Name: פרוטוקול ניקוי יעיל לחקר התפתחות זרעים בעגבניות (Solanum lycopersicum L.) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: למד פרוטוקול ניקוי יעיל לחקר התפתחות זרעים בעגבניות (Solanum lycopersicum) באמצעות טיפול בנתרן היפוכלוריט. השיטה מאפשרת תצפית ברורה של עוברים בשלבי התפתחות שונים וזיהוי אנומליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד"ר ג'יה לה ולד"ר שיופן סונג על הצעותיהם המועילות למיקרוסקופיה של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות ולשיטת הניקוי הקונבנציונלית, בהתאמה. מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31870299) והאגודה לקידום חדשנות לנוער של האקדמיה הסינית למדעים. איור 2 נוצר עם BioRender.com.

1. הכנת פתרונות
<ol><li>הכינו את ה-FAA על ידי הוספת 2.5 מ"ל של 37% פורמלדהיד, 2.5 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית ו-45 מ"ל של 70% אתנול בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. מערבולת ולאחסן אותו ב 4 מעלות צלזיוס. יש להכין את FAA באופן קבוע ממש לפני השימוש. אזהרה: 37% פורמלדהיד הוא קורוזיבי ועלול להיות מסרטן אם נחשף או נשאף. יש לבצע את הקיבעון במכסה אדים תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.</li>
	<li>הכינו תמיסת ניקוי על ידי הוספת 5 מ"ל של 100% גליצרול, 40 גרם כלור הידרט ו-10 מ"ל מים מזוקקים בבקבוק זכוכית של 100 מ"ל עטוף בנייר כסף. יש להמיס באמצעות מערבל מגנטי למשך לילה בטמפרטורת החדר. הפתרון מוכן יכול להיות מאוחסן ב 4 °C במשך עד 6 חודשים. אזהרה: כלורל הידרט הוא מסרטן ובעל ריח חריף. בצעו את הניסוי במכסה אדים וענדו ציוד מגן אישי מתאים. כלור הידרט קל לזייף באוויר ואין לאחסן אותו בכמויות גדולות. תמיסת הניקוי יכולה להתפרק כאשר היא נחשפת לאור ויש להרחיקה מהאור.</li>
	<li>הכן את תמיסת החיטוי על ידי הוספת 10 מ"ל של 6% נתרן היפוכלוריט, 40 מ"ל מים מזוקקים ו-50 μL Tween-20 בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. מערבולות ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר. הכן טרי את תמיסת החיטוי ממש לפני השימוש. הערה: תכולת הכלור האפקטיבית של נתרן היפוכלוריט שהונחה במשך זמן רב עשויה לרדת, וניתן להגדיל את התוכן של 6% נתרן היפוכלוריט בהתאם למצב בפועל.</li>
</ol>2. איסוף זרעים
<ol><li>זורעים זרעי עגבניות (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, ראו טבלת חומרים) ב-8 ס"מ × 8 ס"מ × כיורים מרובעים בגודל 8 ס"מ מלאים בתערובת של 1:1 של אדמה ומצע של פרחים מזינים (v/v) (ראו טבלת חומרים), וגדלים בחדר גידול עם תקופות אור/חושך של 16/8 שעות ב-24 ± 2 מעלות צלזיוס (יום) ו-18 ± 2 מעלות צלזיוס (לילה), 60%-70% לחות יחסית, ועוצמת אור של 4,000 לוקס. כ-6 שבועות לאחר מכן נכנסו הצמחים לשלב הפריחה.</li>
	<li>תייג את תאריך הפריחה של פרחים עצמאיים באנתזה (זווית הפתיחה של עלי הכותרת היא 90 מעלות), ותעד את היום שלאחר הפריחה (DAF).</li>
	<li>לקצור את הפירות מ 3 עד 23 צמחי עגבניות DAF ומיד לשים אותם על קרח. חלקו פירות (זרעים או עוברים) מ-3 עד 23 DAF לפירות מוקדמים (3-10 DAF), אמצעיים (11-16 DAF) ומאוחרים (17-23 DAF) (זרעים או עוברים). הערה: אין לאסוף יותר מדי פירות בכל פעם ולוודא שהזרעים בכל פרי מופשטים תוך שעה להמשך טיפול.</li>
	<li>עבור פירות מוקדמים, שוברים את הפרי ומניחים אותו על מגלשה, ואוספים זרעים טריים בזהירות עם מלקחיים מדויקים מתחת לסטריאומיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים) בהגדלה של פי 1 עד 4. לפירות בינוניים ומאוחרים, שוברים את הפרי ואוספים ישירות זרעים טריים באמצעות מלקחיים מדויקים.</li>
</ol>3. ניקוי זרעים על בסיס כלורל הידרט
הערה:35 פרוטוקולים קונבנציונליים וממוטבים הושוו במחקר זה ליעילות ניקוי הזרעים שלהם.
<ol><li>ניקוי באמצעות פרוטוקול קונבנציונלי
	<ol><li>מניחים זרעים טריים (המתקבלים בשלב 2.4) מיד בצינור צנטריפוגה 2 מ"ל המכיל 1.5 מ"ל FAA מקובע ודגירה על שייקר אורביטלי (5 סל"ד, ראו טבלת חומרים) למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>ייבשו את הזרעים האלה בסדרת אתנול של 70%, 95% ו-100% אתנול (v/v) למשך שעה אחת כל אחד על שייקר אורביטלי (5 סל"ד).</li>
		<li>מניחים את הזרעים ב-3-5 טיפות של תמיסת ניקוי (~100 μL) על המגלשה ומכסים בעדינות את הדגימה בכיסוי. החלף את השקופית בשקופית קעורה אחת (ראה טבלת חומרים) עבור זרעים אמצעיים ומאוחרים.</li>
		<li>שמור שקופיות אלה או שקופיות קעורות בודדות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות (3 DAF), שעתיים (6 DAF), יום אחד (9 DAF), 3 ימים (12 DAF) או 7 ימים (14 עד 22 DAF) בהתאם לשלבי ההתפתחות של חומר הזרע (ככל שהחומרים צעירים יותר, כך מהירות הניקוי מהירה יותר).</li>
		<li>התבונן בדגימות באמצעות מיקרוסקופ ניגוד הפרעות דיפרנציאלי (DIC) המצויד במצלמה דיגיטלית (ראה טבלת חומרים) בהגדלה של 10x, 20x ו- 40x. כוונן ומטב את בהירות האור המועברת, מחוון DIC ומפתח צמצם המעבה בזמן אמת עבור כל דגימה ולכוד תמונות.</li>
	</ol></li>
	<li>ניקוי באמצעות הפרוטוקול הממוטב
	<ol><li>הכניסו זרעים טריים (שהתקבלו בשלב 2.4) ישירות לתוך צינור צנטריפוגה של 2 מ"ל המכיל תמיסת חיטוי של 1.5 מ"ל (שלב 1.3). הערה: מספר הזרעים שנאספו בצינור הצנטריפוגה של 2 מ"ל משתנה בהתאם לשלב ההתפתחותי של הזרעים. הפרטים מפורטים בטבלה 1.</li>
		<li>דגירה של הדגימות על שייקר אורביטלי (30 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 50 דקות עד שניתן יהיה לראות בבירור את קווי המתאר הפנימיים ביותר של שכבת הזרעים. השליכו את תמיסת החיטוי. הערה: זמן הדגירה הנדרש תלוי בשלב התפתחות הזרעים (ככל שהזרעים מאוחרים יותר, כך זמן הדגירה יהיה ארוך יותר). הפרטים מפורטים בטבלה 1.</li>
		<li>עבור זרעים אמצעיים ומאוחרים, מעבירים את הזרעים למגלשה ומסירים את רירית הזרעים בעזרת מלקחיים ומחט ניתוח תחת סטריאומיקרוסקופ בהגדלה של פי 1 עד 4. מעבירים את הזרעים בחזרה לצינור הצנטריפוגה המקורי באמצעות מלקחיים. הערה: שלב זה אינו הכרחי עבור זרעים מוקדמים.</li>
		<li>לשטוף את הזרעים 5x עם 1.5 מ"ל מים deionized, 10 שניות בכל פעם. השליכו את המים שעברו דה-יוניזציה.</li>
		<li>הוסף תמיסת ניקוי של 2 × נפח הזרעים, ולאחר מכן טיפול ואקום במשך 0 עד 50 דקות (טבלה 1) עם משאבת ואקום (ראה טבלת חומרים). טיפול ואקום לסירוגין מבוצע עם כל טיפול ואקום במשך 10 דקות במרווחים של 10 דקות.</li>
