Name: תא גמיש להדמיית תאים חיים בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: למדו כיצד לבנות תא גמיש להדמיית תאים חיים בהילוך מהיר באמצעות מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה. השיטה מאפשרת מעקב אחר דינמיקת טיפות שומן בתאי SKOV3 לאורך 24 שעות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להודות לצוות העיצוב הבכיר לתואר ראשון לשנת 2019 (סוק צ'ול יון, איאן פוקסטון, לואיס מאזה וג'יימס וולש) באוניברסיטת בינגהמטון על התכנון, הייצור והבדיקה של קופסת מארז המיקרוסקופ. אנו מודים לסקוט הנקוק, אולגה פטרובה ופביולה מורנו אוליבס מאוניברסיטת בינגהמטון על הדיונים המועילים. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R15GM140444.

1. בניית המתחם הסביבתי במיקרוסקופ
הערה: המארז הסביבתי הגדול הזה של המיקרוסקופ משמש לשליטה בטמפרטורה של גוף המיקרוסקופ וסביבת ההדמיה שיש לייצב ב-37°C (איור 1A).
<ol><li>סמן את מיקומי כפות הרגליים של מסגרת המיקרוסקופ SRS ואת השלב הממונע באמצעות עט סמן על השולחן האופטי. הרכיבו שתי דיאפרגמות איריס מול סורק הגלוונומטר של המיקרוסקופ והתכווננו כך שהמשאבה וקרני הלייזר של סטוקס יעברו דרך מרכז דיאפרגמת הקשתית.</li>
	<li>הסר את מסגרת המיקרוסקופ ואת הבמה מהטבלה האופטית.</li>
	<li>הניחו את יריעת גומי הסיליקון (גודל: 31X29 אינץ', עובי: 1/8 אינץ') על השולחן האופטי (איור 1B).</li>
	<li>חותכים את גומי הסיליקון לאורך הסימנים באמצעות סכין, מסירים חתיכות גומי קטנות ומניחים את יריעות הקרמיקה המרובעות MICA (גודל: 6X6 אינץ', עובי: 1/4 אינץ') באותם מיקומים. הערה: MICA קרמי הוא חומר קל למכונה15. זה קשה כמו אלומיניום אבל הוא מבודד תרמי מעולה. יריעות קרמיות MICA שימשו לעצירת מעבר חום מהמסגרת והבמה של מיקרוסקופ המתכת אל השולחן האופטי מפלדת אל-חלד. יש לקדוח מספר חורי מעבר ביריעות MICA כדי לאפשר שימוש ב-1/4-20 ברגים להרכבת רגלי המסגרת והבמה.</li>
	<li>הזיזו את מסגרת המיקרוסקופ ואת הבמה בחזרה לשולחן האופטי ויישרו בזהירות את כפות הרגליים על יריעות הקרמיקה של MICA לאורך קווי הסמן. השתמש 1/4-20 ברגים כדי להרכיב את המסגרת ואת הבמה על השולחן.</li>
	<li>יישר מחדש את הנתיב האופטי SRS. כוונן את תושבות המראה של מראה 1 ומראה 2 כדי לגרום לקרן הלייזר לעבור דרך המרכז של שתי דיאפרגמות הקשתית המותקנות מראש (איור 2). הערה: פרטים טכניים של מיקרוסקופ SRS שנבנה במעבדה ושימש לעבודת ההדמיה הנוכחית של תאים חיים מתוארים קודם לכן16. רוחב הדופק של המשאבה וקורות סטוקס הוא ~ 3-4 ps עם פיזור מוט זכוכית. המערכת נשלטת באמצעות תוכנת ScanImage17 .</li>
	<li>על גבי בסיס בידוד תרמי זה, הרכיבו את המארז הסביבתי כדי לכסות את כל מסגרת המיקרוסקופ באמצעות חמש חתיכות של יריעות פוליקרבונט גדולות (גודל: 31 x 29 x 28 אינץ ', עובי: 0.25 אינץ '). הערה: גודל קופסת המארז נקבע בהתבסס על מידות מסגרת המיקרוסקופ והבמה. יהיה צורך להסיר את הלוח הקדמי של קופסת מארז המיקרוסקופ באופן זמני כדי להתקין את התא הגמיש ולטעון את צלחת תרבית התא.<ol><li>כדי להרכיב את המארז, בצע עבודות עיבוד פשוטות, כולל חיתוך, קידוח והקשה על חורי בורג בכל קצה של יריעות הפוליקרבונט. חתכו שני חורים גדולים בקוטר של 2.6 אינץ 'בצד ימין ובצד שמאל של המארז כך שיתאימו לצינורות הכניסה והיציאה, בהתאמה. חותכים חור קטן בקוטר של 5 מ"מ על היריעה האחורית כדי לאפשר לקרני הלייזר להיכנס למארז.</li>
	</ol></li>
	<li>אטמו את הקצוות והממשקים של הקופסה באמצעות נייר אלומיניום.</li>
	<li>חבר את צינור התעלה הגמיש לכניסה וליציאות היציאה של תיבת המארז כדי לאפשר זרימת אוויר חם במחזור הנשאב ונשלט על ידי מודול המחמם. מקם את החיישן התרמי של מודול החימום בתא הגמיש שבו התאים מתורבתים ומצולמים. הגדר את טמפרטורת היעד על 37 °C (77 °F). הערה: ניתן להשתמש בדיפיוזר כדי לקבל פיזור זרימת אוויר אחיד יותר במתחם הסביבתי.</li>
</ol>2. הרכבת התא הגמיש
<ol><li>הרכיבו את פיסת האלומיניום הגלילית החלולה 1 (חומר: אלומיניום 6061) על האף של המטרה באמצעות שלושה ברגים קבועים (איור 2).</li>
	<li>הרכיבו את פיסת האלומיניום הגלילית החלולה 2 במכונה למחזיק הדגימה באמצעות ארבעה ברגים 1/4-20 (איור 2). הערה: יש לשנות את מחזיק הדגימה כך שיחזיק את צלחת תרבית התאים בתחתית הזכוכית בקוטר 50 מ"מ. קדח חור במרכז מחזיק הדגימה באמצעות מסור חור בגודל 1-7/8 אינץ '. נטרל את החור באמצעות מסור חור 50 מ"מ ושמור על עומק החור ~ 1 מ"מ.</li>
	<li>התאימו את מחזיק הדגימה לחתיכת אלומיניום 2 על הבמה הממונעת והרכיבו אותו באמצעות ברגים.</li>
