Name: מיקרודיסקציה של עין המכרסם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: למדו פרוטוקול מיקרודיסקציה של עין מכרסם לחקר עיניים, הכולל אנוקלאציה עם קרום מצמיץ לשיפור אוריינטציה מרחבית ומזעור נזק לרקמות עדינות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ד"ר אלקננדה מישרה, המחלקה לביולוגיה של התא ואנטומיה אנושית, אוניברסיטת קליפורניה דייוויס, ארה"ב, הכשירה אותנו בשיטה זו במכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק הליבה שהתקבל מהמחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו למכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי. נ.ב. זכתה במלגת מחקר מטעם המחלקה לביוטכנולוגיה.

הליך זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בעלי חיים של המכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי. מספר האסמכתא הסידורי של האישור הוא IAEC#480/18. הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות הרגולציה של הוועדה לבקרה ופיקוח על ניסויים בבעלי חיים, משרד הדיג, גידול בעלי חיים וחלב, ממשלת הודו, בפיקוח וטרינר מקצועי ב-SAF, הביטוח הלאומי.
1. הכנה
<ol><li>להרחיב את העיניים מכרסם באמצעות טיפה של 0.8% tropicamide ו 5% phenylephrine פתרונות אופתלמיים בכל עין. הניחו את בעל החיים באזור חשוך למשך 30 דקות לפני ההליך. הערה: משכך כאבים אינו נדרש מכיוון שבעל החיים מורדם מיד לאחר השלמת 30 דקות. ההסתגלות הכהה והרחבת עיני החיה מאפשרות למתבונן לבדוק קרעים ונזקים בעין לפני ההליך. בנוסף, הרחבה היא יתרון בעת עבודה עם רקמת גלגל העין פיגמנט.</li>
	<li>המתת חסד את החיה על ידי מתן intraperitoneally מנה 5x של הרדמה. מינון טיפוסי הוא 200 μL של PBS המכיל 10 מ"ג קטמין ו 1 מ"ג של xylazine. הערה: המינון להמתת חסד של בעל החיים הוא קטמין במשקל גוף של 400-500 מ"ג/ק"ג וקסילזין במשקל גוף של 50 מ"ג/ק"ג הניתן תוך צפקית. עבור עכבר טיפוסי השוקל 20 גרם, המינון יהיה 200 μL של PBS המכיל 10 מ"ג קטמין (100 μL של תמיסת מלאי של 100 מ"ג / מ"ל קטמין) ו 1 מ"ג של xylazine (100 μL של תמיסת מלאי של 10 מ"ג / מ"ל xylazine).</li>
	<li>אשר את חוסר התגובה המוחלט לגירוי על ידי בחינת רפלקס הדוושה. היעדר פעימות לב ונשימה הם גם אינדיקטורים חשובים.</li>
	<li>הניחו את העכבר בשכיבה צידית כדי לאפשר גישה מלאה לעין.</li>
	<li>הכינו מלקחיים לתפירת קוליברי, מלקחיים מעוקלים, מיקרו-להב (גודל 15°, 3 מ"מ), מיקרו-מספריים קפיציים ומיקרו-מספריים קפיציים זוויתיים מוכנים להליך.</li>
</ol>2. חינוך עין העכבר יחד עם העפעף השלישי
<ol><li>הניחו את העכבר בשכיבה צידית כדי לאפשר גישה מלאה לעין. פתח את העפעפיים החיצוניים עם המלקחיים כדי לדמיין בצורה אופטימלית את העפעף השלישי. הערה: העפעף השלישי, הידוע גם בשם הממברנה הניקטיבית, ממוקם לכיוון הפינה העליונה של משיק האף (איור 1A).</li>
	<li>זהו את העפעף השלישי כבליטה שקופה מינורית עם גבול פיגמנטי (איור 1B).</li>
	<li>מניחים מלקחיים מעוקלים סביב גלגל העין, וצובטים כדי לשחרר את העין מחיבורים חיצוניים. זה ימזער דימום לתוך העין מן הרקמה שמסביב.</li>
	<li>החליפו את המלקחיים המעוקלים במיקרו-מספריים קפיציים, וחתכו סביב גלגל העין כשהעפעף השלישי מחובר אליו. השתמש חתכים רציפים קטנים כדי לשחרר את גלגל העין מן הרקמות שמסביב.</li>
	<li>הניחו מיקרו-מספריים קפיציים מעוקלים מתחת לגלגל העין כדי לשחרר את העין על ידי חיתוך עצב הראייה. ודא כי גלגל העין משוחרר לחלוטין מארובות העין.</li>
</ol>3. ניקוי הרקמה החיצונית
<ol><li>הניחו את העין המוחדרת מהעכבר המורדם בצלוחית פטרי עם חיץ מלח חוצץ פוספט (PBS) ב-pH 7.4, כאשר צלחת הפטרי מלאה כך שגלגל העין שקוע ב-PBS.</li>
	<li>לשתק את גלגל העין של העכבר עם העפעף השלישי המחובר ביד אחת באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>השהה את גלגל העין בתווך נוזלי כדי לאפשר טיפול יעיל יותר. חלק מהשרירים או הרקמות החוץ-עיניות יתחילו לצוף הרחק מגלגל העין. הסר אותם על ידי חיתוך אותם גלגל העין באמצעות מיקרו מספריים קפיץ.</li>
	<li>גזור והסר את עצב הראייה מבסיס גלגל העין באמצעות מיקרו-מספריים כדי לאפשר הפרדה טובה יותר של הרשתית לתכשירים שלמים. הערה: אין צורך להסיר את עצב הראייה עבור חתך רקמות.</li>
	<li>שטפו את גלגל העין עם PBS, והעבירו אותו לצינור של 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך שעתיים לפחות ב-4°C לצורך קיבוע רקמות. הערה: ניתן להשהות את ההליך בשלב זה על ידי השארת הרקמה ב- PFA למשך עד 12 שעות ב- 4 °C. עם זאת, עבור בידוד של תאים חיים, שלבי הקיבוע לא צריך להתבצע, ואת ההליך כולו צריך להתבצע ללא הפסקות.</li>
</ol>4. דיסקציה של העין המושמעת לקבלת המשקפיים הקדמיים והאחוריים
<ol><li>לאחר קיבוע PFA (אם אוספים תאים חיים, להמשיך ללא קיבוע של גלגל העין), להעביר את גלגל העין לתוך צלחת פטרי המכילה PBS, ומניחים אותו תחת מיקרוסקופ לנתח כדי לבצע את ההליך הבא.</li>
	<li>לשתק את גלגל העין על ידי החזקת העפעף השלישי בחוזקה עם מלקחיים תופרים קוליברי.</li>