		<li>החלף עם פתרון ניקוי טרי של 2 × נפח הזרעים. שמור את צינור הצנטריפוגה 2 מ"ל המכיל את הזרעים בטמפרטורת החדר ומוגן מפני אור למשך 30 דקות עד 7 ימים כדי להקל על הניקוי (טבלה 1). במהלך הדגירה, עבור עוברים מאוחרים, יש להחליף את תמיסת הניקוי מדי יום בתמיסה טרייה ולהכפיף את הזרעים לטיפול ואקום למשך 10 דקות.</li>
		<li>הכן את הזרעים המנוקים על שקופיות או שקופיות קעורות בודדות והתבונן באמצעות מיקרוסקופ DIC המצויד במצלמה דיגיטלית בהגדלה של 10x, 20x ו- 40x. כוונן ומטב את בהירות האור המועברת, מחוון DIC ומפתח צמצם המעבה בזמן אמת עבור כל דגימה ולכוד תמונות.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>FAOSTAT. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL">https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL</a> (2022).</li>
<li>Olmstead, R. G., Bohs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+summary+of+molecular+systematic+research+in+Solanaceae%3A+1982-2006%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006.</a> Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).</li>
<li>Consortium, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tomato+genome+sequence+provides+insights+into+fleshy+fruit+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution.</a> Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).</li>
<li>Ebert, A. W., Chou, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tomato+collection+maintained+by+AVRDC+-+The+World+Vegetable+Center%3A+composition%2C+germplasm+dissemination+and+use+in+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">The tomato collection maintained by AVRDC - The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding.</a> Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).</li>
<li>Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tomato+seed+as+a+model+system+to+study+seed+development+and+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Botanica+Neerlandica%22%5BJournal%5D)">The tomato seed as a model system to study seed development and germination.</a> Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).</li>
<li>Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+structural+details+of+tomato+seed+coat+formation%3A+A+different+functional+role+of+the+inner+and+outer+epidermises+in+unitegmic+ovule%5BTitle%5D)+AND+%22Plants-Basel%22%5BJournal%5D)">Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule.</a> Plants-Basel. 11 (9), 1101(2022).</li>
<li>Iwahori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+temperature+injuries+in+tomato.+V.+Fertilization+and+development+of+embryo+with+special+reference+to+the+abnormalities+caused+by+high+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+Japanese+Society+for+Horticultural+Science%22%5BJournal%5D)">High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature.</a> Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).</li>
<li>Xiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+tomato+reproductive+developmental+landmarks+and+expression+profiles%2C+and+the+effect+of+SUN.+on+fruit+shape%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 49(2009).</li>
<li>Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R. Physiological mechanisms involved in seed priming. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarssen%2C+CM+%22Recent+advances+in+the+development+and+germination+of+seeds.+NATO+ASI+Series%22">Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series</a>. Taylorson, R. B. 187, Springer. Boston, MA. (1989).</li>
<li>Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+dormancy+and+germination-emerging+mechanisms+and+new+hypotheses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 233(2014).</li>
<li>Doll, N. M., Ingram, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-endosperm+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryo-endosperm interactions.</a> Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).</li>
<li>Serrani, J. C., Fos, M., Atarés, A., García-Martínez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gibberellin+and+auxin+on+parthenocarpic+fruit+growth+induction+in+the+cv+micro-tom+of+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Growth+Regulation%22%5BJournal%5D)">Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+gene+induces+trichome+formation+and+embryo+lethality+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).</li>
<li>Goetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cis-12-oxo-phytodienoic+acid+in+tomato+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).</li>
<li>Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transporter+SlSWEET15+unloads+sucrose+from+phloem+and+seed+coat+for+fruit+and+seed+development+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato.</a> Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearSee%3A+A+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), (2021).</li>
<li>Kwiatkowska, M., Kadłuczka, D., Wędzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+a+clearing+protocol+to+study+crassinucellate+ovules+of+the+sugar+beet+%28Beta+vulgaris+L.%2C+Amaranthaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae).</a> Plant Methods. 15, 71(2019).</li>
<li>Ponitka, A., Ślusarkiewicz-Jarzina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleared-ovule+technique+used+for+rapid+access+to+early+embryo+development+in+Secale+cereale+%C3%97+Zea+mays+crosses%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biologica+Cracoviensia.+Series+Botanica%22%5BJournal%5D)">Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale × Zea mays crosses.</a> Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).</li>