	<li>הניחו את שרוול סרט הגומי הטבעי (עובי: 0.01 אינץ'; מודבק בדבק ציאנואקרילט) בין שני חלקי האלומיניום המיוצרים במכונה והרכיבו אותו באמצעות גומיות בכל קצה.</li>
	<li>חבר את גליל CO2 דחוס למודול מערבל הגז באמצעות צינורות ומחברים מתאימים. הגדר את לחץ הכניסה CO2 על 20-25 psi. השתמש בחיישן CO2 מובנה ובבקר כדי להבטיח שמודול מערבל האוויר יכול לווסת ולערבב 5%CO2 בזרימת האוויר. השתמש במסננים מוטבעים כדי לנקות את זרימת האוויר.</li>
	<li>באמצעות צינורות ומחברים מתאימים, כוונו את האוויר המעורב (עם 5% CO2) לבקבוק המים המעוקרים שהונחו על הפלטה החשמלית, ולאחר מכן כוונו את האוויר הלח לתא הגמיש. כוונו את הפלטה החמה ל-37°C. בוערו את זרימת האוויר במים החמים כדי להגביר את הלחות של זרימת האוויר.</li>
</ol>3. הכנה לניסויי הדמיה של SRS תאים חיים בהילוך מהיר
<ol><li>נגבו את כל חלקי התא הגמיש באתנול 70%, כולל האף, מטרת טבילת המים ומחזיק הדגימה.</li>
	<li>לטהר את כל מערכת המארז באמצעות מנורת UV הממוקמת במארז למשך 20 עד 30 דקות. הערה: אין להישאר בחדר המעבדה במהלך תהליך חיטוי UV מטעמי בטיחות.</li>
	<li>תרבית תאי SKOV3 בצלחת פטרי בעלת תחתית זכוכית בקוטר 50 מ"מ למשך 12 שעות בתנאים פיזיולוגיים רגילים באינקובטור רגיל. הערה: התחל את תרבית התאים SKOV318 בארון בטיחות ביולוגית סטנדרטי.</li>
	<li>נתק את חתיכת האלומיניום המכונה 2 ממחזיק הדגימה על ידי הסרת הברגים. הערה: זוהי הדרך לפתוח את התא הגמיש כדי לטעון את צלחת תרבית התא.</li>
	<li>טוענים את צלחת תרבית התא. זכרו להוסיף שמן טבילה על החלק העליון של המעבה לפני הנחת צלחת תרבית התא. הסר את מכסה המנה ולשתק את המנה באמצעות מלחציים. הערה: כדי למנוע זיהום, כל הפעולות צריכות להתבצע עם כפפות.</li>
	<li>הנמיכו את המטרה למדיה של תרבית התאים למיקוד גס. מנמיכים את חתיכת האלומיניום 2 כדי לתחום את התא הגמיש ולהרכיב אותו על מחזיק הדגימה באמצעות ברגים. הערה: כרית כרית גומי סיליקון 2 מ"מ מחוברת לתחתית חתיכת אלומיניום 2 כדי לאטום את הרווח בחוזקה.</li>
	<li>הגדר את אספקת האוויר עם 5% CO 2 ו- 19% O2 לתרבית תאים רגילה עם קצב זרימת אוויר של 200 סמ"ק/דקה. הערה: ניתן להשתמש בקצב זרימת אוויר נמוך יותר. זה תלוי כמה טוב החדר הגמיש אטום.</li>
</ol>4. ערוך ניסויי הדמיה של SRS תאים חיים בהילוך מהיר
<ol><li>כוונן את אורך גל הלייזר ל- 805 ננומטר כדי לכוון להיסטת ראמאן 2854 ס"מ-1 , המיוחסת לרטט של קשרים כימיים CH2 . השתמש בעוצמת לייזר נמוכה כדי להפחית את נזקי האור לתאים. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בהספק ממוצע ~ 15 mW של לייזר המשאבה ו~ 7.5 mW של לייזר סטוקס (קבוע ב- 1,045 ננומטר) להדמיית תאים חיים לטווח ארוך. הערה: עוצמת לייזר גבוהה יותר תניב איכות הדמיה SRS טובה יותר. עם זאת, עוצמת לייזר גבוהה מדי תגרום נזק לאור לתאים חיים. יש פשרה בין איכות התמונה לבין נזקי האור.</li>
	<li>התאם ומקד את המטרה כדי להשיג הדמיית SRS טובה של התאים באמצעות לחצן FOCUS בלוח הבקרה הראשי של התוכנה. כדי לבצע מיקוד מהיר, הגדר את מספר הפיקסלים להיות 512 × 512 פיקסלים עם זמן שהייה של 4.8 μs בחלונית CONFIGURATION .</li>
	<li>הגדר את טווח הכניסה של מגבר הנעילה (בדרך כלל 5 mV) להיות כפול ממתח האות המרבי. הגדר את המסנן במעבר נמוך כך שיהיה זהה לזמן השהייה של הפיקסלים (4.8 μs). הערה: מערכות SRS שונות שנבנו במעבדה עשויות להשתמש בהגדרות שונות של איסוף נתונים.</li>
	<li>לאחר השגת מיקוד טוב, הגדר את רזולוציית ההדמיה להיות 2,048 × 2,048 פיקסלים עבור שדה ראייה של175 מיקרומטר 2 לרכישת תמונות באיכות גבוהה. בדוק את הפונקציה SAVE בחלונית MAIN CONTROLS ובדוק את ערוץ SRS בחלונית CHANNELS . הגדר את מרווח הזמן בין שתי מסגרות ל- 180 שניות (3 דקות) בערוץ הפקדים הראשיים. הגדר את מספר הרכישה ל- 480 עבור הדמיה בהילוך מהיר במשך 24 שעות. הערה: ניתן להשתמש ברזולוציית הדמיה נמוכה יותר בהתאם למטרת הניסויים.</li>
	<li>הפעל רכישת הדמיה אוטומטית באמצעות הפונקציה LOOP בלוח הבקרה הראשי . הערה: בדוק אם יש סחף מוקד עקב חוסר יציבות טמפרטורה בשעה הראשונה של ההדמיה. ייתכן שההדמיה של השעה הראשונה לא תהיה יציבה. בדוק את המיקוד כל 2-3 שעות במהלך סשן ההדמיה בהילוך מהיר.</li>
	<li>עבד את התמונות שנאספו באמצעות ImageJ19. השתמש בשתי השיטות הבאות לכימות LD: (i) יחס שטח גוף התא LD/תא, ו- (ii) עוצמת SRS הממוצעת של LDs הכולל. מדוד את שטח גוף התא על-ידי סף ואפס של הפיקסלים הלא-תאיים בתמונות SRS ב- 2,854 cm-1. מדדו את האזור והעוצמה של LD באמצעות סף ואפס של פיקסלים שאינם LD בתמונות SRS. הערה: פרטים נוספים על עיבוד תמונה SRS דווחו בעבר16.</li>
</ol>