	<li>בצע חתך קטן בלימבוס על ידי פירסינג באמצעות מיקרו-להב. הלימבוס הוא צומת הקרנית-סקלרלית. בצע את החתך רצוי מול העפעף השלישי, ובכך ליצור נקודת גישה עבור מיקרו מספריים קפיץ. הערה: שימוש במיקרו-להב בגודל 15° ו-3 מ"מ עשוי לספק שליטה טובה יותר על עומק חתך זה.</li>
	<li>לאחר מכן, באמצעות חתך זה כנקודת התחלה, עם זוג מספריים מיקרו, לבצע חתכים קטנים ורציפים לאורך היקף הלימבוס הקרנית-סקלרלית. ראשית, השלימו חצי עיגול של חתכים החל מנקודת החתך ועד לעפעף השלישי. לאחר מכן, להשלים את חצי עיגול החתכים הנותר בצד השני. לבסוף, בצע חתך סביב העפעף השלישי כדי להפריד את הגביע האחורי ואת הגביע הקדמי. הערה: בהתאם לעיני המעניין, ניתן להשאיר את הממברנה המניקה מחוברת לעין הקדמית או האחורית.</li>
	<li>הסר את העדשה מהגביע האחורי באמצעות מלקחיים כדי לקבל את הגביע האחורי המורכב משכבות הרשתית העצבית ואפיתל פיגמנט הרשתית (RPE). העדשה, הגביע האחורי והגביע הקדמי של העין מופרדים, אם כן. הערה: אם עובדים עם רקמות לא מקובעות, כעת ניתן לעכל אנזימטית את הגביעים הקדמיים והאחוריים כדי לקבל תרחיף חד תאי של הקרנית או הרשתית.</li>
	<li>לקיבוע הרקמות, להעביר כוסות אלה לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של 4% PFA במשך 12 שעות ב 4 ° C. הערה: לאחר הקיבוע, ניתן להטמיע את הרקמה בתווך מתאים, וניתן לבצע חתך קריו-חתך או פרפין כדי להשיג חתכי קרנית או רשתית.</li>
</ol>5. בידוד של הרשתית העצבית ושכבות RPE
<ol><li>הכניסו מחדש את הכוס האחורית לצלחת הפטרי המכילה חיץ PBS כדי להטביע את הרקמה.</li>
	<li>בדוק את נוכחותה של הרשתית העצבית. ניתן לדמיין זאת כשכבה אטומה על שכבת RPE פיגמנטית, המחוברת בהיקף ההיקפי של הכוס.</li>
	<li>החזיקו את העפעף השלישי במלקחיים כדי לשתק את הכוס האחורית, וקילפו את הרשתית העצבית החל מהפריפריה באמצעות זוג מלקחיים שני. הערה: תנועות עדינות וקלות מאוד של היד מומלצות מאוד על מנת לא לפגוע ברקמה. ביציאה של עצב הראייה, ניתן להחדיר את מספריים הקפיץ המעוקלים מתחת לרשתית העצבית, ולבצע חתך כדי לשחרר לחלוטין את השכבות אם הרשתית העצבית נשארת מחוברת כפי שמתואר באיור 3. לחלופין, שחררו או נתקו את הרשתית במשיכות עדינות באמצעות מברשת רכה. עם זאת, זה לא יהיה מתאים לעשות זאת אם איסוף הרשתית עבור היסטולוגיה. הערה: הרשתית העצבית ושכבת RPE פיגמנטית עם העפעף השלישי מתקבלים, אם כן.</li>
</ol>6. פילוח שכבות רשתית ו-RPE לסיטונים
<ol><li>הכניסו מחדש את הכוסות הקדמיות והאחוריות לצלחת הפטרי המכילה חיץ PBS, והניחו את הצלחת מתחת למיקרוסקופ המנתח.</li>
	<li>לשתק את הכוס הקדמית על ידי החזקת העפעף השלישי.</li>
	<li>השתמשו במיקרו-מספריים קפיציים זוויתיים כדי לבצע חתך של כ-3/4 מקוטר העין ליד העפעף השלישי, תוך חיתוך מהפריפריה בניצב לכיוון מרכז הראייה.</li>
	<li>שמרו על אחיזה בעפעף השלישי, ובצעו חתך ליד החתך הראשון.</li>
	<li>בצע חתך דומה בין החתך השני לעפעף השלישי. הערה: שלושה או ארבעה חתכים כאלה במרחקים שווים פותחים את הגביעים המיספריים לצורת פרח, אשר נופל שטוח וניתן להרכיב אותו בקלות.</li>
	<li>יש לשתק את הכוס האחורית על ידי החזקת העפעף השלישי.</li>
	<li>בצע את אותם השלבים שניתנו לביצוע החתכים (שלבים 6.3-6.5) על הכוס הקדמית כדי לבצע שלושה או ארבעה חתכים במרחקים שווים על הכוס האחורית. הערה: עבור ההיסטולוגיה של הרשתית העצבית המבודדת בשלב 5, בצע חתכים דומים כדי להבטיח שהיא תיפול שטוחה על משטח. אין לבצע חתכים עמוקים מאוד במרכז הכוס, שכן הדבר עלול לגרום לחלקי העלה להתפרק או להיפרד בקלות.</li>
	<li>בצע את הצביעה, ואת כל הרקמות עבור הדמיה יעילה 7,8. הערה: נוכחותו של הממברנה המניקה פועלת כאינדיקטור פיזי קבוע של צד האף של העין בשלמות. זה עוזר לתחום את הצד הגבי/גחוני של העין, שכן העפעף השלישי של העין מציין את כיוון האף/הגחון.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+%28PDXs%29+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li>
<li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576(2018).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997(2018).</li>
<li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563(2011).</li>
<li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li>
<li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546(2013).</li>
<li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+wholemount+technique%3A+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li>
<li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163(2012).</li>
<li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412(2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מיקרודיסקציה של העין נמצאה כמשימה קשה בשל גודלה הקטן וצורתה הכדורית של עין המכרסם, ועין המכרסם דורשת טכניקות חדשניות לטיפול יעיל8. 
בשיטה המודגמת הנוכחית, גלגל העין של העכבר מתקבל עם העפעף השלישי מחובר לטיפול יעיל וקל. באמצעות העפעף השלישי, גלגל העין יכול להיות משותק לחלוטין, אשר מאפשר את הדיסקציה להמשיך בקלות עם שגיאות מינימליות. יתר על כן, נוכחותו של העפעף השלישי תוחם את הכיוון של חלקי המשנה של העין. גלגל העין נחתך, אם כן, עם העפעף השלישי כדי לקבל את המשקפיים הקדמיים ...

