Name: הדמיה של השבלול המזדקן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: למד הדמיה תלת-ממדית של השבלול באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור ללא הרס מכני. שיטה זו מאפשרת הערכת שינויים פתולוגיים באיברי השמע וביולוגיה של מערכת השמע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות של המכונים הלאומיים לבריאות, קרן קלוג, ותרומות פרטיות של ברידג'ט ספרל וג'ון מקורמיק. TSLIM פותחה בעזרתם המצוינת של מתיאס הילנברנד, קרסטין ג'ון, מייק לוין, מישל לייהר, טוביאס שרוטר, פיטר שאכט, אוליבר דנברג וג'וליאן ווסטר מהאוניברסיטה הטכנית של אילמנאו, גרמניה, בפיקוח המנטורים שלהם (סטפן סינזינגר ורנה תסקה) וג'יימס לגר.

כל הנהלים והשימוש בבעלי חיים נבדקו ואושרו (מזהה פרוטוקול #2010-38573A) על ידי ועדת הטיפול והשימוש המוסדי של אוניברסיטת מינסוטה (IACUC) וחוקרים המשתמשים בבעלי חיים אלה הוכשרו ונבדקו ביסודיות על ידי וטרינרים של משאבי חיות מחקר (RAR) לפני שיש להם גישה למתקני בעלי החיים. במחקר זה נעשה שימוש הן בעכברים זכרים והן בנקבות.
1. הסרת שבלול לצורך קיבוע ועיבוד רקמות לצורך הדמיה
<ol><li>הרדימו עכבר באמצעות שאיפת CO2 . ערפו את ראשו של העכבר במספריים ובצעו חתך גבי-גחוני דרך המוח כדי לחצות את הגולגולת. הסר את המוח, זהה את הבולה העגולה בחלק הבאסו-גחוני של הגולגולת, פתח את הבולה עם רונגורים, ודמיין והסר את השבלול.</li>
	<li>קיבוע: בצע הליך זה תחת מכסה אדים ובאמצעות מיקרוסקופ דיסקציה בהגדלה פי 5. יש ללבוש כפפות וביגוד מגן. נקב את החלון הסגלגל והסר את הרצועות עם פיק חד. הכנס פיק לחלון העגול כדי לנקב את הממברנה.</li>
	<li>מכסים את החלון העגול הפתוח בקצה החתוך של ערכת עירוי המחוברת למזרק 1 מ"ל מלא 2 מ"ל פורמלין. יש להחדיר פורמלין באיטיות דרך החללים הפרילימפטיים של השבלול במשך 2 דקות, תוך ציון העובדה שהפורמלין יוצא מהשבלול דרך החלון הסגלגל הפתוח. חתכו את עודפי הרקמה מהשבלול וטבלו בבקבוק המכיל 10% פורמלין, והניחו על מסובב למשך הלילה.</li>
	<li>הסתיידות: יש לשטוף את השבלול ב-PBS 3x למשך 5 דקות כל אחד ולטבול בבקבוק המכיל 10% תמיסה של חומצה דיסודיום אתילאנדיאמין-טטראצטית (EDTA) עם סיבוב במשך 4 ימים, תוך החלפת התמיסה מדי יום.</li>
	<li>התייבשות: יש לערבב את השבלול עם PBS 3x ולשקוע במשך 15 דקות בין החלפה. לייבש את השבלול עם ריכוזים עולים של אתנול 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; במשך 30 דקות בכל ריכוז. הערה: חשוב להסיר את כל ה-EDTA לפני התייבשות מכיוון ש-EDTA מזרז אתנול. כמו כן, ניתן להשאיר שבלול בכל ריכוז אתנול הגדול מ-70% למשך הלילה.</li>
	<li>צביעה: יש להכתים את השבלול כולו על ידי טבילה בתמיסה של רודאמין B איזותיוצינאט (5 מק"ג/מ"ל ב-100% אתנול) למשך לילה עם סיבוב. הסירו את עודפי הצבע מהשבלול בעזרת שני שינויים של 100% אתנול, 5 דקות כל שינוי.</li>
	<li>ניקוי: מעבירים את השבלול המוכתם לשני שינויים של תמיסת Spalteholz12 (5:3 מתיל סליצילאט:בנזיל בנזואט), 30 דקות כל שינוי ומשאירים לילה בתמיסת הניקוי עם סיבוב. ניתן להשאיר שבלול בתמיסת Spalteholz ללא הגבלת זמן.</li>
</ol>2. הדמיה של שבלול
<ol><li>חברו את השבלול למוט דגימה בקצה קרום החלון הסגלגל והעגול כך שתמיסת הניקוי תישאר בתוך השבלול ולא ייווצרו בועות (איור 2). יש להקפיד לא לתת לבועות להיווצר בתוך השבלול מכיוון שקשה להסיר אותן ואם הן נשארות ברקמה, הן יגרמו לממצאי הדמיה.</li>
	<li>השתמשו בדבק מפעיל UV כדי לחבר את השבלול הרטוב למוט הדגימה היבש (איור 2). חברו את השבלול בקצה החלון הסגלגל והעגול. רפא את דבק UV במשך 10 שניות על ידי תנועה סביב השבלול עם אור UV. הערה: חיבור רופף של השבלול למוט הדגימה יגרום לפגמים בהדמיה. מוט זה מיוצר במיוחד עבור פרוטוקול זה (ראה Santi et al.8 לפרטים) והוא ספציפי למיקרוסקופ יריעות האור שלנו.</li>
	<li>השהה את השבלול לתוך תא הדמיה מלא בתמיסת Spalteholz להדמיה. תא הדגימה הוא תא פלואורומטר קוורץ שקוף אופטית (וידאו 1).</li>
	<li>חבר את מוט הדגימה למחזיק מסתובב המחובר גם לשלב התרגום XZ. רוב הערימות מתקבלות על ידי תרגום הדגימה במישורי XZ, אך ניתן להשיג גם ערימות סיבוביות.</li>
	<li>חתך אופטי TSL: השתמש בלייזר כחול או ירוק לעירור בהתאם לסוג הצביעה הפלואורוכרום. מקמו את יריעת האור במרכז הרקמה לצורך מיקוד וקבעו את ההגדלה שתשמש להארה לכל רוחב השבלול. לאחר מכן, השתמש בתוכנית מותאמת אישית כדי להעביר את הדגימה דרך גיליון האור על פני הדגימה בציר X (תפירת התמונה) ובשלבי Z כדי ליצור ערימה של תמונות דו-ממדיות ברחבי השבלול.</li>
	<li>עבור התמונה הראשונה, מותני הקרן של גיליון האור ממוקמים בקצה הדגימה והתוכנית סורקת את מלוא רוחב הדגימה ואוספת עמודות של נתונים (ראה תפירת תמונה; Santi et al.8) שהם רוחב הפרמטר הקונפוקלי (איור 3) כדי לייצר תמונה דו-ממדית מורכבת ברזולוציה מקסימלית לרוחב הדגימה. התוכנית הופכת את תפירת התמונה לאוטומטית עבור כל שלב Z עד לתמונה מלאה.</li>
	<li>עיבוד תמונה: העבירו את אוסף התמונות למחשב אחר וטענו אותו לתוכנית עיבוד תלת-ממדית לצורך שחזור וכימות תלת-ממדיים.</li>
</ol>

