פרוטוקול ניקוי יעיל לחקר התפתחות זרעים בעגבניות (Solanum lycopersicum L.)

שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים למצוא במהירות וללא מאמץ תקופות חריגות של התפתחות עוברי עגבניות. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא טיפול בזרעי עגבניות עם hypochlorite נתרן אשר מספק בסיס לתצפית של עוברי עגבניות. התחל עם הכנה כימית וקציר של פירות Solanum lycopersicum שלושה עד 23 ימים לאחר הפריחה או DAF.

מיד מניחים את הפירות על הקרח ומחלקים אותם לפירות מוקדמים, אמצעיים ומאוחרים, על סמך הימים שלאחר הפריחה. שוברים את הפרי המוקדם, מניחים אותו על שקופית ואוספים זרעים טריים בזהירות עם מלקחיים מדויקים בהגדלה של פי 1 עד 4 ממיקרוסקופ הסטריאו. לפירות בינוניים ומאוחרים, שוברים את הפרי ואוספים ישירות זרעים טריים באמצעות מלקחיים מדויקים.

בשיטה המקובלת, מעבירים את הזרעים הטריים שנאספו מיד לצינור צנטריפוגה של שני מיליליטר המכיל 1.5 מיליליטר FAA מקובע ומניחים את הצינור על השייקר האורביטלי ב-5 סל"ד למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן ייבשו את הזרעים ב-70%95% ו-100% אתנול למשך שעה כל אחד על שייקר אורביטלי ב-5 סל"ד. לאחר שתסיימו, הניחו את הזרע בשלוש עד חמש טיפות של תמיסת הניקוי הקיימת על המגלשה, וכסו אותו בעדינות במחליק כיסוי.

השתמש בשקופית קעורה אחת עבור זרעים אמצעיים ומאוחרים. בהתאם לשלבי ההתפתחות של הזרעים, לדגור אותם בטמפרטורת החדר לסליקה. לאחר הדגירה, התבונן בדגימות עם ניגוד הפרעות דיפרנציאלי, או מיקרוסקופ DIC המצויד במצלמה דיגיטלית בהגדלה של 10x, 20x ו- 40x.

התאם ומטב את בהירות האור המועברת, מחוון DIC ומפתח צמצם המעבה בזמן אמת עבור כל דגימה ולכוד תמונות. מעבירים את הזרעים הטריים שנאספו מהפירות השבורים לצינור צנטריפוגה של שני מיליליטר המכיל 1.5 מיליליטר של תמיסת חיטוי. דגרו את הדגימות על שייקר מסלולי ב-30 סל"ד למשך שלוש עד 50 דקות בטמפרטורת החדר.

ברגע שקווי המתאר הפנימיים ביותר של ציפוי הזרעים נראים בבירור, השליכו את תמיסת החיטוי. עבור זרעים אמצעיים ומאוחרים, העבירו את הזרעים לשקופית. השתמש במלקחיים ובמחט חיתוך כדי להסיר את ריר הזרע תחת הגדלה של פי 1 עד 4 ממיקרוסקופ הסטריאו.

מעבירים את הזרעים בחזרה לצינור הצנטריפוגה המקורי באמצעות מלקחיים. לשטוף אותם חמש פעמים ב 1.5 מיליליטר של מים deionized במשך 10 שניות כל אחד, ולהשליך את המים deionized. לאחר מכן, הוסף את הנפח הכפול של פתרון הניקוי לזרעים.

בהתאם לשלב הזרעים, תן את הטיפול ואקום לסירוגין במשך אפס עד 50 דקות, עם מרווחים של 10 דקות לאחר כל טיפול ואקום של 10 דקות. לאחר טיפול ואקום, החלף את תמיסת הסליקה. כדי להקל על ניקוי הזרעים, מניחים את צינור הצנטריפוגה מוגן מפני אור למשך 30 דקות עד שבעה ימים בטמפרטורת החדר.

במקרה של עוברים מאוחרים, להחליף את הפתרון מדי יום עם פתרון ניקוי טרי, ולאחר מכן הכפפת הזרעים לטיפול ואקום במשך 10 דקות. הניחו את הזרעים המסולקים על השקופית או על שקופית קעורה בודדת. באמצעות מיקרוסקופ DIC המצויד במצלמה דיגיטלית, כוונן ומטב את בהירות האור המועברת, מחוון DIC ומפתח המעבה בזמן אמת עבור כל דגימה ולכוד את התמונה.

בשיטה הקונבנציונלית של ניקוי זרעי S.lycopersicum, תאי האנדוספרם הצפופים חסמו את ההדמיה של עוברים מוקדמים ב 3 ו 6 DAF. החדירות המופחתת במהלך צמיחת הזרעים הביאה לתמונות מטושטשות לאחר 9 DAF. רירית הזרעים וציפוי הזרעים נעשו בהדרגה צפופים יותר, מה שמנע חדירה של חומרי ניקוי מ-13 DAF ואילך.

קווי המתאר של העובר בתוך 14 עד 19 זרעי DAF היו מטושטשים ביותר, למרות זמן הטיפול הממושך של שבעה ימים. המבנה הפנימי ב-22 זרעי DAF היה בלתי נראה לחלוטין. רירית ציפוי הזרעים המופשטת שיוצרה על ידי תאי האפידרמיס של ציפוי הזרעים בלטה מ-13 DAF ואילך.

הטיפול בנתרן היפוכלוריט איפשר זיהוי ברור של ציפוי הזרע הפנימי וניתוק של רוב הרירית הדביקה ללא נזק לזרעים. בפרוטוקול הסליקה הממוטב הראו הזרעים שקיפות משביעת רצון בכל שלבי ההתפתחות שנבדקו. נצפו שכבות התאים המובהקות של שכבת הזרע ב-3 DAF, תאי אנדוספרם הניתנים להבחנה ב-5 DAF, העובר בצורת מקל ב-7 DAF, השלב הגלובולרי ב-9 DAF ושלב הלב ב-11 DAF.

בפרוטוקול האופטימלי, מידת התלתל של קוטילדונים ולירות מריסטם אפיקלי נלכדה בקלות רבה בשלבים שונים של התפתחות עוברית. סטריליזציה מסירה רירית זרעים ופיגמנט ציפוי זרעים, המשפרים את החדירה וההדמיה של הזרעים. טיפול ואקום יכול להאיץ את חדירת פתרון הסליקה.