דיסקציה עינית היא טכניקה חשובה במחקר העיניים ואפשרה לחוקרים לגשת למקטעי העין למחקרים ממוקדים. בעבר, חוקרי עיניים הסתמכו על רקמת העין של אנשים חולים עבור המחקרים שלהם. עם זאת, המספר ההולך וגדל של זנים של מודלים מכרסמים אופתלמיים1 לאורך השנים הפחית את הצורך ברקמת עין אנושית. זני עכברים אלה אפשרו הבנה עמוקה יותר של מחלות עיניים והתערבויות. עם זאת, הם גם יצרו צורך בטכניקות חדשניות של מיקרו-דיסקציה עינית. הגודל הקטן ושטח הפעולה המוגבל מגבילים מאוד את הגישה היעילה לחלקי העין. יתר על כן, בשל הרכבה תאית הומוגנית של המשקפיים האחוריים והקדמיים, קשה לבצע התערבויות ממוקדות לאחר דיסקציה. טכניקות המיקרו-דיסקציה הנוכחיות של לייזר2 ומיקרודיסקציה כירורגית 3,4 אינן מספקות בעמידה בדרישות כאלה של מחקר עיני. מיקרו-דיסקציה בלייזר יעילה מאוד באנליזה של תא בודד, אך יש לנתח את הרקמה הספציפית לפני הליך הלייזר2. הטכניקה יכולה לבודד אזורים קטנים של עניין מרקמה שנותחה מראש לצורך אנליזה מולקולרית. לפיכך, הטכניקה אינה מתאימה להכנת wholemounts או לבידוד של שכבות עיניים ארוזות אקסיאלית עבור הדמיה אופטימלית.
השיטה הכירורגית היא הטכניקה הנפוצה ביותר; שיטה זו כוללת השתקת העין דרך עצב הראייה5 ולאחר מכן ביצוע הדיסקציה. תרגול זה הוא מפרך ויכול לפגוע בכל רקמה שברירית, כמו העין הכדורית ממשיכה לנוע במהלך דיסקציה. למרות היותה מועילה לבידוד החלקים השונים של שכבות הרשתית, הטכניקה אינה יכולה לתחום את הכיוון המרחבי של הרקמה בעת הדיסקציה.
במהלך הדיסקציה, שמירה על נוכחות הממברנה המחוברת או העפעף השלישי (איור 1) מציגה יתרונות ייחודיים ומשמעותיים. בשיטה זו, ראשית, גלגל העין הוא enucleated עם העפעף השלישי. לאחר מכן, העפעף השלישי משמש לשיתוק העין6 (איור 2A). לאחר מכן חודרים את גלגל העין דרך לימבוס הקרנית ומשתמשים בחתך כנקודת הכניסה (איור 2B,C). לאחר מכן, המשקפיים מופרדים על-ידי חיתוך לאורך ההיקף הקדמי והאחורי (איור 2D-G). על ידי ניתוח נוסף של העין האחורית, ניתן לזהות את השכבה השקופה של הרשתית העצבית ולקלף אותה בעדינות. לאחר מכן שלושה או ארבעה חתכים במרחקים שווים בגביעים הקדמיים והאחוריים המתקבלים, אשר מאפשרים לגביעים בצורת פרח ליפול שטוחים על מגלשה (איור 2H).
העפעף השלישי מסייע לטיפול קל ויעיל במהלך הדיסקציה, ובכך מבטיח נזק מינימלי לרקמה בעת גישה לשכבות העין השונות ובעת ייצור שלמים. יתר על כן, נוכחותו של העפעף השלישי מסייעת לאתר ולבחון התערבויות מקומיות במהלך הדמיה.
ההליך, במעבדה שלנו, בוצע על CBA/J או זן עכבר rd1 ב P28 מכל מין. ההליך יכול להתבצע על כל זן, גיל או מין של בעל חיים ואין לו הטיה על פי מאפיינים אלה.
בעלי החיים נרכשו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים) ותוחזקו במתקן לחיות קטנות (SAF) במכון הלאומי לאימונולוגיה (NII). הם הוחזקו בכלובים מאווררים נפרדים (IVC) וקיבלו גישה אד ליביטום , למים ומזון חומציים. הם נשמרו ב 21-23 ° C ועם מחזור אור / חושך של 14 שעות / 10 שעות.
להלן שיטה כירורגית שונה למיקרו-דיסקציה של עין עכבר.