<ol><li>Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss</a> (2021).</li>
<li>Vater, M., Kössl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+cochlear+functional+organization+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals.</a> Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digital+cytocochleogram%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The digital cytocochleogram.</a> Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).</li>
<li>Voie, A. H., Spelman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+cochlea+from+two-dimensional+images+of+optical+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Computerized+Medical+Imaging+and+Graphics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections.</a> Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-sheet+laser+imaging+microscopy+for+optical+sectioning+of+thick+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).</li>
<li>Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+thin-sheet+laser+imaging+microscopy+%28sTSLIM%29+with+structured+illumination+and+HiLo+background+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection.</a> Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+quantitative+resolution+measurements+of+an+optical+virtual+sectioning+three-dimensional+imaging+technique+for+biomedical+specimens%2C+featuring+two-micrometer+slicing+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039(2007).</li>
<li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpalteholz%2C+W+%22On+making+human+and+animal+preparations+transparent%22">On making human and animal preparations transparent</a>. , S. Hierzel. Leipzig, Germany. (1914).</li>
<li>Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLIM+imaging+and+a+morphometric+analysis+of+the+mouse+spiral+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion.</a> Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+of+Corti+surface+preparations+for+computer-assisted+morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry.</a> Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).</li>
<li>Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endolymph+movement+visualized+with+light+sheet+fluorescence+microscopy+in+an+acute+hydrops+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model.</a> Hearing Research. 339, 112-124 (2016).</li>
<li>White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+degeneration+of+the+spiral+ganglion+cell+and+its+processes+in+the+C57BL%2F6J+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse.</a> Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).</li>
<li>Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+and+cholinergic+innervation+in+the+mouse+cochlea+after+noise-induced+or+age-related+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy.</a> Hearing Research. 422, 108533(2022).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

חתך אופטי במיקרוסקופ יריעות אור לבחינת מבני שבלול אינו הרסני מבחינה מכנית כמו שיטות היסטולוגיות מסורתיות אחרות, והוא מספק תצוגה דיגיטלית מלאה של מבני השבלול ביחס זה לזה. שיטות קודמות כגון תכשירים על פני השטח של האיבר של קורטי14 סיפקו מפה של נשירת תאי שיער לאורך הקרום הבזילרי, אך לא ניתן היה להעריך אובדן SGN מכיוון שהרקמה נותחה משם כדי לחשוף את האיבר של קורטי. לחילופין, מקטעי מיקרוטומה בינוניים של השבלול מספקים רק מדגם קטן מאוד של מצב ה-SGNs לכל אורך התעלה של רוזנטל. עם TSLIM, כל מבני השבלול עוברים...