<ol><li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMertz%2C+J+%22Introduction+to+Optical+Microscopy%22">Introduction to Optical Microscopy</a>. , Cambridge University Press. (2019).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phase+imaging+in+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phase imaging in biomedicine.</a> Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).</li>
<li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li>
<li>lamo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dye+labeling+changes+the+biodistribution+of+tumor-targeted+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1004(2020).</li>
<li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems%3A+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa870(2015).</li>
<li>Lu, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+DNA+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).</li>
<li>Hill, A. H., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+imaging+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).</li>
<li>Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBu%C4%91a%2C+R+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. (139), Elsevier. 81-101 (2017).</li>
<li>Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+forward+genetic+approach+to+identify+and+isolate+developmental+mutants+in+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61365(2020).</li>
<li>Lemon, W. C., McDole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+in+the+era+of+too+many+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging in the era of too many microscopes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).</li>
<li>Birk, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+oral+biofilms+by+nisin+delivery+in+adhesive+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).</li>
<li>Watanabe, I., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+on+growth+rate+of+cultured+mammalian+cells+%28L5178Y%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y).</a> Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).</li>
<li>Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLac%2C+A+%22Fluorescent+Microscopy%22">Fluorescent Microscopy</a>. , Springer. 57-73 (2022).</li>
<li>Grossman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machinable+glass-ceramics+based+on+tetrasilicic+mica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Ceramic+Society%22%5BJournal%5D)">Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica.</a> Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).</li>
<li>Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+fatty+acid-induced+lipotoxicity+and+its+therapeutic+potential+in+glioblastoma+using+stimulated+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).</li>
<li>Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+factors+that+influence+the+biocompatibility+of+cationic+liposomes+and+their+ability+to+deliver+DNA+to+the+nuclei+of+ovarian+cancer+SK-OV-3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells.</a> Materials. 14 (2), 416(2021).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Ozeki, Y., Itoh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+live-cell+imaging+with+high+contrast+and+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+Physics%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity.</a> Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+live-cell+imaging+of+nucleic+acids+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy.</a> ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).</li>
<li>Stiebing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+Raman+and+SRS+imaging+of+living+human+macrophages+reveals+cell-to-cell+heterogeneity+and+dynamics+of+lipid+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake.</a> Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).</li>
<li>Miao, K., Wei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+and+quantification+of+PolyQ+aggregates+by+stimulated+Raman+scattering+of+selective+deuterium+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling.</a> ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).</li>
<li>Brzozowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+scattering+microscopy+in+chemistry+and+life+science+-Development%2C+innovation%2C+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives.</a> Biotechnology Advances. 60, 108003(2022).</li>
<li>Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid+droplets+in+prostate+cells+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis.</a> Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).</li>
<li>Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+lipid+droplet+biology+with+coherent+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy.</a> Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353(2022).</li>
<li>Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+digital+quantification+of+lipid+droplets+in+single+cells+by+stimulated+Raman+microscopy+on+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform.</a> Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+scattering+flow+cytometry+for+label-free+single-particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis.</a> Optica. 4 (1), 103-109 (2017).</li>
<li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+chemical+imaging+flow+cytometry+by+high-speed+multicolor+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).</li>
<li>Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Raman+flow+cytometry+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput Raman flow cytometry and beyond.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).</li>
<li>Cole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging%3A+the+cell%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging: the cell's perspective.</a> Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 452-459 (2014).</li>
<li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).</li>
<li>Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+autofocus+methods+for+automated+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Comparison of autofocus methods for automated microscopy.</a> Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).</li>
<li>Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoreciprocity+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanoreciprocity in cell migration.</a> Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).</li>
<li>Zong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+single-molecule+detection+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-multiplex+vibrational+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Super-multiplex vibrational imaging.</a> Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

