Name: דיסקציה של צינור המרה החוץ-כבדי וכיס המרה בניודים של עכברים בני תשעה ימים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: למדו פרוטוקול ניתוח מפורט של מערכת המרה החוץ-כבדית בעכברים נאונטליים בני תשעה ימים. השיטה מאפשרת הסרה אטראומטית של תאים מזהמים ומשפרת השוואתיות בין מחקרים על מחלות צינור המרה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים ליוהנה האגנס, פאולין שופרט, קלרה פיליפי, PD ד"ר כריסטיאן טומושאט, סווניה וורנקה, PD ד"ר דיאנה לינדנר, פרופ' ד"ר דירק וסטרמן, מרים טומצ'אק, ניקול לודר, נדין קורזאווה, ד"ר לאיה פייג'רולס רלוי, בירגיט אפל ומגדלנה טרוצ'ימיוק על תרומתם. הנס כריסטיאן שמידט נתמך כספית על ידי מלגת iPRIME של קרן אלזה קרנר פרסניוס (2021_EKPK.10), UKE, המבורג.

לאחר אישור אתי (N045/2021), נצפו יילודים של עכברים זכרים ונקבות C57BL/6 עד גיל 9 ימים. בעלי החיים נולדו וסופקו למטרות ניסוי על ידי מתקן החיות של המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג-אפנדורף, המבורג, גרמניה. היילודים שוכנו בכלוב יחד עם חיות האם שלהם. התנאים הסביבתיים היו מבוקרים בטמפרטורה (20-24 מעלות צלזיוס), מחזור אור-חושך של 12:12, ולחות יחסית של 40%-70%.
1. הכנה ניסיונית
<ol><li>הכינו את הציוד הנדרש לפעולה כירורגית, כולל מספריים, מלקחיים וכו' (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>הניחו מכשירים מחוטאים ואוטומטיים על משטח סטרילי ליד שולחן הניתוחים.</li>
	<li>הרדימו עכבר יילודים בגיל P9 במהירות על ידי עריפת ראשו באמצעות מספריים פועלים. מניחים את גופו של עכבר היילוד המומת על שדה ניתוח סטרילי. נתחו את ה-EBDS בפגי עכברים בני 9 ימים (שלב 5). הערה: הליך הנתיחה המתואר נותן לכל מדען את הכלים המתאימים להסרת ה- EBDS מעכברים ילודים ומבוגרים יותר. ככל שהעכבר ישן יותר, כך ההכנה קלה יותר.</li>
</ol>2. גישה לחלל הצפק
<ol><li>לתפוס את העור מעל המיקום של שלפוחית השתן עם מלקחיים. חותכים חור בקוטר 2 מ"מ לתוך העור באמצעות מספריים, מבלי לפגוע בצפק ובמבנים שמתחתיו. הרחב את החתך למיקום העריפה, בעקבות קו בית השחי הקדמי השמאלי. הסר את העור מצד שמאל לצד ימין עם מלקחיים atraumatic.</li>
	<li>תפסו את הצפק המקיף את הטחול. מרימים אותו בעדינות עד שהצפק דומה למבנה דמוי אוהל וחותכים חור בקוטר 1 מ"מ במרכז. המתן עד ש"אוהל הצפק "יתמלא באוויר. השתמש בהגדלה מיקרוסקופית של 10x עבור שלב זה והשלבים הבאים.</li>
	<li>חותכים את הצפק בחלון הממוסגר על ידי הצלעות התחתונות, הן אזורי הבטן הצדדיים והן אזור שלפוחית השתן התחתונה כדי להבטיח גישה מלאה לכבד, למערכת צינורות המרה, לקיבה, למעי הדק ולמעי הגס. הערה: כדי לשפר את הגישה לכבד, ניתן לבצע חתך נוסף, הסרת שלוש הצלעות הנמוכות ביותר תוך השארת התהליך הקסיפואידי, הרצועה הזיפית, הכבד ומבני צינור המרה ללא פגע. קל להשיג את הנוף של הכבד.</li>
</ol>3. בדיקת כיס המרה וצינורות המרה
הערה: הקפידו לשמור על הדגימה רטובה על בסיס קבוע במהלך כל השלבים הבאים.
<ol><li>בזהירות למשוך את תהליך xiphoid במצב cranioventral כדי לבחון את כיס המרה. הערה: המתח על הרצועה המזויפת עולה עם תנועה זו, וכיס המרה המחובר הופך גלוי.<ol><li>בצע רק משיכה קלה כדי למנוע קריעה בלתי נשלטת של הרצועה falciform, אשר עלול להוביל לקרע כיס המרה ממערכת צינור המרה. שחרר את המשיכה של תהליך xiphoid לפני השלב הבא.</li>
	</ol></li>
	<li>משכו בעדינות את התריסריון כלפי מטה כדי לשחרר את מערכת צינורות המרה. הערה: ככל שהמתח ברצועה הפטודואודנלית עולה, רקמת צינור המרה הופכת לגלויה.</li>
</ol>4. כריתה של גוש
<ol><li>בצע את ההתגייסות הנמוכה יותר בגוש בהתאם לשלבים הבאים.<ol><li>זהה את הפפילה של התריסריון, המחברת את מערכת צינורות המרה לתריסריון.</li>
		<li>חותכים דרך התריסריון כ -2 ס"מ מהצד הימני הצדדי של הפפילה.</li>