<table><tbody><tr><td>פרצטמול (ביוצטמול)</td><td>EG Pharmaceuticals</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr><tr><td>ערכת פוספטאז אלקליין (DEA)</td><td>מערכת קלינית אלמוגים, הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr><tr><td>מנתח אוטומטי</td><td>טוליפ, אלטו סנטרקרוז, הודו</td><td>מנתח ביוכימי Screen Maaster 3000</td><td>לבדיקת תפקודי כבד</td></tr><tr><td>בטדין ( תמיסת פובידון-יוד)</td><td>Win-Medicare; &nbsp; הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגי (Class I)</td><td>קרטוס בינלאומי; הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שדה בהיר</td><td>אולימפוס, יפן</td><td>LX51</td><td></td></tr><tr><td>CBA/J עכברים מולדים</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>מס' 000654</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxime (Taxim)</td><td>AlKem ; הזרקת</td><td>נתרן cefotaxime בהודו, ללא מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td>מסננת תאים סיגמא;<td></td></tr><tr><td></td><td> ארה"ב</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג I</td><td>Gibco מאת Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Buds</td><td>Pure Swabs Pvt Ltd ; הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr> <tr><td>DPX Mountant</td><td>Sigma ; ארה"ב</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>גיליון</td><td>וילונות JSD כירורגיות, דלהי, הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr> <tr><td>תמיסת Eosin Y, סיגמא אלכוהולית</td><td>; HT110132 ארה"ב</td><td></td> מלקחיים ניתוחים גדולים;<td></td></tr><tr><td></td><td> הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr><tr><td>מערכת הרדמת גז</td><td>Ugo Basile; איטליה</td><td>211000</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>היימדיה, הודו</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>קרם להסרת שיער (Veet)</td><td>רקיט בנקיזר, הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr><tr><td>תמיסת המטוקסילין,</td><td>סיגמא של מאייר; ארה"ב</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן הפרין</td><td>Himedia; הודו</td><td>RM554</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase מ-Sheep testes</td><td>Sigma ; ארה"ב</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>I.V. Cannula (Plusflon)</td><td>Mediplus, India</td><td>Ref 1732411420</td><td></td></tr><tr><td>מזרקי אינסולין</td><td>BD ; ארה"ב</td><td>REF 303060</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן (פוראן)</td><td>Asecia Queenborough</td><td>No B506</td><td>אינהלציה הרדמה</td></tr><tr><td>קטמין (קטמקס)</td><td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td><td></td><td>קטמין הידרוכלוריד IP, ללא מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr><tr><td>מלוקסיקם (מלונקס)</td><td>אינטס פרמצבטיקה בע"מ; הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr> <tr><td>מחזיקי מחט מיקרו ישרים ומעוקלים</td><td>מרסיאן; &nbsp; אנגליה</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>מחזיקי מחט מיקרו ישר & מרסיאן מעוקל</td><td>; &nbsp; אנגליה</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Histo-Line Laboratories, איטליה</td><td>MRS3500</td><td></td></tr><tr><td>חוט ניילון</td><td>Mighty ; הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>הימדיה; India</td><td>GRM 3660</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td><td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td><td>P3060</td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Himedia; הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr><tr><td>אזמל</td><td>כירורגיה גדולה; הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>ניתוחים גדולים; הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr> <tr><td>ערכת SGOT (ASAT)</td><td>מערכת קלינית אלמוגים, הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr> <tr><td>ערכת SGPT (ALAT)</td><td>מערכת קלינית אלמוגים, הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr> <tr><td>Shandon Cryotome E Cryostat</td><td>Thermo Electron Corporation ; ארה"ב</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא ; ארה"ב</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי מס' 22</td><td>La Medcare, הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr> <tr><td>מועצה כירורגית</td><td>מתוצרת</td><td></td> מקומית <td>ללא מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr> <tr><td>סרט לבן כירורגי</td><td>3M הודו; הודו</td><td>1530-1</td><td>סרט כירורגי מיקרופור</td></tr><tr><td>תופר</td> את <td>Ethicon, Johnson & ג'ונסון, הודו</td><td>NW 5047</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים (1 מ"ל, 26 גרם)</td><td>דיספו ואן; הודו</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr><tr><td>גוזם (קליפר)</td>מכונת שקילה <td>של פיליפס</td><td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td><td></td></tr><tr><td></td><td>בראון</td><td></td><td>אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי)</td></tr><tr><td>William's E Media</td><td>Himedia; הודו</td><td>AT125</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין (קסילקסין)</td><td>אימונולוגיה הודית מוגבלת</td><td></td><td>תרופות הרגעה, טרום הרדמה, משכך כאבים ומרפה שרירים</td></tr></tbody></table>