מיקרוסקופ SRS של תאים חיים בהילוך מהיר הוא טכניקת הדמיה חלופית למעקב אחר מולקולות באופן נטול תוויות. בהשוואה לתיוג פלואורסצנטי, הדמיית SRS אינה מלבינה פוטו, ומאפשרת ניטור ארוך טווח של מולקולות. עם זאת, נכון להיום, מערכת הדמיה של תאים חיים במיקרוסקופ SRS זקוף אינה זמינה מסחרית. בעבודה זו פותחה מערכת דימות תאים חיים עם קופסת מארז מיקרוסקופ יציבה מבודדת תרמית ותא רך פנימי גמיש כדי לאפשר דימות בהילוך מהיר SRS משודר. במערך זה, תיבת המארז הגדולה שומרת על יציבות טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, בעוד שהתא הרך הפנימי מספק אוויר לח כד...

מיקרוסקופ אופטי משמש להתבוננות במיקרו-מבנים של דגימות. הדמיה אופטית היא מהירה, פחות פולשנית ופחות הרסנית מטכנולוגיות אחרות1. דימות תאים חיים עם מיקרוסקופ אופטי פותח כדי ללכוד את הדינמיקה של תאים חיים בתרבית במשך תקופה ארוכה2. סוגים שונים של ניגודים אופטיים מספקים מידע ברור על דגימות ביולוגיות. לדוגמה, מיקרוסקופ פאזה אופטי מראה את ההבדל הדק במדדי השבירה על פני מדגם3. מיקרוסקופ פלואורסצנטי נמצא בשימוש נרחב כדי לדמיין ביומולקולות ספציפיות או אברונים תאיים. עם זאת, ספקטרום העירור והפליטה בפס רחב של פלואורסצנטיות גורם בדרך כלל לחפיפה ספקטרלית כאשר מתבצעת הדמיה מרובת צבעים4. מולקולות פלואורסצנטיות רגישות לאור וניתן להלבין אותן לאחר חשיפה תקופתית ארוכת טווח לאור. בנוסף, תיוג פלואורסצנטי עשוי לשנות את הפיזור הביולוגי של המולקולות בתאים5. מיקרוסקופ SRS הוא טכנולוגיית הדמיה כימית ללא תוויות6. הניגודיות של SRS מסתמכת על מעבר רטט של קשרים כימיים ספציפיים. תדירות הרטט של קשר כימי מציגה לעתים קרובות רוחב פס ספקטרלי צר, מה שהופך את זה אפשרי לצלם רצועות ראמאן מרובות באותן דגימות7. מיקרוסקופ SRS הוא כלי ייחודי להדמיית תאים חיים, המספק ניגודים כימיים מרובים באופן נטול תוויות8.
בעוד שהדמיית SRS של תאים לא מוכתמים שימשה במחקרים רבים, הדמיית SRS ארוכת טווח בהילוך מהיר של תאים חיים לא אומצה באופן נרחב. אחת הסיבות לכך היא שלא ניתן להשתמש ישירות בתאים פתוחים מסחריים להדמיית SRS בגלל עוביים הגדול 9,10,11,12. תאים אלה עם מכסה זכוכית מתוכננים בעיקר עבור הדמיה של שדה בהיר או פלואורסצנטי באמצעות מטרת NA גבוהה אחת עם סכימת זיהוי לאחור. עם זאת, הדמיית SRS מעדיפה גילוי משודר הן באמצעות מטרת NA גבוהה והן באמצעות מעבה NA גבוה, אשר משאיר רק מרווח קצר מאוד (בדרך כלל כמה מילימטרים) בין המטרה לבין המעבה. כדי להתגבר על בעיה זו, תכננו תא גמיש באמצעות חומר רך כדי לאפשר הדמיית SRS בהילוך מהיר של תאים חיים באמצעות מסגרת מיקרוסקופ זקוף. בתכנון זה, מטרת טבילת המים הייתה סגורה בתא הרך ויכולה לנוע בחופשיות בתלת מימד למטרות מיקוד והדמיה.
הטמפרטורה האופטימלית לגידול רוב תאי היונקים היא 37 מעלות צלזיוס, בעוד שטמפרטורת החדר תמיד נמוכה ב -10 מעלות מכך. טמפרטורה גבוהה או נמוכה מ 37 °C יש השפעה דרמטית על קצב צמיחת התאים13. לכן, בקרת טמפרטורה של סביבת תרבית התא נדרשת במערכת דימות של תאים חיים. ידוע כי חוסר יציבות טמפרטורה יוביל לבעיות מיקוד במהלך הדמיה ארוכת טווח14. כדי להשיג סביבה יציבה של 37°C, בנינו תא מארז גדול שיכסה את כל מסגרת המיקרוסקופ, כולל שכבת בידוד תרמי מתחת למיקרוסקופ (איור 1). בתוך תא בקרת הטמפרטורה הגדול, התא הקטן והגמיש עוזר לשמור במדויק על הלחות הפיזיולוגית ועל רמת החומציות באמצעות זרימת האוויר המווסתת בתוספת 5% CO 2 (איור 2). הטמפרטורה והלחות של התאים נמדדו כדי לאשר שהתכנון הדו-תאי סיפק את תנאי תרבית התאים האופטימליים לצמיחת תאים בהדמיית SRS תקופתית ארוכת טווח (איור 3). לאחר מכן הדגמנו את היישום של המערכת עבור דימות בהילוך מהיר ומעקב אחר טיפות שומנים (LDs) בתאי סרטן SKOV3 (איור 4, איור 5 ואיור 6).