		<li>חותכים דרך האזור הפילורי. ודא כי תוכן הקיבה נמצאים באזור פילורי בין מיקום החיתוך לבין פפילה התריסריון. הערה: זהו צעד חשוב לאבטחת התמצאות מאוחרת יותר עבור המיקום הנכון של חלקי התריסריון האוראליים והאוראליים.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע את גיוס הגוש העליון.<ol><li>משכו בעדינות את התהליך הקסיפואידי וקבלו גישה לרצועה המזויפת.</li>
		<li>בצע חתך באורך 1 ס"מ דרך הרצועה falciform, קרוב ככל האפשר לתהליך xiphoid, בין כיס המרה לבין תהליך xiphoid. הקפד לא לפגוע בכיס המרה.</li>
		<li>חותכים את המבנים המקשרים הבאים בין הכבד לבית החזה: הוושט, הווריד הנבוב התחתון, אבי העורקים החזי, כל הרצועות המקיפות את האזור החשוף של הכבד, וכל קשרי הרקמות שנותרו באופן דורסלי. הערה: דגימת en-bloc מנותחת לחלוטין. הוא מכיל את הכבד, מערכת צינור המרה, ואת קורפוס התריסריון, אשר מחובר עם האזור הפילורי של הבטן.</li>
	</ol></li>
</ol>5. דיסקציה סופית של כיס המרה וצינור המרה
<ol><li>בצע את ההכנה ברוטו לפי השלבים הבאים.<ol><li>הניחו את דגימת הגוש על כרית קצף המשמשת בדרך כלל להתייבשות. השתמש בהגדלה מיקרוסקופית של 20x ובשני מלקחיים א-טראומטיים מיקרו-כירורגיים עם גודל קצה מרבי של 6 מ"מ עבור שלב זה והשלבים הבאים.</li>
		<li>הרכיבו את הדגימה על כרית הקצף. ארגן מחדש את הדגימה במיקום האנטומי הנכון. משטחים את החלק האוראלי והאבראלי של התריסריון, מבצעים תנועה עדינה.</li>
		<li>התחל את התנועה בפפילה התריסריון והמשיך לקצוות החיתוך באמצעות מלקחיים א-טראומטיים. להחליק את התוכן עיסתי לבן של הבטן, אשר יתרחש רק בחלק האוראלי של התריסריון. הקפידו לזהות את החלק האוראלי ואת החלק האבראלי של התריסריון כדי לשלול סיבוב סביר של צינור המרה.</li>
		<li>חותכים שרידים גדולים של רקמת הכבד כדי להתחיל דיסקציה של צינור המרה.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע את הבידוד הסופי.<ol><li>לחצו בעדינות את רקמת הכבד הנותרת לתוך הנקבוביות של מחצלת הקצף. ודא שתנועות הגירוד מתחילות ממערכת צינורות המרה ומובילות לגבולות הכבד.</li>
		<li>העבירו את הדגימה למצב נקי יותר על שטיחון הקצף לאחר מספר תנועות גירוד בכיוונים שונים. השתמש ביתרון של רקמת כבד פחות דחוסה ברקע כדי למטב את התצוגה להבחנה הטובה ביותר האפשרית בין EBDS לתאים לא רצויים. מגרדים את רקמת הכבד מצינור המרה עד שלא נותר דבר, או מעט ככל האפשר, של רקמת הכבד.</li>
		<li>מעבדים את הרצועה ההפטודואודנלית עד שנשאר ה-EBDS המבודד. הסר כלי דם תוך ליגמנטליים כמו עורק הכבד, וריד הפורטל ושרידים קטנים. הסר נימה עדינה זו, עם משיכה עדינה וטיפול גבוה, לצד שמאל לרוחב. ייתכן ששלב זה של דיסקציה כבר החל שלא במתכוון או בחלקו במהלך ההסרה הקודמת של רקמת הכבד, מה שבסופו של דבר מוביל לאותה תוצאה. הערה: כלי הדם מתגלים כחוט לבן ועדין מאוד כ-3-5 מ"מ דרך הפה של הפפילה בתריסריון ומצטרפים לרצועה ההפטודואודנלית מצד שמאל לרוחב, המצטברים עם צינור המרה לשלישייה הגליסונית. עם השלמת שלב זה, המדגם הסופי מבודד לחלוטין. אם יש צורך ברשומה, ניתן לצלם תמונות לאחר ארגון מבני צינורות המרה למקומם האנטומי (איור 1). מומלץ לבצע את שלבי ההכנה האחרונים על מחצלת קצף מכיוון שהדגימה לא תידבק כל כך לפני השטח של שדה הניתוח. אם הנקבוביות רטובות, צינור המרה מרחף או צף. בעת הזזת הדגימה, היא לא תידבק בחוזקה כפי שהייתה עושה עם הכנה על בד הניתוח, וכתוצאה מכך לא תיקרע בעת הזזת הדגימה.</li>
	</ol></li>
</ol>6. הכנה לניתוח היסטולוגי
<ol><li>שים את הדגימה המבודדת בתמיסה חצויה, מדיום מיוחד או קיבועים המכילים פורמלין (ראה טבלת חומרים) בהקדם האפשרי לאחר הנתיחה.</li>
	<li>בחר פתרון אחסון מתאים בהתאם לשלבי עיבוד מתוכננים נוספים. אזהרה: יש להשתמש בחומרים מקבעים המכילים פורמלין רק מתחת לפתח האוורור בגלל רעילות חריפה, קורוזיביות וסכנות בריאותיות מגוונות. הערה: במחקר המוצג, דגימות ה-EBDS הוכנסו לפרפורמלדהיד, התייבשו והוטמעו בפרפין. הם אוחסנו בטמפרטורת החדר והתקררו לפני החתך. בארון חימום, פרוסות 2 מיקרומטר נשמרו למשך הלילה והוכתמו באמצעות המטוקסילין קונבנציונאלי ואאוזין4 (ראו טבלת חומרים).</li>
</ol>