<li>Ceccato, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+control+of+PIN1+is+required+for+female+gametophyte+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis.</a> PLoS One. 8 (6), 66148(2013).</li>
<li>Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+clearing+protocol+for+the+quantitative+assessment+of+sub-epidermal+ovule+tissues+within+whole+cereal+pistils%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils.</a> Plant Methods. 13, 67(2017).</li>
<li>Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+clearing+and+staining+of+Arabidopsis+flower+organs+and+Siliques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e56441(2018).</li>
<li>Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanically+sensitive+cell+layer+regulates+the+physical+properties+of+the+Arabidopsis+seed+coat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat.</a> Nature Communications. 6, 6382(2015).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+B3+domain-containing+transcription+factor+ZmABI19+coordinates+expression+of+key+factors+required+for+maize+seed+development+and+grain+filling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling.</a> Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).</li>
<li>Anderson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hoyer%27s+solution+as+a+rapid+permanent+mounting+medium+for+bryophytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bryologist%22%5BJournal%5D)">Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes.</a> Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).</li>
<li>Herr, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+clearing-squash+technique+for+the+study+of+ovule+development+in+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms.</a> American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).</li>
<li>Yadegari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation+and+morphogenesis+are+uncoupled+in+Arabidopsis+raspberry+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos.</a> The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).</li>
<li>Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+and+endosperm+development+is+disrupted+in+the+female+gametophytic+capulet+mutants+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis.</a> Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).</li>
<li>Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+growth+and+pseudoembryo+development+affected+by+uniconazole%2C+an+inhibitor+of+gibberellin+biosynthesis%2C+in+pat-2+and+auxin-Induced+parthenocarpic+tomato+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits.</a> Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).</li>
<li>de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Solanum+lycopersicum+auxin+response+factor+7+%28SlARF7%29+regulates+auxin+signaling+during+tomato+fruit+set+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development.</a> Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).</li>
<li>Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild+tomato+endosperm+transcriptomes+reveal+common+roles+of+genomic+imprinting+in+both+nuclear+and+cellular+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm.</a> Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).</li>
<li>Orsi, C. H., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+an+ABC+transporter+gene+associated+with+seed+size+evolution+in+tomato+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species.</a> PLoS Genetics. 5 (1), 1000347(2009).</li>
<li>Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+seed+size+in+Arabidopsis+for+mutant+and+QTL+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery.</a> Plant Methods. 7 (1), 3(2011).</li>
<li>Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLE19+expressed+in+the+embryo+regulates+both+cotyledon+establishment+and+endosperm+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis.</a> Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).</li>
<li>Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+seed+mucilage+as+a+new+source+of+biodegradable+film-forming+material%3A+effect+of+glycerol+and+cellulose+nanofibers+on+the+characteristics+of+resultant+films%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Bioprocess+Technology%22%5BJournal%5D)">Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films.</a> Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).</li>
<li>Gardner, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+botanical+clearing+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">An overview of botanical clearing technique.</a> Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).</li>
<li>Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+location+of+a+semipermeable+layer+in+seed+coats+of+leek+and+onion+%28Liliaceae%29%2C+tomato+and+pepper+%28Solanaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Seed+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae).</a> Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).</li>
<li>Stebbins, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bleaching+and+clearing+method+for+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bleaching and clearing method for plant tissues.</a> Science. 87 (2245), 21-22 (1938).</li>
<li>Debenham, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+the+microscopic+examination+of+the+xylem+of+whole+plants+or+plant+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs.</a> Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).</li>
<li>Morley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+clearing+of+plant+leaves+by+NaOH+in+association+with+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen.</a> Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