השבלול הוא איבר החישה ההיקפי לשמיעה אצל יונקים. יש לו אנטומיה ספירלית מורכבת של תאים חושיים ותומכים חוזרים המתמחים אנטומית כדי לזהות תנודות קול ולהעבירם למוח לתפיסת השמיעה. מרכיבי החישה העיקריים הם תאי השערה הפנימיים והחיצוניים וסיבי העצב המעצבבים שלהם, שגופם התא מרכיב את הגנגליון הספירלי, השוכן בתוך התעלה של רוזנטל (איור 1). מבנים חושיים ועצביים אלה מסודרים באופן טונוטופי כך שצלילים בתדר גבוה מומרים בבסיס השבלול וצלילים בתדר נמוך מומרים בקודקודהשבלול 2. מפה אנטומית של התפלגות תאים חושיים זו לאורך הספירלי של הממברנה הבזילארית התומכת נקראת ציטוקוכלאוגרמה3 וניתן להשוות אותה עם ליקוי שמיעה כפונקציה של תדר כפי שמתואר באודיוגרמה.
המבוך הקרומי של השבלול, המוקף בעצם צפופה, מקשה מבחינה טכנית לבחון יותר ממבנה שבלול אחד בכל פעם. לכן, הרציונל לפיתוח מיקרוסקופ יריעות אור הוא לייצר מקטעים טוריים מיושרים היטב של השבלול השלם, כך שניתן יהיה לבחון את כל מבני השבלול ביחס זה לזה בשחזורים תלת-ממדיים. Voie et al.4 ו-Voie and Spelman5 תכננו את המיקרוסקופ הראשון של יריעות אור, שנקרא מיקרוסקופ חתך אופטי פלואורסצנטי מישורי אורתוגונלי (OPFOS), כדי לחתוך אופטית את כל השבלול. עם זאת, מיקרוסקופ זה מעולם לא פותח מסחרית; לכן, מטרתנו הייתה לבנות מיקרוסקופ גיליון אור שנקרא מיקרוסקופ הדמיה לייזר דק (TSLIM; איור 2). פרטי התכנון והבנייה של TSLIM פורסמו בעבר8. TSLIM ביצעה מספר שיפורים לעומת OPFOS, כולל שימוש במצלמה דיגיטלית בתאורה חלשה לעומת מצלמת CCD לאיסוף תמונות, מיקרופוזיציות מקודדות אופטית לתנועה מדויקת וניתנת לשחזור של הדגימה דרך יריעת האור, שימוש בתא דגימה זמין מסחרית ושקוף אופטית, וצביעת רודמין באתנול במקום בתמיסת הניקוי למניעת משקעים של כתמים בתוך הרקמה. הפיתוח המסחרי של מיקרוסקופים קלילים כגון SPIM6 התמקד בהדמיה ברזולוציה גבוהה של דגימות חיות ושקופות קטנות, אך הם אינם מתאימים לדימות שבלול שלם מכיוון שאין להם מרחק עבודה מספיק. סקירה של התפתחות מיקרוסקופים אחרים של יריעות אור פורסמה על ידי Santi7. היתרון העיקרי של TSLIM על פני שיטות היסטולוגיות אחרות לבדיקת השבלול הוא חתך רקמות אופטיות לשחזור תלת ממדי תוך שמירה על שלמות הדגימה, כך שניתן יהיה להשתמש בה בשיטות היסטולוגיות אחרות. יתרון נוסף של הדמיית TSLIM הוא שרק יריעת אור דקה המיוצרת על ידי לייזר נחשפת לרקמה, לעומת חשיפה לעובי רקמה שלמה ללייזר כמו במיקרוסקופ קונפוקלי. ניקוי רקמות כדי למזער את פיזור האור והעובדה שרק חלק קטן מהרקמה חשוף ללייזר מביא לדעיכה מינימלית של פלואורוכרום (פוטו-הלבנה) באמצעות הדמיית לייזר של יריעות אור. עם זאת, תהליך הקיבוע, ההתייבשות והניקוי משנה את המורפולוגיה של מבני השבלול וגורם להתכווצות הרקמה בהשוואה לרקמה חיה. כמות התכווצות הרקמה המתרחשת בפועל לא נקבעה.
TSLIM פותחה על ידי שיין ג'ונסון ושמונה סטודנטים גרמנים להנדסה אופטית (ראו תודות). פרטי הבנייה של TSLIM סופקו על ידי Santi et al.8 וגרסת סריקה (sTSLIM) על ידי Schröter et al.9. TSLIM מתפקד כמיקרוטום לא הרסני לחיתוך אופטי של דגימות וכמיקרוסקופ לאיסוף מקטעים טוריים דו-ממדיים דרך מלוא רוחב ועובי השבלול. TSLIM יכול לצלם דגימות קטנות (מ"מ) וגדולות (ס"מ), עבות. העדשות מותקנות באוויר כדי לאפשר מרחקי עבודה ארוכים עם יעדי איסוף של 1x ו-2x במיקרוסקופ דיסקציה. למיקרוסקופ הדיסקציה יש גם אופטיקת זום המאפשרת ל-TSLIM לפתור מבנים תת-תאיים וסינפטיים בתאים. TSLIM מצויד בלייזר כחול (473 ננומטר) וירוק (532 ננומטר) להארה המאפשרת שימוש במגוון בדיקות פלורסנט להדמיה. המטרה של TSLIM היא לייצר מקטעים אופטיים דו-ממדיים מיושרים היטב דרך שבלול שלם לשחזור דיגיטלי מלא של רקמות השבלול. מכיוון שמדובר בשיטה פלואורסצנטית, ליגנדות ואימונוהיסטוכימיה יכולות לשמש גם לזיהוי מבני שבלול ספציפיים.
