תא גמיש להדמיית תאים חיים בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה

טכניקת התא הסביבתי הגמישה מאפשרת קיטועי זמן כהדמיית SRS עם זיהוי אותות משודרים במסגרת מיקרוסקופ הפעלה. מיקרוסקופ SRS השתמש ביעד צמצם מספרי גבוה ובמעבה בעל קצה גבוה, והשאיר רק מרווח של מילימטרים ספורים שבו תא קונבנציונלי אינו יכול להתאים. תא גמיש פותר בעיה זו.

חוקרים המשתמשים במיקרוסקופ SRS יכולים לאמץ בקלות טכניקה זו. ניתן להשתמש בתא הגמיש גם במיקרוסקופ מנתח או סטרילי כדי לשמור על הדגימה בתנאים פיזיולוגיים אופטימליים. כדי להתחיל, סמן את מיקומי כפות הרגליים של מסגרת המיקרוסקופ SRS ואת השלב הממונע באמצעות עט סמן על השולחן האופטי.

לאחר הסרת מסגרת המיקרוסקופ והבמה מהשולחן האופטי, הניחו את יריעת גומי הסיליקון על השולחן. חותכים את גומי הסיליקון לאורך הסימנים באמצעות סכין. הוציאו חתיכות גומי קטנות, והניחו את יריעות הנציץ הקרמיות המרובעות באותם מיקומים.

לאחר מכן הזיזו את מסגרת המיקרוסקופ ואת הבמה בחזרה לשולחן האופטי ויישרו בזהירות את כפות הרגליים על יריעות הנציץ הקרמיות לאורך קווי הסמן. לאחר יישור מחדש של הנתיב האופטי SRS, הרכיבו את המארז הסביבתי על גבי בסיס הבידוד התרמי כדי לכסות את כל מסגרת המיקרוסקופ, באמצעות חמש חתיכות של יריעות פוליקרבונט גדולות. אטמו את הקצוות והממשקים של הקופסה באמצעות נייר אלומיניום.

חבר את צינור התעלה הגמיש לכניסה וליציאות היציאה של תיבת המארז כדי לאפשר זרימת אוויר חם במחזור הדם הנשאב ונשלט על ידי מודול המחמם. הרכיבו את חתיכת האלומיניום הגלילית החלולה במכונה 1 לחתיכת האף של המטרה באמצעות שלושה ברגים קבועים. לאחר מכן, הרכיבו את פיסת האלומיניום הגלילית החלולה במכונה 2 למחזיק הדגימה באמצעות ארבעה ברגים.

הכנס את מחזיק הדגימה עם חתיכת אלומיניום 2 על הבמה הממונעת והרכיב אותו באמצעות ברגים. הניחו את שרוול סרט הגומי הטבעי בין שני חלקי האלומיניום המיוצרים במכונה והרכיבו אותו באמצעות גומיות בכל קצה. חבר את גליל ה- CO2 הדחוס למודול מערבל הגז באמצעות צינורות ומחברים מתאימים.

הגדר את לחץ הכניסה של CO2 על 20 עד 25 psi. השתמש בחיישן CO2 המובנה ובבקר כדי להבטיח שמודול מערבל האוויר יכול לווסת ולערבב 5% CO2 בזרימת האוויר. השתמש במסננים מוטבעים כדי לנקות את זרימת האוויר.

באמצעות צינורות ומחברים מתאימים, כוונו את האוויר המעורב לבקבוק המים המעוקר מראש שהונח על הפלטה החמה ולאחר מכן כוונו את האוויר הלח לתא הגמיש. כוונו את הפלטה החמה ל-37 מעלות צלזיוס. בוערו את זרימת האוויר במים החמים כדי להגביר את הלחות של זרימת האוויר.

נתק את המכונה אלומיניום חתיכת 2 ממחזיק הדגימה על ידי הסרת הברגים. נגבו את כל חלקי התא הגמיש עם 70% אתנול, כולל פיסת האף, מחזיק הדגימה ויעד טבילת המים. לטהר את כל מערכת המארז באמצעות מנורת UV להציב במארז במשך 20 עד 30 דקות.