בהשוואה לחיתוך מכני, טכנולוגיית הסליקה מועילה יותר להדמיה תלת מימדית מכיוון שהיא שומרת על שלמות רקמות הצמח או איברים16. פרוטוקולי ניקוי קונבנציונליים מוגבלים לעתים קרובות לדגימות קטנות בשל חדירה קלה יותר של תמיסות כימיות. זרעי עגבניות הם דגימה בעייתית לניקוי רקמות מכיוון שהם גדולים בערך פי 70 מזרע ערבידופסיס בגודלם ויש להם מחסומי חדירות רבים יותר. ציפוי הזרעים של Arabidopsis מורכב מארבע עד חמש שכבות תאים חיים שמקורם בכסות החיצונית ובכסות הפנימית24. עם זאת,...

עגבניות (S. lycopersicum L.) הוא אחד מגידולי הירקות החשובים ביותר ברחבי העולם, עם תפוקה של 186.8 מיליון טונות של פירות בשרניים מ 5.1 מיליון דונם בשנת 20201. הוא שייך למשפחת Solanaceae הגדולה עם כ-2,716 מינים2, כולל גידולים רבים בעלי חשיבות מסחרית כגון חצילים, פלפלים, תפוחי אדמה וטבק. העגבנייה המעובדת היא מין דיפלואידי (2n = 2x = 24) עם גודל גנום של כ 900 Mb3. במשך זמן רב, נעשה מאמץ רב לקראת ביות עגבניות ורבייה על ידי בחירת תכונות רצויות מסולנום פראי spp. יש יותר מ-5,000 עגבניות במרכז המשאבים לגנטיקה של עגבניות ויותר מ-80,000 נבטים של עגבניות מאוחסנים ברחבי העולם4. צמח העגבנייה הוא רב שנתי בחממה ומתפשט על ידי זרעים. זרע עגבנייה בוגר מורכב משלושה תאים עיקריים: עובר בגידול מלא, אנדוספרם מסוג תאי שיורי ושכבת זרע קשה 5,6 (איור 1A). לאחר הפריה כפולה, התפתחות אנדוספרם מסוג תאי מקדימה את התפתחות הזיגוטים. ב~5-6 ימים לאחר הפריחה (DAF), פרומבריו דו-תאי נצפה לראשונה כאשר האנדוספרם מורכב משישה עד שמונה גרעינים7. ב- Solanum pimpinellifolium, העובר מתקרב לגודלו הסופי לאחר 20 DAF, וזרעים הם בני קיימא לנביטה לאחר 32 DAF8. ככל שהעובר מתפתח, האנדוספרם נספג בהדרגה ורק כמות קטנה של אנדוספרם נשארת בזרע. האנדוספרם השיורי מורכב מאנדוספרם מיקרופילרי המקיף את קצה הרדיקל, ואנדוספרם לרוחב בשאר הזרע 9,10. ציפוי הזרע החיצוני מפותח מאפידרמיס חיצוני מעובה ומכובד של הכסות, ועם השכבות המתות של שרידי הכסות, הם יוצרים קליפה קשה כדי להגן על העובר והאנדוספרם5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64445/64445fig01.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של זרע בוגר בסולנום ליקופרסיום ובערבידופסיס תאליאנה. (A) אנטומיה אורכית של זרעי עגבנייה בוגרים. (B) אנטומיה אורכית של זרע ערבידופסיס בוגר. גודלו של זרע עגבנייה בוגר גדול בערך פי 70 מזרע ערבידופסיס. פסי קנה מידה = (A) 400 μm, (B) 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64445/64445fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
ייצור זרעי עגבניות איכותיים תלוי בתיאום בין העובר, האנדוספרם ומרכיבי הזרע האימהי11. ניתוח גנים ורשתות מפתח בהתפתחות זרעים דורש רישום פנוטיפי עמוק ומלא של זרעים מוטנטיים. טכניקות חיתוך הטמעה קונבנציונליות, כגון חתך דק למחצה וחתך פרפין, מיושמות באופן נרחב על זרעי עגבניות כדי לבחון את המבנים המקומיים והעדינים יותר של העובר12,13,14,15. עם זאת, ניתוח התפתחות הזרעים מקטעים דקים הוא בדרך כלל מייגע וחסר רזולוציה מרחבית של ציר z. לשם השוואה, ניקוי רקמות הוא שיטה מהירה ויעילה לאיתור השלב ההתפתחותי של פגמים בעוברים שסביר ביותר שיתרחשו16. שיטת הניקוי מפחיתה את האטימות של הרקמה הפנימית על ידי הומוגניזציה של מקדם השבירה עם חומר ביוכימי אחד או יותר16. ניקוי רקמות שלמות מאפשר תצפית על מבנה רקמה צמחית מבלי להרוס את שלמותה, והשילוב של טכנולוגיית ניקוי והדמיה תלת מימדית הפך לפתרון אידיאלי לקבלת מידע על המורפולוגיה והמצב ההתפתחותי של איבר צמחי17,18. במהלך השנים, טכניקות ניקוי זרעים שימשו במיני צמחים שונים, כולל Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare, ו- Beta vulgaris 19,20,21,22,23. בין אלה, טכנולוגיית ניקוי הביציות בהרכבה שלמה הייתה גישה יעילה לחקר התפתחות זרעים של Arabidopsis, בשל גודלו הקטן, 4-5 שכבות של תא ציפוי הזרע, והאנדוספרם מסוג גרעיני24,25. עם העדכון המתמשך של תערובות ניקוי שונות, כגון הופעת הפתרון של Hoyer26, מבנים פנימיים של ביצית השעורה צולמו עם רמה גבוהה של בהירות למרות אנדוספרם שלה מהווה את עיקר הזרעים. Embryogenesis של סלק סוכר ניתן לראות על ידי ניקוי בשילוב עם טיפול ואקום ריכוך עם חומצה הידרוכלורית19. עם זאת, בניגוד למינים שהוזכרו לעיל, לא דווח על תצפיות אמבריולוגיות על ידי ניקוי פרוטוקולים בזרעי עגבניות. זה מונע חקירה מפורטת של התפתחות עוברית וזרעים של עגבניות.
כלורל הידרט משמש בדרך כלל כתמיסת ניקוי המאפשרת להציג את הרקמות והתאים השקועים במישורים אופטיים שונים, ומשמרת באופן משמעותי את התאים או מרכיבי הרקמה27,28,29. פרוטוקול ניקוי מבוסס כלורל הידרט שימש בהצלחה לניקוי שלם של זרעים כדי לבחון את העובר והאנדוספרם של Arabidopsis21,28. עם זאת, פתרון ניקוי זה אינו יעיל בניקוי זרעי עגבניות, שהם אטומים יותר מזרעי ערבידופסיס. המחסומים הפיזיים כוללים: (1) לכסות העגבניות יש כמעט 20 שכבות תאים ב-3 עד 15 DAF 30,31, (2) אנדוספרם העגבניות הוא מסוג תאים, לא מסוג גרעיני 32, ו-(3) זרעי עגבניות גדולים בערך פי 70 בגודל33,34 ו-(4) מייצרים כמויות גדולות של רירית ציפוי זרעים, מה שחוסם את החדירה של ריאגנטים לניקוי ומשפיע על הדמיה של תאי עובר.
לכן, דוח זה מציג שיטת ניקוי אופטימלית המבוססת על כלור הידרט לניקוי שלם של זרעי עגבניות בשלבים שונים, המאפשרת הדמיה עמוקה של תהליך התפתחות העובר (איור 2).