בתחילה, עדשה גלילית שימשה לייצור שתי יריעות אור גאוסיאניות מנוגדות, אך היא הפיקה ממצאי דימות בליעה. בשל עבודתם של קלר ואחרים 10, העדשה הגלילית הקבועה הוחלפה במראה גלוונומטר סורקת כדי לייצר את גיליון האור9. נוסף על כך, מאחר שמרכז היריעה הבהירה הוא הדק ביותר במותני הקרן, תמונות sTSLIM 2D מופקות על-ידי איסוף קומפוזיט של עמודות נתונים על ציר X לרוחב הדגימה (איור 3). שיטה זו תוארה לראשונה על ידי Buytaert ו Dircks11. תוכנת TSLIM מותאמת אישית לנהיגה ואיסוף תמונות פותחה באמצעות תוכנה גרפית לבקרת מכשירים. יריעת האור עוברת דרך הדגימה ומאירה מישור פלואורסצנטי בתוך הרקמה. מישור פלואורסצנטי זה מוקרן באופן אורתוגונלי דרך הדגימה השקופה ונאסף על ידי מיקרוסקופ דיסקציה. מיקרופוזיציות מקודדות אופטית מאפשרות סריקה דרך מותני הקרן בציר X כדי לאסוף תמונה דו-ממדית מורכבת אחת, ולאחר מכן, המיקרופוזיציה של ציר Z מעבירה את הדגימה למישור עמוק יותר בתוך הרקמה כדי לקבל ערימה של תמונות דו-ממדיות טוריות חתוכות (וידאו 1, איור 4). ערימה של תמונות תרגום נאספת לכל רוחב, עובי ואורך השבלול, ואין צורך בתפירת תמונות (סרטון 2). מחסנית התמונות מועברת למחשב אחר ונטענת לתוכנית עיבוד תלת ממדית לשחזור וכימות תלת מימדי. ערימות התמונות מכילות את כל המידע הדיגיטלי על המורפולוגיה של שבלול ברזולוציה של המיקרוסקופ. עם זאת, אם נדרשת רזולוציה גבוהה יותר, השבלול השלם יכול להיות מעובד עוד יותר על ידי שיטות היסטולוגיות הרסניות כגון חתך מיקרוטום, סריקה ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת.
תוכנית העיבוד התלת-ממדית משמשת לפלח מבני שבלול שונים עבור עיבוד תלת-ממדי וניתוח כמותי. לצורך סגמנטציה, כל מבנה בכל תמונה דו-ממדית של הערימה מתבצע באמצעות צבע שונה באמצעות לוח ועט גרפיים (איור 5). עד כה חולקו 20 מבני שבלול שונים (איור 6). לאחר הפילוח ניתן לבצע מגוון ניתוחים תלת ממדיים. לדוגמה, תוכנת עיבוד תלת-ממדית יכולה למעשה לכרות מחדש את השבלול בכל מישור לאורך הצנטרואיד של המבנה. סרטון 3 מראה חתך משיק לאיבר של קורטי, אשר חושף את תאי השערה לאורך הקרום הבזילרי. תהליך זה דורש תחילה פילוח ידני של מבנה העניין. לאחר מכן, הצנטרויד של המבנה מחושב על פי התאמת הריבועים הפחותים של נקודות הספליין הממוקמות לאורך מרכז המבנה מבסיסו ועד קודקודו, ובכך מאפשר קירוב של אורך המבנה (סרטון 4). תהליך דומה שנקרא שלד יכול לשמש כדי להמחיש את הרוחב הרדיאלי של המבנה לאורכו באמצעות מפת צבע (וידאו 4). הנפח הכולל של כל מבנה מחושב על-ידי התוכנית לאחר הסגמנטציה, אך ניתן גם לכמת מרחקים יחסיים ולהמחיש אותם באמצעות מפות צבע בתוכנת עיבוד תלת-ממדית (איור 7). ניתן גם לייצא מבנים מפולחים כדי לייצר הדמיות מודל מוגדלות מפלסטיק מוצק (איור 8). נוסף על כך, ספירת תאים חצי-אוטומטית יכולה להתבצע גם באמצעות תוכנת עיבוד תלת-ממדית (איור 9). אימונוהיסטוכימיה וקשירת ליגנדים יכולות לשמש להכתמת מבנים ספציפיים של השבלול, וניתן לבודד את המבנים האלה ממבני שבלול אחרים לצורך הערכה מורפומטרית, כגון הפקת ציטוקוכלאוגרמה (איור 10). ניתן לקבוע אורך, רוחב, משטח, נפח ומספר של כל מבני השבלול מהמודלים התלת-ממדיים, מה שהופך גישה זו לאידיאלית למיפוי נזקי שבלול לליקויים תפקודיים. באופן ספציפי, ניתן להראות ולכמת נזק לשבלול כתוצאה מהזדקנות, טראומה כתוצאה מרעש או עלבונות אחרים בשחזורים תלת-ממדיים של שבלול ממקטעים אופטיים דו-ממדיים. לאחר דיגיטציה של שבלול שבלול, ישנם אלגוריתמי הדמיה רבים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך נזק לשבלול של כל רקמה בתוך השבלול ברישום האנטומי לרקמות שבלול אחרות.