<ol><li>Liwinski, T., Schramm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prim%C3%A4r+sklerosierende+Cholangitis%5BTitle%5D)+AND+%22Der+Internist%22%5BJournal%5D)">Primär sklerosierende Cholangitis.</a> Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).</li>
<li>Kobayashi, H., Stringer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Neonatology%22%5BJournal%5D)">Biliary atresia.</a> Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).</li>
<li>Patman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tract%3A+Newly+identified+biliatresone+causes+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369(2015).</li>
<li>Mack, C. L., Sokol, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+pathogenesis+and+etiology+of+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia.</a> Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).</li>
<li>Karjoo, S., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neonatal+extrahepatic+cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51621(2014).</li>
<li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+normal+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%3A+Advances+in+Integrative+Anatomy+and+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of normal bile ducts.</a> The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).</li>
<li>Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructure+and+development+of+the+normal+and+pathologic+biliary+tract+in+humans%2C+including+blood+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply.</a> Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).</li>
<li>Banales, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocyte+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Cholangiocyte pathobiology.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).</li>
<li>de Buy Wenniger, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cholangiocyte+glycocalyx+stabilizes+the+%27biliary+HCO3-+umbrella%27%3A+an+integrated+line+of+defense+against+toxic+bile+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases%22%5BJournal%5D)">The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the 'biliary HCO3- umbrella': an integrated line of defense against toxic bile acids.</a> Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).</li>
<li>Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+inflammation+and+proinflammatory+cytokines+in+cholangiocyte+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).</li>
<li>Khandekar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+development+of+the+mouse+extrahepatic+bile+duct%3A+Implications+for+neonatal+susceptibility+to+biliary+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury.</a> Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).</li>
<li>Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-purity+myenteric+plexus+from+adult+human+and+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9226(2015).</li>
<li>Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li>
<li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Liver%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li>
<li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).</li>
<li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+and+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

מאמר זה דיווח ודן ביצירה ואימות של גישה כירורגית חדשה להסרת EBDS של עכברי ילודים מורדמים. ממצאים מיקרוסקופיים והיסטולוגיים מגלים כי הגישה מזהה במהירות EBDs ומנתחת אותם בסמוך לשולי הצינור, אפילו בעכברים ילודים. רק כלי ניתוח ומיקרוסקופ עם הגדלה של 20x נדרשים לפרוטוקול המתואר. יתר על כן, הגישה מאפשרת בידוד של כל ה- EBDS. הטכניקה יעילה ביותר, פשוטה ופשוטה לשכפול.
עבור המחקר של מחלות צינור המרה כגון אטרזיה המרה, PSC, ו PBC, מיצוי מכני של כל מערכת צינור המרה נדרש לעתים קרובות. בגלל הגודל הקטן, במיוח...