<table><tbody><tr><td>1,000 ומיקרו; פיפטה L</td><td>גילסון</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>1,000 ומיקרו; קצות פיפטה</td><td>L קורנינג</td><td>T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 2 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>37% פורמלדהיד</td><td>DAMAO</td><td>685-2013</td><td></td></tr><tr><td>5,000 ומיקרו; L פיפטה</td><td>אפנדורף</td><td>3120000275</td><td></td></tr><tr><td>5,000 ומיקרו; קצות פיפטה</td><td>L biosharp</td><td>BS-5000-TL</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>BOYUAN</td><td>678-2002</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק זכוכית</td><td>פישר</td><td>FB800-100</td><td></td></tr><tr><td>כלורל הידראט</td><td>מרייר</td><td>M13315-100G</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Leica</td><td>384200</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ DIC</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager A1</td><td>10x, 20x ו-40x הגדלה</td></tr><tr><td>חומר חיטוי</td><td>QIKELONGAN</td><td>17-9185</td><td></td></tr><tr><td>מחט ניתוח</td><td>Bioroyee</td><td>17-9140</td><td></td></tr><tr><td>אדמת פרחים מזינה</td><td>מלקחיים FANGJIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>HAIOU</td><td>4-94</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>BOYUAN</td><td>676-2007</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Solarbio</td><td>G8190</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מגנטי</td><td>IKA</td><td>RET בסיסי</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-טום</td><td>עגבניות גנטיקה מרכז משאבים</td><td>LA3911</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>QILINBEIER</td><td>QB-206</td><td></td></tr><tr><td>מצע זריעה</td><td>PINDSTRUP</td><td>LV713/018-LV252</td><td>הקרנה: 0-10 מ"מ</td></tr><tr><td>שקופית קעורה אחת</td><td>HUABODEYI</td><td></td><td></td>HBDY1895</tr><tr><td>שקופיות</td><td>Leica</td><td>3800381</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>S8 APO</td><td>1x עד 4x הגדלה</td></tr><tr><td>רדיד פח</td><td>ZAOWUFANG</td><td>613</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום</td><td>SHIDING</td><td>SHB-III</td><td></td></tr><tr><td>מד מערבולת</td><td>Silogex</td><td>MX-S</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול ניקוי יעיל לחקר התפתחות זרעים בעגבניות (solanum lycopersicum l.)