<table><tbody><tr><td>תוכנת עיבוד תלת מימד אמירה</td><td>ThermoFisher כתובת מדעית</td><td></td><td>: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433</td></tr><tr><td>בנזיל בנזואט (W213810)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>כתובת: תיבת דואר, 14508, סנט לואיס, MO 68178</td></tr><tr><td>Bondic&nbsp;</td><td>בונדיק&nbsp;</td><td></td><td>כתובת: 235 Industrial Parkway S., יחידה 18 Aurora, ON L4G 3V5 קנדה</td></tr><tr><td>אתנול 95% ו-100%&nbsp;</td><td>אוניברסיטת מינסוטה</td><td></td><td>כתובת: מחסן כללי, מיניאפוליס, MN 55455</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית מלח דיסודיום דיהידראט (EDTA)&nbsp; (E5134)</td><td>סיגמא-אולדריץ', בע"מ&nbsp;</td><td></td><td>כתובת: תיבת דואר, 14508, סנט לואיס, MO 68178</td></tr><tr><td>LabVIEW תוכנית גרפית ו-Vision</td><td>National Instruments</td><td></td><td>כתובת: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504</td></tr><tr><td>מתיל סליצילאט (M6742)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>כתובת: תיבת דואר, 14508, סנט לואיס, MO 68178</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה אולימפוס MVX10</td><td>אולימפוס קורפ</td><td></td><td>כתובת: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034</td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocynate, (283924)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ', בע"מ&nbsp;</td><td></td><td>כתובת: תיבת דואר, 14508, סנט לואיס, MO 68178</td></tr><tr><td>תא פלורומטר סטארנה (3-G-20)</td> <td>תאי</td><td></td> סטארנה <td>כתובת: ת.ד. 1919, אטסקדרו, קליפורניה 82423</td></tr></tbody></table>

