הדמיה של השבלול המזדקן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור

פיתחנו מיקרוסקופ אור שיכול להפוך את השבלול כולו לדיגיטלי. למיקרוסקופ זה יש מטרות המותקנות באוויר עם מרחק עבודה ארוך שיכול לצלם שבלולים קטנים של עכברים עד עצם רקתית אנושית גדולה. הוא חותך את השבלול באופן סדרתי עם קרן לייזר מבלי לגרום להרס מכני כלשהו.

שיטת ההדמיה שלנו יכולה לשמש להערכת שינויים פתולוגיים בשבלול, כגון אובדן תאי שיער ונוירוני גנגליון ספירליים עקב הזדקנות. לאחר המתת חסד ועריפת ראשו של עכבר, בצע חתך גבי-גחוני דרך המוח כדי לחטט את הגולגולת. הסר את המוח וזהה את הבולה העגולה בחלק הבאסובנטרלי של הגולגולת.

פתח את הבולה עם רונגורים. לאחר מכן, דמיינו והסירו את השבלול. תחת מיקרוסקופ דיסקציה בהגדלה של פי חמישה, נקבו את החלון הסגלגל והסירו את הרצועות בפיק חד.

לאחר מכן, הכנס פיק לחלון העגול כדי לנקב את הממברנה. כדי לבצע קיבוע, מכסים את החלון העגול הפתוח בקצה החתוך של ערכת עירוי המחוברת למזרק של מיליליטר אחד מלא בשני מיליליטר פורמלין. יש להחדיר פורמלין באיטיות דרך החללים הפרילימפטיים של השבלול במשך שתי דקות, כדי להבטיח שהפורמלין יוצא מהשבלול דרך החלון הסגלגל הפתוח.

חתוך רקמה עודפת מהשבלול. טבלו אותו בבקבוק המכיל 10% פורמלין והניחו אותו על מסובב למשך הלילה. להסרת הסתיידות, שטפו את השבלול ב-PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת.

יש לטבול בבקבוק המכיל 10% תמיסה של EDTA. לדגור אותו במשך ארבעה ימים עם סיבוב, לשנות את הפתרון מדי יום. לאחר מכן, יש לערבב את השבלול עם PBS שלוש פעמים ולשקוע במשך 15 דקות בין שינויים כדי להסיר את כל ה-EDTA.

לאחר השטיפה, יש לייבש את השבלול עם ריכוזים עולים של אתנול למשך 30 דקות בכל ריכוז. הכתימו את השבלול כולו על ידי טבילה בתמיסת רודמין B למשך הלילה עם סיבוב. הסר את עודפי הצבע מהשבלול עם שני שינויים של 100% אתנול עם דגירה למשך חמש דקות עבור כל שינוי.

מעבירים את השבלול המוכתם לשני מחליפים של תמיסת Spalteholz למשך 30 דקות בכל שינוי. השאירו לילה בתמיסת הסליקה עם סיבוב. חברו את השבלול למוט דגימה בקצה קרום החלון הסגלגל והעגול.

ודא שתמיסת הניקוי נשארת בתוך השבלול ולא נוצרות בועות. חברו את קצות החלון הסגלגלים והעגולים של השבלול הרטוב למוט הדגימה היבש באמצעות דבק מפעיל UV. רפא את דבק UV למשך 10 שניות על ידי תנועה סביב השבלול עם אור UV.

השהה את השבלול לתוך תא ההדמיה בתא פלואורומטר קוורץ צלול אופטית מלא בתמיסת Spalteholz עם מוט הדגימה מחובר למחזיק מסתובב המחובר גם לשלב תרגום X/Z. לאחר מכן, השתמש בתוכנית מותאמת אישית כדי להעביר את הדגימה דרך גיליון האור בשלבי ציר X ו- Z וצור ערימה של תמונות דו-ממדיות ברחבי השבלול. כדי לעבד את התמונה, העבר את אוסף התמונות למחשב אחר וטען אותו לתוכנית עיבוד תלת-ממדית לשחזור וכימות תלת-ממדיים.

עיבוד נפח ישיר של שבלול עכבר הראה את החלונות הסגלגלים והעגולים, איבר של קורטי עם תאי שיער, התעלה של רוזנטל הייתה מקוטעת ונפחית, והראתה נוירונים של גנגליון ספירלי, או SGNs, לאורכו. באמצעות TSLIM, שבלול של עכבר צעיר בן שלושה חודשים ועכבר בן 23 חודשים צולמו ונספרו עבור SGNs. ספירת תאי SGN כפונקציה של מרחק התעלה של רוזנטל המתוארת בתרשים ליניארי הראתה SGNs גדולים יותר בחיה הצעירה יותר באמצע ובקצוות האפי של השבלול בהשוואה לחיה המבוגרת יותר.

אובדן לכאורה זה של SGNs הודגם באמצעות ניתוח אשכולות ותוכנת עיבוד תלת-ממדית. הבדלי צפיפות SGN תוארו בסקאלת צבעים שבה אשכולות בצפיפות גבוהה הם צהובים וכחול מייצג אזורים בעלי צפיפות נמוכה יותר. ניתוח הצביר תיאר בבירור את האזורים בעלי צפיפות תאים נמוכה יותר לאורך התעלה של רוזנטל.

מיקרוסקופ גיליון אור נועד לייצר ערימה מיושרת היטב של תמונות שמהן ניתן להפיק עיבודי נפח תלת ממדיים של מבנים. תוכניות עיבוד תלת מימד מאפשרות הערכה כמותית של מבנים ויחסים אנטומיים בין מבנים שונים. עם זאת, מכיוון שתוכניות עיבוד תלת-ממד מציעות פרמטרים רבים ושונים של המשתמש, קיימת עקומת למידה משמעותית לשימוש יעיל בתוכניות אלה.