ההתחלה וההתקדמות של כולנגיופתיות כגון אטרזיה מרה, כולנגיטיס סקלרוזית ראשונית (PSC), וכולנגיטיס מרה ראשונית (PBC) אינן ידועות או לא שלמות 1,2. ההבנה המוגבלת של מקורן והתקדמותן של מחלות אלה מובילה למיעוט אפשרויות הטיפול3. המכשול הקשה ביותר בחקר הפרעות בצינור המרה של ילודים הוא השגת הבנה מולקולרית של הפתופיזיולוגיה. אחד המפתחות החיוניים להבנה טובה יותר של הפתולוגיה המולקולרית הוא התצפית הטובה ביותר האפשרית על רקמות מושפעות. כדי למנוע השוואה מופחתת ופערים בין מחקרים, כגון התבוננות באטיולוגיה ויראלית פוטנציאלית של אטרזיה מרה4, מתעורר הצורך בהכנה הטובה ביותר האפשרית ושיתוף של טכניקות הדיסקציה שבוצעו. הכנה טהורה של רקמת המטרה נחוצה למחקרים מיקרוסקופיים מאוחרים יותר או לגידול תרביות אורגנואידיות תלת-ממדיות ותלת-ממדיות. עם זאת, בהפרעות ילודים מורין, דגימות רקמות הן נדירות ומתרחשות רק בכמות קטנה בשל גודל קטן מאוד. לגבי הפרעות בצינור המרה, תוארו קשיים בהכנה נקייה של צינורות המרה בילודים מורין5. בשל שלב ההתפתחות של היילודים, התמיינות הרקמות אינה מתקדמת יתר על המידה, מה שמסבך את ההכנה ומגביר את הקושי בהשוואה להכנת דגימות בוגרות. לכן, קבוצת העבודה התפעולית חקרה אסטרטגיה חדשנית להכנת ה- EBDS במודל עכבר יילודים. במחקר הנוכחי, הטכניקה מאפשרת ניתוח יעיל של כל דגימה.
מערכת צינור המרה ממוקמת באופן תוך-צפקי בבטן העליונה הימנית, הנובעת מהכבד. כיס המרה ממוקם מתחת לפני השטח הקרביים של האונה הימנית של הכבד. צינור המרה, יחד עם וריד הפורטל ועורק הכבד, מוטבע ברצועת ההפטודודנל. הוא מחבר את הכבד ואת התריסריון ישירות ומנקז נוזל מרה לתוך התריסריון6. מבחינה אנטומית, צינור המרה מחולק לצינורות הכבד הימניים והשמאליים, צינור הכבד המשותף, הצינור הציסטי, ודוקטוס choledochus, אשר נוצר על ידי מפגש של צינור ציסטי ואת צינור הכבד המשותף7. זה בסופו של דבר מרוקן נוזל מרה ורוק מצינור הלבלב לתוך התריסריון דרך אמפולה של Vater.
כולנגיוציטים מרפדים את צינור המרה באופן תוך-הפטי וחוץ-הפטי, ושוכנים בנישה אנטומית מסובכת שבה הם מסייעים בייצור מרה ובהומאוסטזיס8. נוזל המרה עובר את תאי האפיתל המתמחים האלה בריכוזים גבוהים מדי יום. בפרט, תחזוקת מטריית HCO3 חשובה מאוד להגנה מפני רעילות חומצת מרה9. Cholangiocytes הם קו ההגנה הראשון במערכת hepatobiliary נגד, למשל, מיקרואורגניזמים luminal10. יעילות ההגנה של כולנגיוציטים מפני התקפות רעילות עלולה להיחלש על ידי נטייה גנטית. עומס יתר רעיל גורם לנזק והרס ולכן יכול להוביל לכולנגיופתיות. יתר על כן, צינור המרה המתפתח אינו מסוגל לחלוטין לכל מנגנוני ההגנה העצמית, מה שמוביל לרגישות גבוהה יותר לרעלנים סביבתיים בצינורות המרה היילודים11.