<table><tbody><tr><td><חזק> מיקרוסקופ SRS שנבנה במעבדה</חזק></td><td></td><td></td><td>https://rdcu.be/cP6ve</td></tr><tr><td>מגבר נעילה HF2LI 50 מגה-הרץ</td><td>ציריך אינסטרומנטס</td><td>HF2LI</td><td></td></tr><tr><td>דיאפרגמת איריס</td><td>Thorlabs</td><td>Inc SM1D12</td><td></td></tr><tr><td>תושבת מראה קינמטית</td><td>Thorlabs Inc</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>מסגרת מיקרוסקופ</td><td>Nikon Inc</td><td>FN-1</td><td></td></tr><tr><td>שלב מיקרוסקופיה ממונעת</td><td>מעבה טבילה בשמן</td><td>Z-Deck</td><td></td>(</tr><tr><td>C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)</td><td>Nikon Inc</td><td>MBL71405</td><td></td></tr><tr><td>מטרת טבילה במים (CFI75 Apo 25XC W 1300)</td><td>Nikon Inc</td><td>MRD77225</td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומרים וחלקים למארז המיקרוסקופ (31 אינץ' x 29 אינץ' x 28 אינץ' אורך x רוחב x גובה)</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מודול מחמם Airtherm</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td> <td>AIRTHERM-SAT-1W</td><td></td></tr><tr><td>בקר מחמם Airtherm, CO2 וצג לחות</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td> <td>AIRTHERM-SMT-1W</td><td></td></tr><tr><td>מודול מיקסר אוויר/CO<תת>2 World</td><td>Precision Instruments (WPI)</td><td>ECU-HOC-W</td><td></td></tr><tr><td>צינור צינור גמיש (2-1/2 אינץ' ID, 2-3/4 אינץ' OD)</td><td>מקמאסטר-קאר</td><td>56675K71</td><td></td></tr><tr><td>קרמיקה זכוכית-נציץ בטמפרטורה גבוהה, קלה למכונה (6 אינץ' x 6 אינץ', עובי 1/4 אינץ')</td> <td>מקמאסטר-קאר</td><td>8489K62</td><td></td></tr><tr><td>יריעות פוליקרבונט (עובי 0.25 אינץ')</td><td>מקמאסטר-קאר</td><td>8574K286</td><td></td></tr><tr><td>יריעות גומי סיליקון (36 אינץ' x 36 אינץ', עובי 1/8 אינץ')</td> <td>McMaster-Carr</td><td>5827T43</td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומרים וחלקים לתא גמיש</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלטה חמה</td><td>McMaster-Carr</td><td>31745K11</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מוטבע בטוהר גבוה, 1/4 NPT</td><td>McMaster-Carr</td><td>6645T18</td><td></td></tr><tr><td>מסור (קוטר חיתוך 1-7/8 אינץ')</td> <td>McMaster-Carr</td><td>4066A34</td><td></td></tr><tr><td>מסור (קוטר חיתוך 50 מ"מ)</td><td>McMaster-Carr</td><td>4556A19</td><td></td></tr><tr><td>צינורות גומי סיליקון בטמפרטורה גבוהה, רכים, 2 מ"מ ID, 5 מ"מ OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5054K313</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מוטבע (1/4 NPT, 40 מיקרון)</td><td>McMaster-Carr</td><td>98385K843</td><td></td></tr><tr><td>צינור עגול אלומיניום רב תכליתי 6061 (עובי דופן 1/8 אינץ', 4 אינץ' ' OD)</td> <td>McMaster-Carr</td><td>9056K42</td><td></td></tr><tr><td>רב תכליתי 6061 צינור עגול אלומיניום (עובי דופן 3/4 אינץ', 3-3/4 אינץ' OD)</td> <td>מקמאסטר-קאר</td><td>9056K47</td><td></td></tr><tr><td>מוט אלומיניום רב תכליתי 6061 (12 אינץ' x 12 אינץ', עובי 1/4 אינץ')</td> <td>מקמאסטר-קאר</td><td>8975K142</td><td></td></tr><tr><td>מוט אלומיניום רב תכליתי 6061 (8 אינץ' x 8 אינץ', עובי 3/8 אינץ' ')</td><td>McMaster-Carr</td><td>9246K21</td><td></td></tr><tr><td>אף אובייקטיבי (יחיד)</td><td>Nikon Inc</td><td>FN-MN-H</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מדגם (שונה)</td><td>Pre Scientific</td><td>HZ202</td><td></td></tr><tr><td>סרט גומי טבעי דק במיוחד (עובי 0.01'')</td><td>McMaster-Carr</td><td>8611K13</td><td></td></tr><tr><td>צנצנת זכוכית הניתנת לאטימה בוואקום</td><td>McMaster-Carr</td><td>3231T44</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (פיג'י)imagej.net</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ScanImage</td><td>Vidrio Technologies, LLC</td><td></td><td>תוכנת הדמיה SRS</td></tr> <tr><td><חזק>חומרים להדמיית תאים חיים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכסים כלי תרבית סטריליים עם תחתית זכוכית (Dia.x H, 50 x 7 מ"מ)</td> <td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית (EMS)</td><td>70674-02</td><td></td></tr><tr><td>מדיום תרבית תאים DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>LysoSensor צבע פלואורסצנטי DND-189</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L7535 (Invitrogen)</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אולאית</td><td>MilliporeSigma</td><td>364525</td><td></td></tr><tr><td>קו תאים SKOV3</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr></tbody></table>