מיקרודיסקציה של עין המכרסם

Microdissection of the Rodent Eye

המיקרו-דיסקציה העינית של עין המכרסם כוללת פילוח של גלגל העין המצוי עם הממברנה המצורפת, או העפעף השלישי, כדי להשיג את המשקפיים הקדמיים והאחוריים. בטכניקה זו, ניתן להשיג את חלקי המשנה של העין, כולל רקמת הקרנית, הרקמה העצבית, רקמת אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) והעדשה, עבור סיטומות, חתך קריו, ו / או מתלים חד תאי של רקמת עין ספציפית. נוכחותו של העפעף השלישי טומנת בחובה יתרונות ייחודיים ומשמעותיים, שכן היא מועילה לשמירה על כיוון העין, החשוב להבנת הפיזיולוגיה של העין לאחר התערבות מקומית כלשהי או במחקרים הכוללים אנליזה עינית הנוגעת לטופוגרפיה המרחבית של העין.
בשיטה זו חינכנו את גלגל העין בשקע יחד עם העפעף השלישי על ידי חיתוך זהיר ואיטי של השרירים החוץ-עיניים וקטיעת עצב הראייה. גלגל העין נוקב דרך לימבוס הקרנית באמצעות מיקרובלייד. החתך שימש כנקודת הכניסה, ואיפשר חיתוך לאורך צומת הקרנית-סקלרלית על ידי החדרת מיקרו-מספריים דרך נקודת החתך. חתכים קטנים ורצופים לאורך ההיקף נעשו עד שהכוסות נפרדו. ניתן לנתח אותם עוד יותר על ידי קילוף עדין של השכבה השקופה של הרשתית העצבית באמצעות מלקחיים לתפירת קוליברי כדי להשיג את שכבות הרשתית העצבית וה- RPE. יתר על כן, שלושה/ארבעה חתכים במרחקים שווים נעשו מהפריפריה בניצב למרכז הראייה עד להגעה לעצב הראייה. פעולה זו פתחה את הגביעים ההמיספריים לצורת פרח כך שהם נפלו שטוחים וניתן היה להרכיב אותם בקלות. טכניקה זו שימשה במעבדה שלנו עבור wholemounts הקרנית וקטעי הרשתית. נוכחותו של העפעף השלישי מסמנת את האוריינטציה האף-טמפורלית, המאפשרת לימוד התערבויות שונות של תרפיה תאית לאחר ההשתלה, ומכאן התיקוף הפיזיולוגי הממוקד החיוני להדמיה ולייצוג מדויק במחקרים כאלה.