<table><tbody><tr><td>2-פרופנול</td><td>CHEMSOLUTE</td><td>11365000</td><td>משמש כחומר ייבוש</td></tr><tr><td>30 גרם צינורית</td><td>B בראון/סטריקן, Melsungen גרמניה</td><td>4656300</td><td>צינורית להידרציה של הדגימה</td></tr><tr><td>פתח אוורור</td><td>C + P M&ouml; belsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, גרמניה</td><td>Tec-Ononmic AZ 1200</td><td>השימוש בפתח אוורור מסייע במניעת שאיפת מקבעים המכילים פורמלין</td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia Braun</td><td>B Braun, Melsungen, Germany</td><td>2351744</td><td>מלח; מיכל: Mini-Plasco connect, 20 x 10 מ"ל, סטרילי</td></tr><tr><td>מלקחיים מיקרוכירורגיים גדולים יותר</td><td>DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland</td><td>FD253R</td><td>ישר, 180 מ"מ (7 אינץ'), קצה פלטפורמה, ידית עגולה, רוחב: 0,800 מ"מ, מצופה אבק יהלום, לא סטרילי, כלי אופציונלי לשימוש חוזר לתצפית וכל שלב בהכנה למעט הכנה סופית מאוד; חילוק העור של מצלמת הצפק</td></tr><tr><td>" SmartCAM 5 אינץ' &nbsp;</td><td>Basler and Vision Engineering, Send, בריטניה</td><td>EVC131A</td><td>מודול מצלמת Lynx Exo אופציונלי: חיישןסוג: CMOS, רזולוציה 2560 x 1920 פיקסלים, גודל חיישן: 1/2 אינץ'; משמש להפקת וידאו והערכה טכנית</td></tr><tr><td>מכונת התייבשות/מעבד רקמות מצודה 2000</td><td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, גרמניה</td><td>12612613</td><td>משמש להתייבשות אוטומטית, תוכנית קצרה (כ-4.8 שעות)</td></tr> <tr><td>ספוג התייבשות&nbsp;</td><td>קארל רוט, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>ספוג TT56.1</td><td>לשלב חיתוך סופי, ספוגים / רפידות קצף אחרות בגודל נקבוביות מינימלי של 60 נקבוביות לאינץ' מתאימות גם הן, מומלץ להשתמש בשתי רפידות קצף לכל קלטת הטבעה כדי לכסות את הדגימה מלמטה ומלמעלה כדי למנוע החלקה דרך ניקוב קלטות ההטמעה</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>לא חריף; מכיל קלזיום או מגנזיום, 500 מ"ל</td></tr><tr><td>קלטות הטמעה</td><td>Engelbrecht GmbH, Ederm&uuml; nde, גרמניה</td><td>17990</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, גרמניה</td><td>41-6660-00</td><td>פתרון מכתים, מוכן לשימוש</td></tr><tr><td>מספריים עדינים CeramaCut</td><td>FST, היידלברג גרמניה</td><td>14959-09</td><td>טיפים: חד-חד, סגסוגת / חומר: נירוסטה מצופה קרמיקה, משונן:, כן; תכונה: CeramaCut, צורת קצה: ישר, קצה חיתוך: 22 מ"מ, אורך: 9 ס"מ; חתך בעור, חתך של חלון הצפק</td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>FST, היידלברג גרמניה</td><td>11051-10</td><td>אורך: 10 ס"מ, צורת קצה: מעוקל, משונן, רוחב קצה: 0.8 מ"מ, מידות קצה: 0.8 x 0.7 מ"מ, סגסוגת / חומר: נירוסטה</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, גרמניה</td><td>41-5130-00</td><td>תמיסת מכתים, מוכן לשימוש</td></tr><tr><td>הנדסת ראייה במיקרוסקופ Highresolotion</td><td>, שלח בריטניה</td><td>EVO503&nbsp;</td><td>מסוגל להגדיל עד פי 60, נעשה שימוש בהגדלה של פי 6 עד פי 20 בלבד.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס אופטי ושות', בע"מ, המבורג, גרמניה</td><td>BX60F5</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מיקרוסקופ Glases</td><td>Marienfeld, Lauda-K&ouml; nigshofen, גרמניה</td><td>101244</td><td>60 מ"מ רוחב, עשוי SCHOTT D 263 זכוכית</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, גרמניה</td><td>03-0060</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica, Nu&szlig; לוך, גרמניה</td><td>SM2010R</td><td>כלי לחיתוך (2 ומיקרו; פרוסות m)&nbsp;</td></tr><tr><td>מזרק Omnifix-F 1 מ"ל</td><td>B בראון, Melsungen, גרמניה</td><td>מזרק 9161406V</td><td>ללא צינורית</td></tr><tr><td>פרפין</td><td>Sakura Finetec, טורנס, ארה"ב</td><td>4511</td><td>Tissue-Tek פרפין שעוות Tek III, ללא</td></tr><tr><td>מכונת הטמעת פרפין</td> DMSO <td>MEDITE Medical GmbH, בורגדורף, גרמניה</td><td>TES 99</td><td>מכונת ההטבעה ששימשה במחקר זה הכילה את שלושת המודולים הבודדים הבאים: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. יש להטמיע את הדגימה בפרפין מיד לאחר ההתייבשות, אין לבצע אחסון ביניים במקרר עקב התכווצות אפשרית ולחות במקרר</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td> <td>Morphisto</td><td>1176201000</td><td>הכן 1 מ"ל Aliquots בצינורות חרוטיים של 2 מ"ל Eppendorf לדגימות כבד ו-0.5 מ"ל Aliquots בצינורות חרוטיים של 1 מ"ל Eppendorf לדגימות דרכי מרה חוץ-כבדיות, 4% ב-PBS ph 7.4&nbsp;</td></tr><tr><td>מלקחיים מיקרוכירורגיים קטנים&nbsp;</td><td>EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), B&uuml; tthard, באיירן, גרמניה</td><td>(00)165</td><td>ידית עגולה, ישרה, קצה 0.3 מ"מ, כלי לתצפית וכל שלב של הכנה, שימושי במיוחד בהכנה סופית</td></tr><tr><td>סרגל נירוסטה</td><td>Agntho's AB, Liding&ouml;, שוודיה</td><td>30085-15</td><td>150 מ"מ עם מטרי & מספריים כירורגיים של סיום הלימודים</td></tr><tr><td>אינץ '&ndash; חד-קהה לעריפת ראש</td><td>FST, היידלברג גרמניה</td><td>14001-14</td><td>מכשיר לעריפת ראש</td></tr><tr><td>ארון התחממות</td><td>Haraeus, Hanau, Germany</td><td>T 6060</td><td>יש לשמור את הדגימות הפרוסות בארון החימום כדי להבטיח את הצמדת הדגימה לשקופיות המיקרוסקופ</td></tr></tbody></table>