תא גמיש להדמיית תאים חיים בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה (SRS) הוא טכנולוגיית הדמיה כימית ללא תוויות. דימות תאים חיים עם SRS הוכח עבור יישומים ביולוגיים וביו-רפואיים רבים. עם זאת, הדמיית SRS ארוכת טווח בהילוך מהיר של תאים חיים לא אומצה באופן נרחב. מיקרוסקופ SRS משתמש לעתים קרובות ביעד טבילה במים עם צמצם מספרי גבוה (NA) ובמעבה טבילת שמן NA גבוה כדי להשיג הדמיה ברזולוציה גבוהה. במקרה זה, הפער בין המטרה לבין המעבה הוא רק כמה מילימטרים. לכן, רוב התאים הסביבתיים המסחריים אינם יכולים לשמש להדמיית SRS בגלל עוביים הגדול עם כיסוי זכוכית קשיח. מאמר זה מתאר את התכנון והייצור של תא גמיש שניתן להשתמש בו להדמיית תאים חיים בהילוך מהיר עם זיהוי אותות SRS המשודרים במסגרת מיקרוסקופ זקוף. הגמישות של החדר מושגת באמצעות חומר רך - סרט גומי טבעי דק. ניתן להוסיף בקלות את המארז החדש ואת עיצוב התא למערך הדמיה SRS קיים. הבדיקות והתוצאות הראשוניות מראות כי מערכת התא הגמישה מאפשרת הדמיית SRS יציבה, ארוכת טווח ובהילוך מהיר של תאים חיים, אשר תוכל לשמש ליישומי הדמיה ביולוגית שונים בעתיד.

ייצרנו והרכבנו את מערכת התאים הגמישים להדמיית SRS בהילוך מהיר (איור 1 ואיור 2), ולאחר מכן הערכנו את ביצועי המערכת. הטמפרטורה בתוך המתחם הסביבתי של המיקרוסקופ הגיעה ל-37 מעלות צלזיוס הצפויות בתוך שעה אחת, מה שלא השפיע באופן משמעותי על טמפרטורת החדר (איור 3A). הטמפרטורה בתא הגמיש הגיעה ל-37 מעלות צלזיוס תוך שעה וחצי, והיא נשמרה ביציבות ב-37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות לפחות (איור 3B). הלחות היחסית בתא הגמיש...

אנו מדווחים על תא סביבתי גמיש ומתקדם להדמיה בהילוך מהיר של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה זקוף עם זיהוי אותות משודרים. טיפות שומנים צולמו בתאי SKOV3 שטופלו בחומצה אולאית למשך עד 24 שעות במרווח זמן של 3 דקות.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