הדמיה של השבלול המזדקן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

חירשות היא הליקוי החושי הנפוץ ביותר, המשפיע על כ -5% או 430 מיליון אנשים ברחבי העולם על פי ארגון הבריאות העולמי1. הזדקנות או פרסביקוזיס היא הגורם העיקרי לאובדן שמיעה תחושתי-עצבי והיא מאופיינת בנזק לתאי שיער, נוירוני גנגליון ספירליים (SGNs) והסטריה וסקולריס. מבנים אלה שוכנים בתוך השבלול, שיש לו אנטומיה מורכבת בצורת ספירלה של רקמות קרומיות המרחפים בנוזל ומוקפים בעצם. תכונות אלה מקשות מבחינה טכנית לחקור ולכמת שינויים היסטופתולוגיים. כדי לענות על צורך זה, פיתחנו מיקרוסקופ גיליון אור (TSLIM) שיכול לצלם ולהפוך את השבלול כולו לדיגיטלי כדי להקל על חקר יחסי מבנה-תפקוד באוזן הפנימית. מקטעים טוריים מיושרים היטב של השבלול כולו יוצרים ערימה של תמונות לעיבוד נפח תלת-ממדי (תלת-ממדי) ופילוח של מבנים בודדים לצורך הדמיה תלת-ממדית וניתוח כמותי (כלומר, אורך, רוחב, משטח, נפח ומספר). שבלול דורש שלבי עיבוד מינימליים (קיבוע, הסתיידות, התייבשות, צביעה וניקוי אופטי), שכולם תואמים לדימות ברזולוציה גבוהה לאחר מכן על ידי סריקה ומיקרוסקופ אלקטרונים שידור. מכיוון שכל הרקמות נמצאות בערימות, ניתן להעריך כל מבנה בנפרד או ביחס למבנים אחרים. בנוסף, מאחר שההדמיה משתמשת בבדיקות פלואורסצנטיות, ניתן להשתמש באימונוהיסטוכימיה ובקשירת ליגנדים כדי לזהות מבנים ספציפיים ואת נפחם או פיזורם התלת-ממדי בתוך השבלול. כאן השתמשנו ב-TSLIM כדי לבחון שבלול מעכברים מזדקנים כדי לכמת את אובדן תאי השערה ותאי העצב בגנגליון ספירלי. בנוסף, נעשה שימוש באנליזות מתקדמות (למשל, ניתוח אשכולות) כדי להמחיש הפחתה מקומית של נוירוני גנגליון ספירליים בתעלה של רוזנטל לאורך נפחה התלת-ממדי. גישות אלה מדגימות את יכולתו של מיקרוסקופ TSLIM לכמת יחסי מבנה-פונקציה בתוך שבלול ובין שבלול.

מכיוון שהנושא של גיליון מיוחד זה הוא הדמיה של השפעות ההזדקנות בשבלול, שבלול צעיר (בן 3 חודשים, HS2479, עכבר זן CBA) ובגיל (בן 23 חודשים, HS2521, עכבר זן C57) ישמשו כדוגמאות. יש לציין כי TSLIM מסוגל להדמיה של מגוון דגימות, כולל שבלול מבני אדם, יונקים, מכרסמים אחרים ודגים, כמו גם איברים אחרים כגון המוח.
Johnson et al. 13 פרסמו מאמר על SGNs בעכברי CBA צעירים (בני 3 שבועות) המשתמשים ב-TSLIM. כל ה-SGNs נספרו בחמישה עכברים והיה טווח של 8,408-8,912 SGNs עם אורך ממוצע של רוזנטל...

מיקרוסקופ יריעות אור פותח כדי לצלם ולהפוך שבלול שלם לדיגיטלי.