רקמת עין/קרנית עכבר RD1 הוכנה כדי לחקור אנגיוגנזה לימפוגרפית פוטנציאלית ברקמה הקדמית/הקרנית במצב חולה. רקמת הלחמית המחוברת מהעפעף השלישי פעלה כבקרה חיובית, שכן הקרנית חסרה כלי לימפה. לצורך המחקר, רקמת הקרנית נותחה עם הלחמית ותוקנה עם 4% PFA, ולאחר מכן חלחול וחסימה. לאחר מכן הרקמה הוכתמה בנוגדן ראשוני כנגד סמן האנדותל הלימפטי (LYVE1)9. זה היה ואחריו דגירה עם נוגדן משני שכותרתו עם Alexa Fluor 488 (ירוק). תמונות מייצגות (איור 4) צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי במהירו...

מאמר זה מציג פרוטוקול למיקרו-דיסקציה עינית במכרסמים. התהליך כולל את האינקולציה של גלגל העין יחד עם הממברנה הניקטיבית (כלומר, העפעף השלישי). לאחר מכן מתבצעת הפרדה של המשקפיים האחוריים והקדמיים.

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

מחקר העיניים בזמנים קדומים הסתמך בעיקר על רקמת העין של אנשים שנפטרו. עם זאת, במהלך השנים פותחו מודלים רבים של מכרסמים אופתלמיים והצורך ברקמת עין אנושית פחת. בשל גודלו הקטן ושטח הפעילות המצומצם בעין המכרסם, הגישה היעילה לחלקי העין מוגבלת מאוד.בדרך כלל, כדי לנתח עין של מכרסם, העין משותקת דרך עצב הראייה והדיסקציה מבוצעת. תרגול זה הוא מפרך ועלול לפגוע ברקמה השברירית כאשר העין הכדורית ממשיכה לנוע במהלך הדיסקציה. למרות היותה מועילה בבידוד החלקים השונים של שכבות הרשתית, טכניקה זו אינה יכולה לתחום את הכיוון המרחבי של הרקמה בעת נתיחת הרקמה.יתר על כן, התערבות ממוקדת קשה לאתר לאחר דיסקציה בשל הרכבה תאית הומוגנית של העין האחורית והקדמית. בסרטון זה מודגמת שיטה כירורגית שונה למיקרודיסקציה. הימצאותו של קרום הניקוט המצורף, או העפעף השלישי, מציגה יתרונות ייחודיים ומשמעותיים.בשיטה זו, תחילה גלגל העין הוא enucleated עם העפעף השלישי, ולאחר מכן העפעף השלישי משמש כדי לשתק את העין. זה ואחריו פירסינג גלגל העין דרך לימבוס הקרנית, ואת החתך משמש כנקודת הכניסה. לאחר מכן, על ידי חיתוך לאורך ההיקף, כוסות העין הקדמית והאחורית מופרדות.על ידי ניתוח נוסף של העין האחורית, השכבה השקופה של הרשתית העצבית מזוהה ומקולפת בעדינות. השכבות העצביות וה-RPE מתקבלות אפוא לעיבוד נוסף. העפעף השלישי יאפשר לנו לתחום את הכיוון המרחבי של עמוד העין.הבה נעקוב כעת אחר הליך מפורט שלב אחר שלב. להרחיב את העיניים מכרסם באמצעות טיפה של 0.8% tropicamide ו 5% phenylephrine פתרונות אופתלמיים ומניחים את החיה באזור כהה במשך 30 דקות לפני ההליך. להרדים את החיה על ידי מתן תוך צפקי חמש פעמים מנות של הרדמה.מינון טיפוסי הוא 200 מיקרוליטר PBS המכיל 10 מ"ג קטמין ואחד מ"ג קסילזין. אשר חוסר תגובה מוחלט לגירוי על ידי בחינת רפלקס הדוושה. הניחו את העכבר בשכיבה צידית כדי לאפשר גישה מלאה לעין.שמור על מלקחיים לתפירת קוליברי, מלקחיים מעוקלים, מיקרו-להב בגודל 15 מעלות שלושה מילימטר, מיקרו-מספריים קפיציים ומיקרו-מספריים קפיציים זוויתיים מוכנים להליך. מניחים מלקחיים מעוקלים סביב גלגל העין וצובטים כדי לשחרר את העין מחיבורים חיצוניים. העפעף השלישי, הידוע גם בשם הממברנה הניקטיבית, ממוקם לכיוון הפינה העליונה של משיק האף וניתן לזהותו כבליטה שקופה מינורית עם גבולות פיגמנטיים.לאחר מכן, להשתמש מיקרו מספריים קפיץ לחתוך סביב גלגל העין. חתכים קטנים ומתמשכים משחררים את גלגל העין מחיבורים סקלרליים. מניחים מיקרו-מספריים קפיציים מעוקלים מתחת לגלגל העין כדי לשחרר את העין על ידי חיתוך עצב הראייה.הניחו את העין המוחדרת בצלוחית פטרי המכילה חיץ PBS כך שגלגל העין יהיה שקוע ב-PBS. חלק מהשרירים או הרקמות החוץ-עיניות יתחילו לצוף הרחק מגלגל העין. הסר אותם על ידי חיתוך אותם גלגל העין באמצעות מיקרו מספריים קפיץ.