טכניקת התא הסביבתי הגמישה מאפשרת קיטועי זמן כהדמיית SRS עם זיהוי אותות משודרים במסגרת מיקרוסקופ הפעלה. מיקרוסקופ SRS השתמש ביעד צמצם מספרי גבוה ובמעבה בעל קצה גבוה, והשאיר רק מרווח של מילימטרים ספורים שבו תא קונבנציונלי אינו יכול להתאים. תא גמיש פותר בעיה זו.חוקרים המשתמשים במיקרוסקופ SRS יכולים לאמץ בקלות טכניקה זו. ניתן להשתמש בתא הגמיש גם במיקרוסקופ מנתח או סטרילי כדי לשמור על הדגימה בתנאים פיזיולוגיים אופטימליים. כדי להתחיל, סמן את מיקומי כפות הרגליים של מסגרת המיקרוסקופ SRS ואת השלב הממונע באמצעות עט סמן על השולחן האופטי.לאחר הסרת מסגרת המיקרוסקופ והבמה מהשולחן האופטי, הניחו את יריעת גומי הסיליקון על השולחן. חותכים את גומי הסיליקון לאורך הסימנים באמצעות סכין. הוציאו חתיכות גומי קטנות, והניחו את יריעות הנציץ הקרמיות המרובעות באותם מיקומים.לאחר מכן הזיזו את מסגרת המיקרוסקופ ואת הבמה בחזרה לשולחן האופטי ויישרו בזהירות את כפות הרגליים על יריעות הנציץ הקרמיות לאורך קווי הסמן. לאחר יישור מחדש של הנתיב האופטי SRS, הרכיבו את המארז הסביבתי על גבי בסיס הבידוד התרמי כדי לכסות את כל מסגרת המיקרוסקופ, באמצעות חמש חתיכות של יריעות פוליקרבונט גדולות. אטמו את הקצוות והממשקים של הקופסה באמצעות נייר אלומיניום.חבר את צינור התעלה הגמיש לכניסה וליציאות היציאה של תיבת המארז כדי לאפשר זרימת אוויר חם במחזור הדם הנשאב ונשלט על ידי מודול המחמם. הרכיבו את חתיכת האלומיניום הגלילית החלולה במכונה 1 לחתיכת האף של המטרה באמצעות שלושה ברגים קבועים. לאחר מכן, הרכיבו את פיסת האלומיניום הגלילית החלולה במכונה 2 למחזיק הדגימה באמצעות ארבעה ברגים.הכנס את מחזיק הדגימה עם חתיכת אלומיניום 2 על הבמה הממונעת והרכיב אותו באמצעות ברגים. הניחו את שרוול סרט הגומי הטבעי בין שני חלקי האלומיניום המיוצרים במכונה והרכיבו אותו באמצעות גומיות בכל קצה. חבר את גליל ה- CO2 הדחוס למודול מערבל הגז באמצעות צינורות ומחברים מתאימים.הגדר את לחץ הכניסה של CO2 על 20 עד 25 psi. השתמש בחיישן CO2 המובנה ובבקר כדי להבטיח שמודול מערבל האוויר יכול לווסת ולערבב 5% CO2 בזרימת האוויר. השתמש במסננים מוטבעים כדי לנקות את זרימת האוויר.באמצעות צינורות ומחברים מתאימים, כוונו את האוויר המעורב לבקבוק המים המעוקר מראש שהונח על הפלטה החמה ולאחר מכן כוונו את האוויר הלח לתא הגמיש. כוונו את הפלטה החמה ל-37 מעלות צלזיוס. בוערו את זרימת האוויר במים החמים כדי להגביר את הלחות של זרימת האוויר.נתק את המכונה אלומיניום חתיכת 2 ממחזיק הדגימה על ידי הסרת הברגים. נגבו את כל חלקי התא הגמיש עם 70% אתנול, כולל פיסת האף, מחזיק הדגימה ויעד טבילת המים. לטהר את כל מערכת המארז באמצעות מנורת UV להציב במארז במשך 20 עד 30 דקות.לאחר מכן לטעון את צלחת תרבית התא. הסר את מכסה המנה ולשתק אותו באמצעות מלחציים. הנמיכו את המטרה למדיה של תרבית התאים למיקוד גס.מנמיכים את חתיכת האלומיניום 2 כדי לתחום את התא הגמיש ולהרכיב אותו על מחזיק הדגימה באמצעות ברגים. לאחר מכן הכנס את החיישן. הגדר את אספקת האוויר עם 5% CO2 ו- 19% O2 לתרבית תאים רגילה עם קצב זרימת אוויר של 200 סנטימטרים מעוקבים לדקה וטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס.כוונן את אורך גל הלייזר ל 805 ננומטר כדי לכוון את שינוי ראמאן הופכי 2, 854 סנטימטר, אשר מיוחס לרטט של קשרים כימיים CH2. השתמש בעוצמת לייזר נמוכה כדי להפחית את נזקי הצילום לתאים. התאם ומקד את המטרה כדי להשיג הדמיית SRS טובה של התאים באמצעות לחצן המיקוד בלוח הבקרה הראשי של התוכנה.כדי לבצע מיקוד מהיר, הגדר את מספר הפיקסלים ל- 512 על 512 פיקסלים עם זמן שהייה של 4.8 מיקרו-שניות בלוח התצורה. לאחר השגת מיקוד טוב, הגדר את רזולוציית ההדמיה להיות 2048 על ידי 2048 פיקסלים עבור שדה ראייה בריבוע של 175 מיקרומטר לרכישת תמונות באיכות גבוהה. בדוק את פונקציית השמירה בלוח הבקרה הראשי ובדוק את ערוץ SRS בחלונית הערוצים.הגדר את מרווח הזמן בין שתי מסגרות ל- 180 שניות בערוץ הפקדים הראשי. הגדר את מספר הרכישה ל- 480 עבור הדמיה בהילוך מהיר במשך 24 שעות. הפעל רכישת הדמיה אוטומטית באמצעות פונקציית הלולאה בלוח הבקרה הראשי.הביצועים של מערכת התא הגמיש להדמיית SRS בהילוך מהיר הוערכו. הטמפרטורה בתוך המתחם הסביבתי במיקרוסקופ הגיעה ל-37 מעלות צלזיוס הצפויות ולא השפיעה באופן משמעותי על טמפרטורת החדר. הטמפרטורה בתא הגמיש הגיעה ל-37 מעלות צלזיוס תוך שעה וחצי ונשמרה ביציבות במשך 24 שעות לפחות.הלחות היחסית בתא הגמיש הגיעה ל-85% בשעה אחת וניתן היה לשמור עליה לפחות 24 שעות. הדמיית SRS בהילוך מהיר של תאי SKOV3 חיים הראתה תנועה מהירה ופעילה של טיפות שומנים תוך תאיות ברזולוציה זמנית של שלוש דקות. בסוף סשן ההדמיה שארך 24 שעות, התאים עדיין הראו מורפולוגיה וצפיפות תקינות, מה שמצביע על כך שהתאים היו בריאים.לאחר מכן, תאי SKOV3 שטופלו בחומצה אולאית צולמו והצטברות טיפות שומנים הייתה במעקב במשך 10 שעות. כמויות טיפות השומנים כומתו באמצעות יחס טיפת השומנים לשטח גוף התא ועוצמת SRS הכוללת של טיפות השומנים. התוצאות מצביעות על כך שכמות טיפות השומנים המשיכה לעלות במשך 10 שעות.כמו כן הודגמה הדמיית SRS קדמית סימולטנית של טיפות שומנים והדמיית פלואורסצנטיות של שני פוטונים לאחור של ליזוזומים המסומנים בצבע פלואורסצנטי DND-189. נצפתה רמה נמוכה מאוד של קולוקליזציה של טיפות שומנים וליזוזומים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור כי נדידת מוקד היא בעיה נפוצה בדימות תאים חיים.ייתכן שיהיה צורך במיקוד מחדש לאחר כשעתיים של הדמיה בהילוך מהיר. לאחר פיתוחו, הדמיית SRS בהילוך מהיר שימשה למחקרים שונים כדי לעקוב אחר מולקולות ללא תוויות או מולקולות מסומנות עם טקסט ראמאן בתאים חיים.

a-flexible-chamber-for-time-lapse-live-cell-imaging-with-stimulated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מקור: ז'אנג, מ. ואח', בדיקת רגישות אנטימיקרוביאלית מהירה באמצעות הדמיית פיזור ראמן מגורה של שילוב דויטריום בחיידק יחיד. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון הזה מדגים את השימוש במיקרוסקופ פיזור רמאן המגרה להערכת רגישות לאנטיביוטיקה על ידי מעקב אחר פעילות מטבולית מסומנת בדויטריום. על ידי ניטור אותות פחמן-דויטריום, השיטה מאפשרת זיהוי מהיר של אוכלוסיות חיידקים עמידות ורגישות.