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.)

עגבניות (Solanum lycopersicum L.) הוא אחד מגידולי המזומנים העיקריים בעולם. זרעי העגבנייה הם מודל חשוב לחקר גנטיקה וביולוגיה התפתחותית במהלך רבייה של צמחים. הדמיה של מבנה עוברי עדין יותר בתוך זרע עגבנייה נפגעת לעתים קרובות על ידי רירית ציפוי זרעים, כסות רב-שכבתית ואנדוספרם בעל דופן עבה, אשר צריך להיפתר על ידי חתך הטבעה מייגע. חלופה פשוטה יותר היא להשתמש בטכניקות ניקוי רקמות שהופכות את הזרע לכמעט שקוף באמצעות חומרים כימיים. למרות שהליכי ניקוי קונבנציונליים מאפשרים תובנה עמוקה לגבי זרעים קטנים יותר עם שכבת זרעים דקה יותר, ניקוי זרעי עגבניות ממשיך להיות מאתגר מבחינה טכנית, במיוחד בשלבי ההתפתחות המאוחרים.
מוצג כאן פרוטוקול ניקוי מהיר וחוסך עבודה לצפייה בהתפתחות זרעי עגבניות בין 3 ל -23 ימים לאחר הפריחה כאשר המורפולוגיה העוברית כמעט הושלמה. שיטה זו משלבת תמיסת ניקוי מבוססת כלור הידרט הנמצאת בשימוש נרחב בערבידופסיס עם שינויים אחרים, כולל השמטת קיבוע פורמלין-אצטו-אלכוהול (FAA), הוספת טיפול בנתרן היפוכלוריט בזרעים, הסרת רירית שכבת הזרעים המרוככת, וטיפול בשטיפה ואקום. שיטה זו יכולה להיות מיושמת לניקוי יעיל של זרעי עגבניות בשלבי התפתחות שונים והיא שימושית במעקב מלא אחר התהליך ההתפתחותי של זרעים מוטנטיים ברזולוציה מרחבית טובה. פרוטוקול ניקוי זה עשוי להיות מיושם גם על הדמיה עמוקה של מינים חשובים מסחריים אחרים בסולניים.

כאשר זרעי עגבניות נוקו בשיטה קונבנציונלית כמו בערבידופסיס, תאי אנדוספרם צפופים חסמו את ההדמיה של עוברי עגבניות מוקדמים ב-3 DAF ו-6 DAF (איור 3A,B). ככל שהנפח הכולל של העובר גדל, בקושי ניתן היה להבחין בעובר כדורי ב-9 DAF (איור 3C). עם זאת, ככל שגודל הזרע המשיך לגדול, החדירות שלו ירדה, וכתוצאה מכך נוצר עובר לב מטושטש ב-12 DAF (איור 3D). מ-13 DAF ואילך, ריר הזרעים ושכבת הזרעים נעשו בהדרגה צפופים יותר, מה שמנע ...

זרעי העגבנייה הם מודל חשוב לחקר גנטיקה וביולוגיה התפתחותית במהלך רבייה של צמחים. פרוטוקול זה שימושי לניקוי זרעי עגבניות בשלבי התפתחות שונים כדי לבחון את המבנה העוברי העדין יותר.

פרוטוקול ניקוי יעיל לחקר התפתחות זרעים בעגבניות (Solanum lycopersicum L.)

Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the major cash crops worldwide. The tomato seed is an important model for studying genetics and developmental ...

שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים למצוא במהירות וללא מאמץ תקופות חריגות של התפתחות עוברי עגבניות. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא טיפול בזרעי עגבניות עם hypochlorite נתרן אשר מספק בסיס לתצפית של עוברי עגבניות. התחל עם הכנה כימית וקציר של פירות Solanum lycopersicum שלושה עד 23 ימים לאחר הפריחה או DAF.מיד מניחים את הפירות על הקרח ומחלקים אותם לפירות מוקדמים, אמצעיים ומאוחרים, על סמך הימים שלאחר הפריחה. שוברים את הפרי המוקדם, מניחים אותו על שקופית ואוספים זרעים טריים בזהירות עם מלקחיים מדויקים בהגדלה של פי 1 עד 4 ממיקרוסקופ הסטריאו. לפירות בינוניים ומאוחרים, שוברים את הפרי ואוספים ישירות זרעים טריים באמצעות מלקחיים מדויקים.בשיטה המקובלת, מעבירים את הזרעים הטריים שנאספו מיד לצינור צנטריפוגה של שני מיליליטר המכיל 1.5 מיליליטר FAA מקובע ומניחים את הצינור על השייקר האורביטלי ב-5 סל"ד למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן ייבשו את הזרעים ב-70%95% ו-100% אתנול למשך שעה כל אחד על שייקר אורביטלי ב-5 סל"ד. לאחר שתסיימו, הניחו את הזרע בשלוש עד חמש טיפות של תמיסת הניקוי הקיימת על המגלשה, וכסו אותו בעדינות במחליק כיסוי.השתמש בשקופית קעורה אחת עבור זרעים אמצעיים ומאוחרים. בהתאם לשלבי ההתפתחות של הזרעים, לדגור אותם בטמפרטורת החדר לסליקה. לאחר הדגירה, התבונן בדגימות עם ניגוד הפרעות דיפרנציאלי, או מיקרוסקופ DIC המצויד במצלמה דיגיטלית בהגדלה של 10x, 20x ו- 40x.התאם ומטב את בהירות האור המועברת, מחוון DIC ומפתח צמצם המעבה בזמן אמת עבור כל דגימה ולכוד תמונות. מעבירים את הזרעים הטריים שנאספו מהפירות השבורים לצינור צנטריפוגה של שני מיליליטר המכיל 1.5 מיליליטר של תמיסת חיטוי. דגרו את הדגימות על שייקר מסלולי ב-30 סל"ד למשך שלוש עד 50 דקות בטמפרטורת החדר.ברגע שקווי המתאר הפנימיים ביותר של ציפוי הזרעים נראים בבירור, השליכו את תמיסת החיטוי. עבור זרעים אמצעיים ומאוחרים, העבירו את הזרעים לשקופית. השתמש במלקחיים ובמחט חיתוך כדי להסיר את ריר הזרע תחת הגדלה של פי 1 עד 4 ממיקרוסקופ הסטריאו.מעבירים את הזרעים בחזרה לצינור הצנטריפוגה המקורי באמצעות מלקחיים. לשטוף אותם חמש פעמים ב 1.5 מיליליטר של מים deionized במשך 10 שניות כל אחד, ולהשליך את המים deionized. לאחר מכן, הוסף את הנפח הכפול של פתרון הניקוי לזרעים.בהתאם לשלב הזרעים, תן את הטיפול ואקום לסירוגין במשך אפס עד 50 דקות, עם מרווחים של 10 דקות לאחר כל טיפול ואקום של 10 דקות. לאחר טיפול ואקום, החלף את תמיסת הסליקה. כדי להקל על ניקוי הזרעים, מניחים את צינור הצנטריפוגה מוגן מפני אור למשך 30 דקות עד שבעה ימים בטמפרטורת החדר.במקרה של עוברים מאוחרים, להחליף את הפתרון מדי יום עם פתרון ניקוי טרי, ולאחר מכן הכפפת הזרעים לטיפול ואקום במשך 10 דקות. הניחו את הזרעים המסולקים על השקופית או על שקופית קעורה בודדת. באמצעות מיקרוסקופ DIC המצויד במצלמה דיגיטלית, כוונן ומטב את בהירות האור המועברת, מחוון DIC ומפתח המעבה בזמן אמת עבור כל דגימה ולכוד את התמונה.בשיטה הקונבנציונלית של ניקוי זרעי S.lycopersicum, תאי האנדוספרם הצפופים חסמו את ההדמיה של עוברים מוקדמים ב 3 ו 6 DAF. החדירות המופחתת במהלך צמיחת הזרעים הביאה לתמונות מטושטשות לאחר 9 DAF. רירית הזרעים וציפוי הזרעים נעשו בהדרגה צפופים יותר, מה שמנע חדירה של חומרי ניקוי מ-13 DAF ואילך.קווי המתאר של העובר בתוך 14 עד 19 זרעי DAF היו מטושטשים ביותר, למרות זמן הטיפול הממושך של שבעה ימים. המבנה הפנימי ב-22 זרעי DAF היה בלתי נראה לחלוטין. רירית ציפוי הזרעים המופשטת שיוצרה על ידי תאי האפידרמיס של ציפוי הזרעים בלטה מ-13 DAF ואילך.הטיפול בנתרן היפוכלוריט איפשר זיהוי ברור של ציפוי הזרע הפנימי וניתוק של רוב הרירית הדביקה ללא נזק לזרעים. בפרוטוקול הסליקה הממוטב הראו הזרעים שקיפות משביעת רצון בכל שלבי ההתפתחות שנבדקו. נצפו שכבות התאים המובהקות של שכבת הזרע ב-3 DAF, תאי אנדוספרם הניתנים להבחנה ב-5 DAF, העובר בצורת מקל ב-7 DAF, השלב הגלובולרי ב-9 DAF ושלב הלב ב-11 DAF.בפרוטוקול האופטימלי, מידת התלתל של קוטילדונים ולירות מריסטם אפיקלי נלכדה בקלות רבה בשלבים שונים של התפתחות עוברית. סטריליזציה מסירה רירית זרעים ופיגמנט ציפוי זרעים, המשפרים את החדירה וההדמיה של הזרעים. טיפול ואקום יכול להאיץ את חדירת פתרון הסליקה.

an-efficient-clearing-protocol-for-study-seed-development-tomato

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

עגבניות Analyzer (ת"א) מכמת התכונות של שתי צורות ממדי צבע בדרך לשחזור מדויק. הליך צעד אחר צעד להשגת תמונות באיכות גבוהה דיגיטלית של פירות עגבניה, מנתח מורפולוגי והצבע של התמונות האלה ואת מספר יישומים באמצעות נתונים שנוצרו באמצעות תוכנה זו מתוארים.