לאחר מכן, הסר את עצב הראייה מבסיס גלגל העין כדי לאפשר הפרדה טובה יותר של הרשתית עבור ההכנות wholemount. אין צורך להסיר את עצב הראייה עבור חתך רקמות. מעבירים את גלגל העין לצינורית של 1.5 מ"ל המכילה מ"ל אחד של 4% פאראפורמלדהיד או PFA.שמור אותו במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס לקיבוע רקמות. ניתן לעצור בשלב זה על ידי השארת הרקמה ב- PFA עד 12 שעות בארבע מעלות צלזיוס. עם זאת, עבור בידוד של תאים חיים, שלבי הקיבוע לא צריך להתבצע ואת ההליך כולו צריך להתבצע ברצף.לאחר קיבוע PFA, העבירו את גלגל העין לצלחת פטרי המכילה PBS והניחו אותו תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לבצע את ההליך הבא. לשתק את גלגל העין על ידי החזקת העפעף השלישי בחוזקה עם מלקחיים תופרים קוליברי. הלימבוס הוא צומת סקלרל הקרנית.בצע חתך קטן בלימבוס על ידי פירסינג באמצעות מיקרולהב. החתך נעשה רצוי מול העפעף השלישי. לאחר מכן, באמצעות חתך זה כנקודת התחלה, עם מספריים מיקרו לבצע חתכים קטנים ומתמשכים לאורך היקף זה לימבוס סקלרלי הקרנית.ראשית, השלימו חצי עיגול של חתכים החל מנקודת החתך ועד לעפעף השלישי. לאחר מכן השלימו את חצי העיגול הנותר של החתכים בצד השני. לבסוף, בצע חתך סביב העפעף השלישי כדי להפריד בין הגביע האחורי והקדמי.הסר את העדשה מהגביע האחורי באמצעות מלקחיים כדי לקבל את הגביע האחורי המורכב מהרשתית העצבית ושכבת RPE ואת הגביע הקדמי של הקרנית. אם עובדים עם רקמות לא מקובעות, ניתן כעת לעכל אנזימטית את הגביעים הקדמיים והאחוריים כדי לקבל תרחיף חד תאי בקרנית או ברשתית. לקיבוע הרקמות, העבירו כוסות אלה לצינור של 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של 4% PFA למשך 12 שעות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הקיבוע, ניתן להטביע את הרקמה במדיום המתאים וניתן לבצע קריוסקציה או חתך פרפין כדי להשיג חתכים בקרנית או ברשתית. הכניסו מחדש את הכוס האחורית לצלחת הפטרי המכילה חיץ PBS. שכבה אטומה על שכבת RPE פיגמנטית היא הרשתית העצבית.יש לקלף את הרשתית העצבית באמצעות מלקחיים שנייה. תנועה עדינה וקלה מאוד של היד מומלצת מאוד כדי לא לפגוע ברקמה. בעצב הראייה, יציאה, ניתן להחדיר את מספריים הקפיץ המעוקלים מתחת לרשתית העצבית, וניתן לבצע חתך כדי לשחרר לחלוטין את השכבות אם הרשתית העצבית נשארת מחוברת.ניתן גם לשחרר או לנתק את הרשתית על ידי ליטוף עדין עם מברשת רכה. הכניסו מחדש את הכוסות הקדמיות והאחוריות לצלחת פטרי המכילה חיץ PBS. השתמש במיקרו-מספריים קפיציים זוויתיים כדי לבצע חתך ליד העפעף השלישי מהפריפריה בניצב לכיוון מרכז הראייה.שמרו על אחיזה בעפעף השלישי ובצעו חתך ליד החתך הראשון. בצע חתך דומה בין החתך השני לעפעף השלישי. שלושה או ארבעה חתכים כאלה במרחקים שווים פותחים את הגביעים החצי ספריים לצורת פרח, שנופלת שטוחה וניתנת להרכבה בקלות.אין לבצע חתכים עמוקים מאוד עד למרכז הכוס, שכן זה עלול לגרום לחלקי העלה להתפרק או להיפרד בקלות. התווך הנוזלי מאפשר לגביע העין הקדמי להשיג מבנה מעוקל. בצע את אותם השלבים שניתנו לביצוע חתכים על הכוס האחורית כדי לבצע שלושה או ארבעה חתכים במרחק שווה על הכוס הקדמית.הרקמות מוכנות כעת להכתמה נוספת. באיור זה, wholemount של קדמית מוצג. רקמת הקרנית עברה מיקרודיסקציה כמתואר כדי לחשוף את כלי הלימפה ברקמת הלחמית המחוברת של עלון הקרנית.באיור זה, wholemount של הרשתית העצבית מוצג. כלי הדם ברשתית של הרשתית העצבית הוכתמו באיזולקטין ונראים ככלי דם ירוקים. בשיטה זו, גלגל העין של העכברים מתקבל עם העפעף השלישי המחובר לטיפול יעיל וקל.העפעף השלישי משתק את גלגל העין לחלוטין ומאפשר לדיסקציה להתקדם בקלות ובמינימום טעויות. שיטה זו מועילה עבור חתך ספציפי לרקמת העין, אנליזה של תא בודד וסיטונים. עם זאת, הצורך בקיבוע רקמה חוזר הופך את הרקמה לבלתי בת קיימא עבור תרבית תאים או צרכים כאלה של תאים חיים.לפיכך, יש לבצע את ההליך ברצף לבידוד תאים חיים.