זיהוי רגישות לאנטיביוטיקה חיידקית באמצעות מיקרוסקופ פיזור ראמן מגורה

מקור: Espinoza, R.,  et al. הדמיית פיזור רמאן מגורה בשני צבעים בזמן אמת של מוח עכבר לצורך אבחון רקמות. J. Vis. exp. (2022).  הסרטון מדגים הדמיית פיזור רמאן מגורה בשני צבעים (SRS) של מקטעי רקמת מוח של עכבר. שתי קרני לייזר מסונכרנות מכוונות אל קטע הרקמה כדי לעורר תנודות מולקולריות, וכתוצאה מכך שינוי עוצמה יחסי בקרניים. שומנים וחלבונים ברקמה מתגלים באמצעות זוגות תדרים מובחנים של קרני הלייזר. לאחר מכן מוקצים לאותות המתקבלים צבעים נפרדים, ויוצרים תמונה דו-צבעונית המסייעת בזיהוי החלבונים והשומנים...

הדמיית פיזור רמאן מגורה בשני צבעים של רקמת מוח של עכבר

מאמר זה מספק מדריך מעמיק להרכבה ותפעול של מיקרוסקופ תאורה מובנה הפועל עם תאורה פלואורסצנטית השתקפות פנימית כוללת (TIRF-SIM) כדי לדמות תהליכים ביולוגיים דינמיים עם רזולוציית על אופטית במספר צבעים.

A Guide to מיקרוסקופית TIRF תאורה מובנית ב- High Speed ​​עם צבעים מרובים

הדמיה של קרום פלזמה מבודדים הן, אמצעי האחסון תאיים שמסביב, המיקרוסקופ המשוכלל כי היתר ברזולוציה גבוהה ומהירה יוצגו. השילוב של ספינינג דיסק וסיכום השתקפות פנימית פלורסצנטיות מיקרוסקופ בהגדרת אחד מאפשר ניסויים הדמיה חיה במחירים רכישה גבוהה עד 3.5 לשנייה בכל אוסף תמונות.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

בכתב יד זה, היישום של מיקרוסקופ ראמאן מגורה (SRS), המתקבל על ידי שילוב של הגדרת הניסוי SRS הערכה עם מיקרוסקופ סריקת לייזר, מתואר. מיקרוסקופ SRS מבוסס על שני מקורות לייזר (שניים), טי-ספיר (Ti: Sa) ומתנד פרמטרי אופטי מסונכרן (פופו).

יישום של מיקרוסקופ לא לינארית על בסיס פיזור ראמאן מגורה

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה סלקטיבית ונטולת תווית של moieties כימיים ספציפיים והיא שימשה ביעילות כדי לדמות מולקולות השומנים ב vivo. כאן, אנו מספקים היכרות קצרה עם העיקרון של מיקרוסקופיה SRS ומתארים שיטות לשימוש בו באחסון השומנים הדמיה ב Caenorhabditis elegans.

הדמיה ללא תווית של דינמיקת אחסון השומנים באלגנים של Caenorhabditis באמצעות מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה ללא תוויות של ביומולקולות המבוססות על הרטט הפנימי שלהם של קשרים כימיים ספציפיים. בפרוטוקול זה, ההתקנה האינסטרומנטלית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב של SRS ושני פוטונים מתוארת כדי לדמיין מבנים תאיים בחוט השדרה של עכברים חיים.

In vivo הדמיה של רקמות ביולוגיות עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) היא טכניקת הדמיה עוצמתית, לא פולשנית ונטולת תוויות. יישום מתפתח אחד הוא היסטולוגיה של ראמאן, שבה הדמיית SRS בשני צבעים במעברי החלבון והשומנים ראמאן משמשת ליצירת תמונות פסאודו-המטוקסילין ואוזין. כאן אנו מדגימים פרוטוקול להדמיית SRS בשני צבעים בזמן אמת לאבחון רקמות.

בזמן אמת, שני צבעים מגורה Raman פיזור הדמיה של מוח עכבר לאבחון רקמות

מאמר זה משווה באופן ישיר את ניגודי הרזולוציה, הרגישות וההדמיה של פיזור ראמאן מגורה (SRS) ופיזור ראמן קוהרנטי נגד סטוקס (CARS) המשולבים באותה פלטפורמת מיקרוסקופ. התוצאות מראות של-CARS יש רזולוציה מרחבית טובה יותר, SRS נותן ניגודים טובים יותר ורזולוציה ספקטרלית טובה יותר, ולשתי השיטות יש רגישות דומה.

השוואה ישירה של פיזור ראמן מגורה היפרספקטרלי ומיקרוסקופיית פיזור ראמן אנטי-סטוקס קוהרנטית להדמיה כימית

אנו מציגים פרוטוקול לרכישת תמונות כימיות עם מיקרוסקופיית פיזור ראמאן (SRS) בפס רחב. בהתבסס על מיקרוסקופ SRS הפועל עם זיהוי דיפרנציאלי רב-ערוצי-נעילה, הפרוטוקול מתאר את הכנת הדגימה, התאמת מנגנון ה-SRS והכימומטריקה כדי לנטרל מרכיבים שונים של דגימות הטרוגניות מבחינה כימית.

הדמיה כימית מולטיפלקס מבוססת על מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה בפס רחב

למדו כיצד לבנות תא גמיש להדמיית תאים חיים בהילוך מהיר באמצעות מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה. השיטה מאפשרת מעקב אחר דינמיקת טיפות שומן בתאי SKOV3 לאורך 24 שעות.

תא גמיש להדמיית תאים חיים בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה

גלה סרטונים נוספים