דיסקציה של צינור המרה החוץ-כבדי וכיס המרה בניודים של עכברים בני תשעה ימים

Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates

כריתה של צינורות מרה ילודים מורין תוארה כקשה. המטרה העיקרית של הליך ההפעלה הסטנדרטי המתואר היא בידוד של צינור המרה החוץ-כבד (EBD) ביילודים של עכברים מבלי לפגוע בצינור המרה במהלך ההכנה. בגלל ההכנה הקרובה במיוחד שלה בהשוואה לקו התאים של כולנגיוציטים וקציר של כל מערכת צינורות המרה החוץ-כבדיים (EBDS), הגישה המתוארת שימושית ביותר בחקר מודלים של בעלי חיים של הפרעות בצינור המרה של יילודים, כגון אטרזיה של המרה. לאחר המתת חסד, חלל הצפק היה גישה, ואת מערכת צינור המרה, התריסריון, ואת הכבד חולצו עם הייחודי En-bloc-Reduct (EbR). הדגימה המופקת מונחת על מחצלת קצף, וה- EBD מנותח מתאים מזהמים באופן אטראומטי ללא מגע הכרחי. ניתוח של EBDS כולו הוא יתרון משמעותי של שיטה זו. יש לנקוט משנה זהירות בשל הגודל הקטן והכמות של רקמת צינור המרה. באמצעות הטכניקה המתוארת, אין נזק cholangiocytes. יתר על כן, טוהר הטכניקה ניתן לשחזור (n = 10). לכן, ניתן לקצור דגימות דומות באופן אופטימלי. יתר על כן, אף רקמת צינור המרה אינה נפגעת, מכיוון שניתן להימנע מכל מגע עם מערכת צינור המרה במהלך ההכנה, ולהשאיר את נוזל המרה בתוך כיס המרה. והכי חשוב, בעת ביצוע כיס המרה הסופי ודיסקציה של צינור המרה, מיקרו-מכשירים א-טראומטיים שימשו רק מעט לרוחב צינור המרה מבלי לסחוט אותו. זהו המפתח למדגם נקי ושלם, וחיוני לחקירה היסטולוגית נוספת או לבידוד של כולנגיוציטים. לסיכום, טכניקת הדיסקציה החדשנית המתוארת מאפשרת למפעילים חסרי ניסיון במיוחד עם הציוד הדרוש לבודד את ה- EBDS בצורה נקייה ככל האפשר.

איור 1A מראה את ה-EBDS של יילוד מורין, אשר נותח בטכניקה המתוארת. מבחינה מיקרוסקופית, לא נראית רקמת כבד נוספת. רקמת הכבד הוסרה בשלבי הבידוד הסופיים של הפרוטוקול וניתן היה להבחין בה בקלות מרקמת צינור המרה לגבי צבע ועקביות. איור 1B מציג את הדגימה המבודדת בהשוואה לקנה מידה מילימטרי. אורך ה-EBD (הנמדד מכיס המרה ועד פפילה בתריסריון) הוא פחות מ-10 מ"מ. הקוטר של דוקטוס choledochus עדין מאוד נע בין 0.05-0.2 מ"מ. איור 2 מתאר צביעה המטוקסילין-...

לתצפית על הפרעות בצינור המרה של מורין, נדרש צינור מרה שלם והכנה יעילה. לכן, גישה חדשה לבידוד כל מערכת צינורות המרה החוץ-כבדיים ביילודים מורין פותחה בהצלחה תוך שמירה על שלמות צינור המרה.

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation ...

