 עד 96 שעות. כדי להכין פתרונות למשקעי PEG, הכינו 500 מיליליטר של נתרן כלורי בעל חמישה טוחנות, 500 מיליליטר של 40% PEG, ו-100 מיליליטר של מדיום השעיה כמתואר בכתב היד. כדי לעקר, יש לקרר את התמיסה באופן אוטומטי, לקרר לפני השימוש ולאחסן את טמפרטורת החדר או ארבע מעלות צלזיוס.עבור משקעי PEG של פאג מהתורם Borrelia burgdorferi שיבוט, לאחר 72 עד 96 שעות של דגירה, צנטריפוגה את הדגימות ב 8, 000 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מפרקים את הסופר-נאטנט לתוך צינור חרוטי נקי של 50 מיליליטר ומשליכים את כדור התא. הוסיפו נתרן כלורי בעל חמש טוחנות לריכוז סופי של טוחנת אחת.לאחר ערבוב טוב, רוק בעדינות בטמפרטורת החדר במשך שעה. צנטריפוגה דגימות ב 8, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר פירוק הסופרנאטנט לתוך צינור חרוטי נקי של 50 מיליליטר כפי שהוכח קודם לכן, הוסיפו תמיסת 40%PEG-8000 לסופרנטנט לריכוז סופי של 10% ערבבו היטב והניחו על הקרח למשך יותר משעה, עד ללילה.צנטריפוגה לדגימות ב 8, 000 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס כפי שהוכח קודם לכן. השליכו את הסופר-נטנט והסירו כמה שיותר נוזלים עודפים מבלי לאבד כדור, המכיל את חלקיקי הפאגים. יש לתלות את הכדור בנפח מינימלי של מדיום התרחיף באמצעות מדיום התרחיף כדי לשטוף את דופן הבקבוק ולאסוף חלקיקי פאגים פוטנציאליים.טפלו בדגימת הפאגים המשוחזרת בנפח שווה של כלורופורם בהתבסס על נפח ההדחה. מערבבים היטב את הדגימה צנטריפוגה ב 8, 000 G במשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר את השכבה המימית לצינור נקי, תוך הימנעות מכל שכבות הממשק העבות.לאחר קביעת הנפח שהתאושש, לאחר הטיפול הראשון בכלורופורם, שוב לטפל בדגימה עם כמות של כלורופורם שווה ל 10% מנפח זה. העבירו את השכבה המימית לצינור נקי תוך הקפדה על הימנעות מהממשק או מהשכבות האורגניות. השתמש בפאג מיד או אחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הכנת תרבויות Borrelia burgdorferi שישמשו כמקבל במבחני התמרה כפי שהוכח קודם לכן, צנטריפוגה את נפח התרבות ב 6, 000 G במשך 10 דקות. דקנט את הסופר-נטנט והושיע את הכדור ב-14.5 מיליליטר של BSK טרי. הוסף פחות או שווה ל-500 מיקרוליטרים של דגימת פאג'ים משופעת PEG לתרבית השיבוט של המקבל.לאחר ערבוב טוב, לדגור ב 33 מעלות צלזיוס במשך 72 עד 96 שעות. בצע את בחירת המתמרים על ידי ציפוי פאזה מוצקה לאחר ערבוב עם פאג מזורז PEG כמתואר בכתב היד. בהתאם לרקע של השיבוט של הנמען, בדוק כי המושבות מופיעות בתוך agarose על לוחות הבחירה לאחר 10 עד 21 ימים של דגירה.בחרו לפחות 5 עד 10 מושבות שגדלות על הצלחת בנוכחות שתי האנטיביוטיקות באמצעות פיפטה בורוסיליקט 5.75 אינץ' מכותנה מעוקרת ולחסן אותן ל-1.5 מיליליטר של BSK עם האנטיביוטיקה המתאימה. הגברת ה-PCR של הגנים בוצעה ב-10 מהשיבוטים המקודדים עמידות לקנאמיצין וגנטמיצין. ניתן להגביר את גן העמידות לקנאמיצין מהתורם c1673 ומהטרנסדוקטים הפוטנציאליים, אך לא מהמקבל c1706.באופן דומה, ניתן להגביר את גן העמידות לגנטמיצין מהמקבל c1706 ומהמתמרים הפוטנציאליים אך לא מהתורם, המייצגים אירועי טרנסדוקציה. כדי להדגים כי קלטת ההתנגדות לקנאמיצין הותמרה על ידי 5BB1 מהתורם למקבל. הרקע של המתמרים נקבע באמצעות סמנים ספציפיים לזן.השיבוט c1673 והרקע CA-112A מקודדים אמפליקונים ספציפיים ארבע, חמש ושש, ואילו c1706, בעל רקע B31 בעל מעבר גבוה, לא. באופן דומה, המתמרים 1 ו-2 היו חסרים אמפליקונים ארבע, חמש ושש, מה שמוכיח כי לשיבוטים יש את הרקע c1706 ורכשו את גן העמידות לקנאמיצין מ-c1673. עבור משקעי PEG של פאגים, בצע את כל השלבים בזהירות כדי למקסם את תפוקת הפאגים ולטפל בפאג המחודש ביסודיות עם כלורופורם כדי להסיר כמה שיותר מזהמי PEG ותרבית מדיה לפני השימוש והאחסון של פאגים.לאחר שבדיקת ההתמרה בוצעה בהצלחה והמתמר אומת, שיבוטים אלה זמינים לענות על השאלות הדורשות בורליה בורגדורפרי מהונדסת גנטית. יש לקוות שפיתוח טכניקה זו יאפשר לחוקרים לבצע מניפולציות גנטיות בזני בורליה בורגדורפרי, שעבורם קשה כיום להכניס דנ"א באמצעות אלקטרופורציה.

phage-mediated-genetic-manipulation-lyme-disease-spirochete-borrelia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ליים מחלות מחקר מחקרים לעיתים קרובות דורשים דור של קרציות נגוע הפתוגן Borrelia burgdorferi, תהליך זה לוקח בדרך כלל מספר שבועות. כאן אנו מדגימים microinjection מבוססי זיהום סמן הליך זה יכול להתבצע תוך שעות ספורות. אנחנו גם להדגים שיטה immunofluorescence עבור בלוקליזציה באתרו של B. burgdorferi בתוך קרציות.