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

פיתחנו מיקרוסקופ אור שיכול להפוך את השבלול כולו לדיגיטלי. למיקרוסקופ זה יש מטרות המותקנות באוויר עם מרחק עבודה ארוך שיכול לצלם שבלולים קטנים של עכברים עד עצם רקתית אנושית גדולה. הוא חותך את השבלול באופן סדרתי עם קרן לייזר מבלי לגרום להרס מכני כלשהו.שיטת ההדמיה שלנו יכולה לשמש להערכת שינויים פתולוגיים בשבלול, כגון אובדן תאי שיער ונוירוני גנגליון ספירליים עקב הזדקנות. לאחר המתת חסד ועריפת ראשו של עכבר, בצע חתך גבי-גחוני דרך המוח כדי לחטט את הגולגולת. הסר את המוח וזהה את הבולה העגולה בחלק הבאסובנטרלי של הגולגולת.פתח את הבולה עם רונגורים. לאחר מכן, דמיינו והסירו את השבלול. תחת מיקרוסקופ דיסקציה בהגדלה של פי חמישה, נקבו את החלון הסגלגל והסירו את הרצועות בפיק חד.לאחר מכן, הכנס פיק לחלון העגול כדי לנקב את הממברנה. כדי לבצע קיבוע, מכסים את החלון העגול הפתוח בקצה החתוך של ערכת עירוי המחוברת למזרק של מיליליטר אחד מלא בשני מיליליטר פורמלין. יש להחדיר פורמלין באיטיות דרך החללים הפרילימפטיים של השבלול במשך שתי דקות, כדי להבטיח שהפורמלין יוצא מהשבלול דרך החלון הסגלגל הפתוח.חתוך רקמה עודפת מהשבלול. טבלו אותו בבקבוק המכיל 10% פורמלין והניחו אותו על מסובב למשך הלילה. להסרת הסתיידות, שטפו את השבלול ב-PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת.יש לטבול בבקבוק המכיל 10% תמיסה של EDTA. לדגור אותו במשך ארבעה ימים עם סיבוב, לשנות את הפתרון מדי יום. לאחר מכן, יש לערבב את השבלול עם PBS שלוש פעמים ולשקוע במשך 15 דקות בין שינויים כדי להסיר את כל ה-EDTA.לאחר השטיפה, יש לייבש את השבלול עם ריכוזים עולים של אתנול למשך 30 דקות בכל ריכוז. הכתימו את השבלול כולו על ידי טבילה בתמיסת רודמין B למשך הלילה עם סיבוב. הסר את עודפי הצבע מהשבלול עם שני שינויים של 100% אתנול עם דגירה למשך חמש דקות עבור כל שינוי.מעבירים את השבלול המוכתם לשני מחליפים של תמיסת Spalteholz למשך 30 דקות בכל שינוי. השאירו לילה בתמיסת הסליקה עם סיבוב. חברו את השבלול למוט דגימה בקצה קרום החלון הסגלגל והעגול.ודא שתמיסת הניקוי נשארת בתוך השבלול ולא נוצרות בועות. חברו את קצות החלון הסגלגלים והעגולים של השבלול הרטוב למוט הדגימה היבש באמצעות דבק מפעיל UV. רפא את דבק UV למשך 10 שניות על ידי תנועה סביב השבלול עם אור UV.השהה את השבלול לתוך תא ההדמיה בתא פלואורומטר קוורץ צלול אופטית מלא בתמיסת Spalteholz עם מוט הדגימה מחובר למחזיק מסתובב המחובר גם לשלב תרגום X/Z. לאחר מכן, השתמש בתוכנית מותאמת אישית כדי להעביר את הדגימה דרך גיליון האור בשלבי ציר X ו- Z וצור ערימה של תמונות דו-ממדיות ברחבי השבלול. כדי לעבד את התמונה, העבר את אוסף התמונות למחשב אחר וטען אותו לתוכנית עיבוד תלת-ממדית לשחזור וכימות תלת-ממדיים.עיבוד נפח ישיר של שבלול עכבר הראה את החלונות הסגלגלים והעגולים, איבר של קורטי עם תאי שיער, התעלה של רוזנטל הייתה מקוטעת ונפחית, והראתה נוירונים של גנגליון ספירלי, או SGNs, לאורכו. באמצעות TSLIM, שבלול של עכבר צעיר בן שלושה חודשים ועכבר בן 23 חודשים צולמו ונספרו עבור SGNs. ספירת תאי SGN כפונקציה של מרחק התעלה של רוזנטל המתוארת בתרשים ליניארי הראתה SGNs גדולים יותר בחיה הצעירה יותר באמצע ובקצוות האפי של השבלול בהשוואה לחיה המבוגרת יותר.אובדן לכאורה זה של SGNs הודגם באמצעות ניתוח אשכולות ותוכנת עיבוד תלת-ממדית. הבדלי צפיפות SGN תוארו בסקאלת צבעים שבה אשכולות בצפיפות גבוהה הם צהובים וכחול מייצג אזורים בעלי צפיפות נמוכה יותר. ניתוח הצביר תיאר בבירור את האזורים בעלי צפיפות תאים נמוכה יותר לאורך התעלה של רוזנטל.מיקרוסקופ גיליון אור נועד לייצר ערימה מיושרת היטב של תמונות שמהן ניתן להפיק עיבודי נפח תלת ממדיים של מבנים. תוכניות עיבוד תלת מימד מאפשרות הערכה כמותית של מבנים ויחסים אנטומיים בין מבנים שונים. עם זאת, מכיוון שתוכניות עיבוד תלת-ממד מציעות פרמטרים רבים ושונים של המשתמש, קיימת עקומת למידה משמעותית לשימוש יעיל בתוכניות אלה.

imaging-the-aging-cochlea-with-light-sheet-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הדמיה חיה של שבלול האוזן של יונקים העובריים היא מאתגרת, כי התהליכים התפתחותיים ביד פועלים על שיפוע זמני על עשרה ימים. כאן אנו מציגים שיטה culturing ולאחר מכן ההדמיה רקמות explant השבלול עוברית שנלקחו מעכבר כתב ניאון בחמישה ימים.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