דיווחים רבים שבחנו את מערכת המרה החוץ-כבדית דיווחו כי הם השיגו את הדגימות אך לא את האופן שבו השיגו אותן, מה שהעלה סוגיות לגבי יכולת ההשוואה. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי כל מערכת המרה extrahepatic ניתן לנתח תאים מזהמים ניתן להסיר atraumatically. פרוטוקול הנתיחה שלנו יכול להיות מיושם באופן כללי על גישות ניסיוניות העובדות על הפרעות בצינור המרה של ילודים, במטרה לנתח את מערכת המרה החוץ-כבדית.תכונות מסוימות של הפרוטוקול, למשל, השארת הקיבה מחוברת לתריסריון, עשויות להיות שימושיות במחקר של אטרזיה של התריסריון כדי לאפשר התמצאות נכונה על ידי החלב המעוכל חלקית המתבטא על ידי הקיבה. בהתחלה, הטכניקה עשויה לדרוש קצת זמן לאימון. תרגול ומעקב אחר הגישה שלב אחר שלב יגבירו את המהירות והתוצאה.כדי להתחיל, הניחו את המכשירים המחוטאים והאוטומטיים על משטח סטרילי ליד שולחן הניתוחים. לאחר ביצוע חתך בצפק, להרחיב את החתך למיקום של decapitation, בעקבות קו בית השחי הקדמי השמאלי. הסר את העור מצד שמאל לצד ימין עם מלקחיים א-טראומטיים.תחת מיקרוסקופ, החזיקו את הצפק המקיף את הטחול. מרימים אותו בעדינות עד שהצפק דומה למבנה דמוי אוהל, וחותכים חור של מילימטר אחד במרכז. המתן עד שאוהל הצפק יתמלא באוויר.חותכים את הצפק בחלון ממוסגר על ידי הצלעות התחתונות, הן אזורי הבטן הצדדיים, והן אזור שלפוחית השתן התחתונה. הקפידו על גישה מלאה לכבד, למערכת צינורות המרה, לקיבה, למעי הדק ולמעי הגס. בחן את כיס המרה ואת צינורות המרה על ידי משיכת בזהירות את תהליך xiphoid במצב גחון גולגולתי.הימנע קריעה של הרצועה falciform שיכול להוביל לקרע של כיס המרה ממערכת צינור המרה. לאחר מכן, שחרר את המשיכה של תהליך xiphoid. משכו בעדינות את התריסריון כלפי מטה כדי לשחרר את מערכת צינורות המרה.לאחר מכן, בצע את גיוס ה- En-bloc התחתון על ידי זיהוי הפפילה של התריסריון, המחברת את מערכת צינורות המרה לתריסריון. חותכים דרך התריסריון כשני סנטימטרים לצד הימני הצדדי של הפפילה. לאחר מכן, חותכים דרך האזור הפילורי.ודא כי התוכן של הבטן נמצאים באזור פילורי בין מיקום החיתוך לבין פפילה התריסריון. כדי לבצע את גיוס הגוש העליון, משוך בעדינות את התהליך הקסיפואידי וקבל גישה לרצועה המזויפת. בצע חתך של סנטימטר אחד דרך הרצועה falciform בין כיס המרה קרוב לתהליך xiphoid.חותכים את המבנים המחברים בין הכבד לבית החזה, כגון הוושט, הווריד הנבוב התחתון, אבי העורקים החזי וכל הרצועות המקיפות את האזור החשוף של הכבד. כמו כן, חתכו את כל חיבורי הרקמות שנותרו בגב. בהגדלה מיקרוסקופית של פחות מפי 20, הנח את דגימת ה-En-bloc על משטח קצף.הרכב את הדגימה על ידי ארגון מחדש שלה במיקום האנטומי הנכון. באמצעות תנועה עדינה, לשטח את החלק האוראלי והאוראלי של התריסריון. באמצעות מלקחיים א-טראומטיים, מתחילים את תנועת ההשטחה בפפילה של התריסריון וממשיכים לקצוות החנית.לאחר מכן, להחליק את תוכן עיסת לבן של הבטן בחלק האוראלי של התריסריון. זהה את החלק האוראלי ואת החלק האבורי של התריסריון כדי לשלול סיבוב סביר של צינור המרה. חותכים שרידים גדולים של רקמת הכבד לפני ניתוח צינור המרה.לאחר מספר תנועות גירוד, העבירו את הדגימה למיקום נקי יותר על משטח הקצף. השתמש ברקמת הכבד הפחות דחוסה ברקע כדי למטב את התצוגה להבחנה בין EBDS לתאים לא רצויים. מעבדים את הרצועה ההפטודואודנלית עד שנשאר ה-EBDS המבודד.שימו לב לעורק הכבד ולווריד הפורטל הנובעים כחוט לבן ועדין מאוד, כשלושה עד חמישה מילימטרים דרך הפה מהפפילה של התריסריון. בזהירות, הסר את החוט העדין הזה באמצעות משיכה עדינה לצד שמאל לרוחב. ודא שתנועות הגירוד מתחילות ממערכת צינורות המרה ומובילות לגבולות הכבד.באמצעות פרוטוקול זה, EBDS נותח מילודים בני תשעה ימים. אורך ה-EBDS המבודד מכיס המרה לפפילה של התריסריון היה פחות מ-10 מילימטרים, וקוטרו של הדוקטוס צ'ולדוכוס העדין נע בין 0.05 ל-0.2 מילימטרים. צביעת Hematoxylin eosin בוצעה על קטע האורך של ה- EBDS עם לומן פתוח.הכולנגיוציטים זוהו סביב הלומן כמונולייר ונצבעו כהים יותר. חוקרים צריכים לשתף ולתקנן טכניקות הפעלה כגון פרוטוקולי דיסקציה והזרקה כדי לשפר את יכולת ההשוואה והשימושיות המהירה של המחקרים והתוצאות שלהם. דיסקציה מוקדמת תהיה יתרון עבור גישות היסטולוגיות וחד-תאיות, כגון בידוד של תוך-תאי וחוץ-פרי-כולנגיוציטים, משום שהיא גורמת להפחתת זיהום תרביות תאים.

extrahepatic-bile-duct-gall-bladder-dissection-nine-day-old-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מתאר את ההליך ליצירת מודל עכבר עם דלקת לבלב חריפה באמצעות עירוי לבלב של נתרן טאורוכולט. מודל זה מסייע ללמוד שינויים פתופיזיולוגיים המושרים על ידי נתרן taurocholate בלבלב.

מודל דלקת לבלב מרה חריפה: שיטה ליצירת מודל עכבר של דלקת לבלב חריפה באמצעות עירוי צינור הלבלב

טכניקה לבודד cholangiocytes מצינורות המרה extrahepatic של עכברים בילוד מתוארת. הצינורות בקפדנות הם גזורים, ולאחר מכן תאים מבודדים על ידי תולדה בג'ל קולגן העבה. שיטה זו מספקת כלים שימושיים ללימוד פיתוח extrahepatic מרה צינור ופתולוגיה.