Analyzer עגבניות: יישום תוכנה שימושיים כדי לאסוף נתונים מורפולוגיים Colorimetric מדויק ומפורט של דו ממדיים

שיטת הקרח יתר מאפשר לגדל צמחים צלחות 96-היטב שאינם destructively שורש רקמה מן הקציר שתיל אחד. הדנ"א מופק רקמות השורש הזה יכול לשמש התגובות genotyping. מצאנו כי קרח יתר עובד היטב...

Ice יתר: שיטה גידול ארבידופסיס צמחים עגבניות ב 96-פלטות היטב genotyping תפוקה גבוהה

שתי שיטות שונות על צמחים מסך עם השורש קושר את נמטודות מתוארים. הגישות שתוארו כוללות תפוקה גבוהה מסכים עם נמטודות באופן הורסות להקל על השימוש בצמחים אלה בתוכניות רבייה.

קצב העברה גבוה ונמוך מסכים עם השורש קושר את נמטודות Meloidogyne spp.</em

מקור: חסן, ג'יי.א., ואח'. זיהוי תפוקה גבוהה של עמידות ל-Pseudomonas syringae pv. עגבנייה בעגבנייה באמצעות בדיקת שיטפון שתילים. J. Vis. Exp. (2020).סרטון זה מדגים שיטה לסינון עמידות חיידקים בזני עגבניות שונים באמצעות שתילים בני עשרה ימים המחוסנים בתרחיף חיידקים. הוא מסביר כיצד חיידקים פולשים דרך פיוניות, מספקים חלבונים אפקטורים לדיכוי חסינות הצמח, וכיצד תגובות הצמח שונות בין זנים רגישים ועמידים. התוצאה מוערכת על ידי התבוננות בהבדלי צמיחה גלויים, כאשר צמחים עמידים נשארים בריאים ורגישים מראים נזק...

בדיקת שיטפון שתילים לבדיקת עמידות חיידקים בעגבניות

כאן, אנו מציגים שיטה רב-תכליתית לשינוי בשורש העגבניות ולאחריה החיסון לביצוע ניתוח גנטי פשוט לחקר מחלות וילט בקטריאלי.

שורש עגבניות המרה ואחריו חיסונים עם Ralstonia Solanacearum ניתוח גנטי פשוט של מחלת וילט חיידקי

השטף שתיל המבול מאפשר הקרנה מהירה של הקלה עגבניות בר עבור התנגדות פסבדו החיידק syringae bacterium. מעשה זה, המשמש בשילוב עם השימוש בקביעת הצמיחה החיידקית של הנבט, יכול לסייע עוד יותר באפיון ההתנגדות הבסיסית לחיידק, וניתן להשתמש בו כדי לקבוע את הבסיס לאוכלוסיות מיפוי כדי לברר את היסוד הגנטי של ההתנגדות.

זיהוי תפוקה גבוהה של עמידות לפסאודומונס syringae pv. עגבניה בעגבניה באמצעות שתיל שיטפון שיטת

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לתצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים ב - Arabidopsis thaliana. שיטה זו ממנפת מכשיר הדמיה סטומטלי נייד, יחד עם צינור ניתוח תמונה המיועד לתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר.

תצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות למזרקי Pseudomonas PV . עגבניה DC3000 ב Arabidopsis thaliana

תרביות תאים עובריים חומוס רשתית מהוות כלים חשובים למחקר של ביולוגיה קולטי האור. פיתחנו טכניקת העברה יעילה של גנים המבוססת על לשעבר אוב electroporation פלסמיד של הרשתית לפני התרבות. טכניקה זו במידה ניכרת מגבירה את יעילות transfection על פרוטוקולים זמינים כרגע, מה שהופך את המניפולציה גנטית אפשרית למערכת זו.

העברה יעילה ג'ין בצ'יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות: אקס-אוב גישת Electroporation

במחקר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לביצוע ניתוח צבע כחול של אוונס (EBD) על זחלי דג הזברה.  טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לאפיון שלמות שרירי השלד ותיחום מודלים של דג זברה של ניוון שרירים, והיא שיטה רבת ערך לפיתוח טיפולים חדשים.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

כאן, אנו מתארים את הפיתוח והיישום של בדיקת התכווצות ג'ל להערכת תפקוד התכווצות בתאים מזנכימליים שעברו מעבר אפיתל-מזנכימלי.

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

למד פרוטוקול ניקוי יעיל לחקר התפתחות זרעים בעגבניות (Solanum lycopersicum) באמצעות טיפול בנתרן היפוכלוריט. השיטה מאפשרת תצפית ברורה של עוברים בשלבי התפתחות שונים וזיהוי אנומליות.

פרוטוקול ניקוי יעיל לחקר התפתחות זרעים בעגבניות (Solanum lycopersicum L.)

גלה סרטונים נוספים