ריסים ראשוניים משפיעים על מסלולי איתות שונים. שבלול היונקים אידיאלי לבחינת איתות קוטביות תאים מישוריים (PCP). תפקוד לקוי של ריסים משפיע על צמיחת השבלול, דפוס התאים וכיוון תאי השערה, קריאות של PCP. מטרתנו היא לנתח איתות PCP בשבלול עכבר באמצעות ניתוח פנוטיפי, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

אנו מציגים שיטה לבודד את האיבר הבוגר של קורטי כשלושה סיבובים שלמים שבלול (קודקוד, אמצע, ובסיס). אנחנו גם מדגימים הליך immunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently. יחד טכניקות אלה יאפשרו המחקר של תאי שיער, תאי תמיכה, וסוגי תאים אחרים הנמצא בשבלול.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להמחשת הקרנה מוטור נוירון, האקסון arborization ב הטרנסגניים Hb9::GFP העכבר עוברי. לאחר immunostaining עבור מוטורי לגלוקוז, השתמשנו גיליון אור זריחה מיקרוסקופ כדי התמונה עוברי עבור ניתוח כמותי עוקבות. פרוטוקול זה חל תהליכים ניווט אחרים תא עצב במערכת העצבים המרכזית.

ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

דג זברה היא מערכת מודל יש תכונות רבות ערך כולל בהירות אופטית, התפתחות חיצוני מהירה,, חשוב במיוחד בתחום השמיעה ושיווי, מבחוץ ממוקם תאי שיער חישה. מאמר זה מתאר כיצד הטרנסגניים דג זברה יכול לשמש כדי assay שיער-תא mechanosensation ותפקוד presynaptic בוססו.

בתחום ההדמיה סידן Vivo של קו הצד תאים שיער בזחל דג זברה

כתב יד זה מתאר פרוטוקול ניסיוני להערכת מאפיינים מורפולוגיים ומעמד פונקציונלי של הסינפסות של רצועת הכלים בעכברים נורמליים. המודל הנוכחי מתאים גם לרעש המושרה והקשורות לגיל synaptopathy מודלים מוגבלים. גם התוצאות של לימודי העכבר הקודמים נדונו.

מורפולוגית ופונקציונלית הערכה של הסרט סינפסות בתדר ספציפי אזורים של העכבר שבלול

כאן, אנו מציגים שיטה להמחיש את ספיגת 3 kda טקסס אדום התווית תוספי בתאי שיער שמיעתי עם ערוצי מכניזציה תפקודית. בנוסף, דקסטר של 3 – 10 kDa ניתן להשתמש כדי ללמוד endocyציטוזה בתוך השיער והתאים התומכים של האיבר של Corti.

תיוג דקטרן וספיגת בתאי שיער מורורין בשידור חי ופונקציונלי

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור מיקרוסקופיית מוליכת היונים של בדיקה מקפיצה (HPICM), טכניקת בדיקה סריקה ללא מגע המאפשרת הדמיה ננומטרית של חבילות סטריאציליה בתאי שיער שמיעתיים חיים.

הדמיית חבילת סטריאוסיליה ברזולוציה ננומטרית בתאי שיער שמיעתיים של יונקים חיים

מוצג פרוטוקול לעיבוד שבלול גרביל צעיר ומזדקן על ידי סימון חיסוני של המבנים הסינפטיים ותאי השערה האפרנטיים, מרווה אוטופלואורסצנטיות ברקמה מזדקנת, ניתוח והערכת אורך השבלול, וכימות הסינפסות בערימות תמונה המתקבלות בהדמיה קונפוקלית.

סינפסות סרט אימונו-לבלים וספירתם בשבלול גרביל הצעיר והזקן

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מודל עכבר של ליקוי שמיעה הנגרם על ידי רעש (NIHL). כדי ליצור את NIHL, פיתחנו מכשיר חדש ופשוט העשוי מפלסטיק גלי, כלוב מלכודת חולדות ורמקול. תגובת גזע המוח השמיעתי והדמיית אימונופלואורסצנטיות שימשו להערכת תפקוד השמיעה והנזק לתאי השערה החיצוניים, בהתאמה.

תנאי ניסוי מותאמים לאובדן שמיעה כתוצאה מרעש בעכברים והערכת תפקוד השמיעה ונזק לתאי השערה החיצוניים

למד הדמיה תלת-ממדית של השבלול באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור ללא הרס מכני. שיטה זו מאפשרת הערכת שינויים פתולוגיים באיברי השמע וביולוגיה של מערכת השמע.

הדמיה של השבלול המזדקן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור

גלה סרטונים נוספים