שיטות העברה מהירים לוקליזציה של פתוגנים מחלת ליים בתוך גוט טיק

מקור: Eggers, C. H. מניפולציה גנטית בתיווך פאג'ים של מחלת ליים Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את הכנת תרבית Borrelia burgdorferi מהונדסת גנטית עם DNA בקטריופאג'י רדום הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה. לאחר בחירת אנטיביוטיקה ודגירה, גורם כימי מעורר נזק ל-DNA, מה שמוביל לכריתה, שכפול והרכבה של נגיפים חדשים המכילים את גן העמידות. לאחר צנטריפוגה שנייה והשעיה מחדש, תאי החיידקים המכילים חלקיקים נגיפיים בוגרים מוכנים ליישומים במורד הזרם.

הכנה ואינדוקציה של תרביות Borrelia burgdorferi לייצור חלקיקים נגיפיים

Source: Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the isolation of borrelial phage particles from a Borrelia burgdorferi suspension using polyethylene glycol-mediated phase separation. The sample is centrifuged, treated with a salt solution, and a molecular crowding agent to precipitate phages. Chloroform extraction is done to remove debris and concentrate phage particles. The purified phage...

Phage Purification from Borrelia burgdorferi

מחלת ליים היא המחלה וקטור הנישא ביותר המדווח בדרך כלל בצפון אמריקה. הסוכן סיבתי, Borrelia burgdorferi הוא חיידק החיידק מועבר על ידי קרציות Ixodid. הילוכים וזיהוי של זיהום במודלים של בעלי חיים מותאם על ידי השימוש בהאכלה לתקתק, שאנו מתארים כאן.

האכלה של קרציות בבעלי חיים להילוכים וXenodiagnosis במחקר מחלת ליים

PCR מקוננת היא טכניקה רגיש, ספציפית, וברור כי ניתן להחיל על שנתות ש-DNA תמציות כדי לחקור Borrelia burgdorferi, סוכן סיבתי של מחלת ליים. הניסוי הראשוני של ה-PCR משתמשת תחל גנים ספציפיים כדי ליצור amplicons ארוכה, אשר לאחר מכן הופכים תבניות עבור ריאקציה עוקבות באמצעות תחל פנימי.

זיהוי החיידק מחלת ליים, Borrelia Burgdorferi, בשנתות באמצעות PCR מקוננים

מבחני שעתוק חוץ גופיים יכולים לפענח את מנגנוני ויסות השעתוק בבורליאלה בורגדורפרי. פרוטוקול זה מתאר את השלבים לטיהור B. burgdorferi RNA פולימראז וביצוע תגובות שעתוק חוץ גופי. גישות ניסיוניות המשתמשות במבחני שעתוק חוץ גופי דורשות טיהור ואחסון אמינים של RNA פולימראז פעיל.

רכיבים חיוניים של Borreliella (Borrelia) burgdorferi בדיקות תמלול חוץ גופי

תרבית חוץ גופית היא שיטת זיהוי ישירה לנוכחות חיידקים חיים. פרוטוקול זה מתאר שיטות לתרבית של מגוון סוגי Borrelia spirochetes, כולל אלה של Borrelia burgdorferi sensu lato complex, קדחת התקפית של מיני Borrelia ו- Borrelia miyamotoi.  מינים אלה הם חסונים וגדלים לאט, אך ניתן לתרבית אותם.

שיטות גידול של Spirochetes מ Borrelia burgdorferi Sensu Lato קומפלקס קדחת התקפית Borrelia

חוצה גנטי של טפילי מלריה מכרסם מבוצעות על ידי האכלה two טפילים שונים גנטית יתושים. הצאצאים רקומביננטי הם משובטים מהדם לאחר עכבר המאפשר יתושים לנשוך עכברים נגועים. סרט הווידאו הזה מראה איך לייצר צלבי הגנטי...

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

כאן אנו מדווחים שיטה לשימוש בסוג I וסוג...

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

אנו מתארים שיטה לביצוע ניתוח גנטי בכלמידיה מבוסס על mutagenesis הכימי וכל רצף הגנום. בנוסף, מערכת להמרת ה-DNA בתאים נגועים מתוארת שיכול לשמש למיפוי גנטי. שיטה זו יכולה להיות ישימה באופן נרחב למערכות חיידקים חסרות מערכות טרנספורמציה וכלים גנטיים מולקולריים.

גישות גנטיות בקדימה<em&gt; כלמידיה trachomatis</em

למדו שיטת שיבוש גנטי חלופית ל-Borrelia burgdorferi באמצעות פאג φBB-1. הפרוטוקול מאפשר העברת DNA ללא אלקטרופורציה, ומסייע בחקר מנגנוני המולקולריים של מחלת ליים.

מניפולציה גנטית בתיווך פאגים של מחלת ליים ספירוכטה בורליה בורגדורפרי

גלה סרטונים נוספים