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הפגנה רשמית של דיסקציה של העין עכבר, וכתוצאה מכך הר שלם של אפיתל הפיגמנט ברשתית.

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

טכניקת הנתיחה ממחישה enucleation של עין העכבר לקיבוע רקמות כדי לבצע phenotyping במסכי תפוקה גבוהה.

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

דו ח זה מתאר שיטות מקיפות של הכנת העכבר הקפוא מקטעים רשתית עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC).  השיטות שתוארו כוללות ניתוח של הספל האחורי העינית, קיבעון הפרפורמלדהיד, הטבעה של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) מדיה ורקמות כיוון, הסרת וכתמים חיסוני.

הכנת שאיפה של העכבר רשתית-סעיפים עבור אימונוהיסטוכימיה

פרוטוקול זה מציג שתי טכניקות לבודד את התאים התת-תאיים של קולטני מוט מורין לניתוח חלבונים. השיטה הראשונה משתמשת בשרשתית חיה ונייר סינון תאית כדי להפריד מקטעים חיצוניים מוט, ואילו השני משתמש ברשתית ליופילית וקלטת דבק כדי לקלף שכבות מגזר פנימיות וחיצוניות מוט.

שתי שיטות פילינג לבידוד תאי קולטני אור ברשתית העכבר לניתוח חלבונים

מטרת פרוטוקול זה היא לאפיין מודל חדשני של ניוון עצבי גלאוקומטי המבוסס על צריבה תרמית של 360° של מקלעת כלי הדם הלימבלית, הגורמת ליתר לחץ דם עיני תת-חריף.

צריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית לגלאוקומה הנגרמת בניתוח במכרסמים

כתב יד זה מציג פרוטוקול להכנה היסטולוגית של שקופיות מגלגלי עיניים של מכרסמים. בשיטה המוצעת, ניתן לדמיין בקלות את הרשתית הפנימית ולהעריך אותה תחת מיקרוסקופ אור. ההליך מוצג עבור גלגלי העיניים של עכברים וחולדות.

הכנה וניתוח של שקופיות היסטולוגיות של גלגלי עיניים של חולדה ועכבר להערכת הרשתית

אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) פועל כמחסום מכריע בין הכורואיד לרשתית, ומקדם את בריאותם ותפקודם של סוגי תאי רשתית, כגון פוטורצפטורים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד וטיפוח RPE של מורין בוגר.

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

פרוטוקול זה מתאר את ההליך לבידוד רשתית העכבר בהרכבה שלמה וביצוע immunostaining כדי לתייג את כל תאי גנגליון הרשתית (RGCs). התהליך מלווה בהדמיה וספירה אוטומטית של RGCs באמצעות תוכנה מבוססת בינה מלאכותית, המספקת שיטה פשוטה, מהירה ומדויקת לכימות RGCs בכל רשתית העכבר.

Immunostaining בהר שלם וספירה אוטומטית של תאי גנגליון רשתית עכבר

מתואר פרוטוקול להכנת הקפאות רשתית של עכברים וביצוע צביעה חיסונית על קולטני אור. מאמר זה מאפשר לחוקרים לייצר באופן עקבי חלקים קפואים ברשתית של עכברים עם מורפולוגיה שמורה היטב ותוצאות צביעה חיסונית באיכות גבוהה.

הקפאה וצביעה חיסונית של רשתית העכבר

הרשתית מציגה ארגון מרחבי מורכב על פני המבנה הלמינרי שלה. טכניקות מודרניות של טרנסקריפטומיקה מרחבית וריצוף דורשות קטעי רקמה בעובי &lt; 20 מיקרומטר, מה שמגביל את תחולת מחקר הרשתית. שיטת הקפאה טרייה זו מייצרת קטעי פנים דקים של רשתית העכבר תוך שמירה על יחסים מרחביים מישוריים, ומאפשרת מיפוי מולקולרי מקיף על פני הלמינות.

פנים פנים הקפאה של רשתית עכבר לניתוח מרחבי מרחבי בממדים גבוהים

למדו פרוטוקול מיקרודיסקציה של עין מכרסם לחקר עיניים, הכולל אנוקלאציה עם קרום מצמיץ לשיפור אוריינטציה מרחבית ומזעור נזק לרקמות עדינות.

מיקרודיסקציה של עין המכרסם

גלה סרטונים נוספים