בידוד של ילודים extrahepatic Cholangiocytes

הפרעה בזרימת המרה גורמת לפגיעה דלקתית חמורה בכבד כולסטטי עם רצף אופייני תלוי זמן של שינויים מורפולוגיים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לקשירה כירורגית של צינור המרה המשותף בעכברים המאפשר לגרום לתגובה פיברוטית חזקה לאחר 21 עד 28 יום.

מרה Duct קשירת בעכברים: אינדוקציה של דלקת כבד פגיעה ופיברוזיס ידי חסימתית cholestasis

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת פגיעת דחיסת חוט שדרה (SCI) הניתנת לשחזור בעכבר היילוד. המודל מספק פלטפורמה מועילה לחקר מנגנונים של פלסטיות אדפטיבית העומדים בבסיס התאוששות תפקודית ספונטנית.

חוט השדרה עכבר בילוד דגם פגיעה דחיסה

כלים לאבחן ספיגה של חומצות מרה למדוד תחבורה חומצות מרה in vivo מוגבלים. גישה חדשנית בבעלי חיים מתוארת אשר מנצלת פרוטון משולב (1 H) בתוספת פלואור (19 F) תהודה מגנטית; יש שיטה חדשנית זו פוטנציאל translational למסך ספיגה של חומצות מרה בפרקטיקה הקלינית.

שימוש רב-פלואור מרת חומצות<em&gt; In vivo</em&gt; דימות תהודה מגנטית כדי למדוד חומצות מרה התחבורה

כאן, אנו מציגים את צינור המרה חלקית מצדו כמודל כירורגי של פגיעה בכבד והתחדשות בחולדות.

צינור המרה חלקית מצדו העכבר: מודל מבוקרת של מקומי חסימתית לחסימת מרה תוך כבדית

מאמר זה מתאר בפירוט שיטה המבוססת על סילבר חלקיקים עבור ameliorating בהכנת בכיס המרה תסמונת במודל עכבר ניסיוני בהכנת בכיס המרה. הבנה עמוקה של תהליך הכנה ריאגנט ואת טכניקת ההזרקה neonatal העכבר יסייע להכיר חוקרים השיטה שבה נעשה שימוש במחקרים דגם העכבר neonatal.

שיטת ננו-חלקיק כסף Ameliorating בהכנת בכיס המרה תסמונת בעכברים

אנו מציגים שיטה פשוטה למדי ורגיש לקוונפיקציה מדויקת של צפיפות צינור המרה בכבד העכבר. שיטה זו יכולה לסייע בקביעת ההשפעות של מכפילי גנטי וסביבתי ואת האפקטיביות של טיפולים פוטנציאליים מודלים העכבר של מחלות המרה.

קביעת צפיפות צינור המרה בכבד העכבר

נמק enterocolitis (NEC) היא המחלה הקשה ביותר במערכת העיכול (GI) המתרחשת לעתים קרובות אצל פגים, במיוחד תינוקות במשקל לידה נמוך מאוד, עם תמותה גבוהה ופתוגנזה לא ברורה. הגורם ל- NEC עשוי להיות קשור לחריגות במערכת הרגולציה החיסונית הדלקתית. מודל בעלי חיים NEC הוא כלי הכרחי למחקר חיסוני מחלות NEC. מודלים בעלי חיים NEC בדרך כלל להשתמש C57BL / 6J עכברי יילודים; עכברי יילודים BALB / c משמשים לעתים רחוקות. מחקרים קשורים הראו כי כאשר עכברים נגועים, בידול התא Th2 הוא דומיננטי בעכברים BALB / c לעומת עכברי...

מודל עכבר BALB /c יילודים של דלקת אנטרוקוליטיס נמק

הקמנו מודל עכברי של פיברוזיס כרוני בכבד, המספק מודל חייתי מתאים למחקר המכניסטי של אפיברוזיס כבד המושרה על ידי וירוסים של אטרזיה מרה (BA) ופלטפורמה לטיפולי BA עתידיים.

מודל עכברי של פיברוזיס כרוני בכבד לחקר אטרזיה של המרה

מערכת זילוח כבד נורמותרמית ex vivo (NEVLP) נוצרה עבור כבדי עכברים. מערכת זו דורשת ניסיון במיקרו-כירורגיה אך מאפשרת תוצאות זילוח הניתנות לשחזור. היכולת להשתמש בכבדים של עכברים מאפשרת לחקור מסלולים מולקולריים לזיהוי תוספי פרבוסט חדשים ומאפשרת ביצוע ניסויים המתמקדים בתיקון איברים.

זילוח מכונת כבד Normothermic Ex Vivo בעכבר

למדו פרוטוקול ניתוח מפורט של מערכת המרה החוץ-כבדית בעכברים נאונטליים בני תשעה ימים. השיטה מאפשרת הסרה אטראומטית של תאים מזהמים ומשפרת השוואתיות בין מחקרים על מחלות צינור המרה.

דיסקציה של צינור המרה החוץ-כבדי וכיס המרה בניודים של עכברים בני תשעה ימים

גלה סרטונים נוספים