לאחר מכן לטעון את צלחת תרבית התא. הסר את מכסה המנה ולשתק אותו באמצעות מלחציים. הנמיכו את המטרה למדיה של תרבית התאים למיקוד גס.

מנמיכים את חתיכת האלומיניום 2 כדי לתחום את התא הגמיש ולהרכיב אותו על מחזיק הדגימה באמצעות ברגים. לאחר מכן הכנס את החיישן. הגדר את אספקת האוויר עם 5% CO2 ו- 19% O2 לתרבית תאים רגילה עם קצב זרימת אוויר של 200 סנטימטרים מעוקבים לדקה וטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס.

כוונן את אורך גל הלייזר ל 805 ננומטר כדי לכוון את שינוי ראמאן הופכי 2, 854 סנטימטר, אשר מיוחס לרטט של קשרים כימיים CH2. השתמש בעוצמת לייזר נמוכה כדי להפחית את נזקי הצילום לתאים. התאם ומקד את המטרה כדי להשיג הדמיית SRS טובה של התאים באמצעות לחצן המיקוד בלוח הבקרה הראשי של התוכנה.

כדי לבצע מיקוד מהיר, הגדר את מספר הפיקסלים ל- 512 על 512 פיקסלים עם זמן שהייה של 4.8 מיקרו-שניות בלוח התצורה. לאחר השגת מיקוד טוב, הגדר את רזולוציית ההדמיה להיות 2048 על ידי 2048 פיקסלים עבור שדה ראייה בריבוע של 175 מיקרומטר לרכישת תמונות באיכות גבוהה. בדוק את פונקציית השמירה בלוח הבקרה הראשי ובדוק את ערוץ SRS בחלונית הערוצים.

הגדר את מרווח הזמן בין שתי מסגרות ל- 180 שניות בערוץ הפקדים הראשי. הגדר את מספר הרכישה ל- 480 עבור הדמיה בהילוך מהיר במשך 24 שעות. הפעל רכישת הדמיה אוטומטית באמצעות פונקציית הלולאה בלוח הבקרה הראשי.

הביצועים של מערכת התא הגמיש להדמיית SRS בהילוך מהיר הוערכו. הטמפרטורה בתוך המתחם הסביבתי במיקרוסקופ הגיעה ל-37 מעלות צלזיוס הצפויות ולא השפיעה באופן משמעותי על טמפרטורת החדר. הטמפרטורה בתא הגמיש הגיעה ל-37 מעלות צלזיוס תוך שעה וחצי ונשמרה ביציבות במשך 24 שעות לפחות.

הלחות היחסית בתא הגמיש הגיעה ל-85% בשעה אחת וניתן היה לשמור עליה לפחות 24 שעות. הדמיית SRS בהילוך מהיר של תאי SKOV3 חיים הראתה תנועה מהירה ופעילה של טיפות שומנים תוך תאיות ברזולוציה זמנית של שלוש דקות. בסוף סשן ההדמיה שארך 24 שעות, התאים עדיין הראו מורפולוגיה וצפיפות תקינות, מה שמצביע על כך שהתאים היו בריאים.

לאחר מכן, תאי SKOV3 שטופלו בחומצה אולאית צולמו והצטברות טיפות שומנים הייתה במעקב במשך 10 שעות. כמויות טיפות השומנים כומתו באמצעות יחס טיפת השומנים לשטח גוף התא ועוצמת SRS הכוללת של טיפות השומנים. התוצאות מצביעות על כך שכמות טיפות השומנים המשיכה לעלות במשך 10 שעות.

כמו כן הודגמה הדמיית SRS קדמית סימולטנית של טיפות שומנים והדמיית פלואורסצנטיות של שני פוטונים לאחור של ליזוזומים המסומנים בצבע פלואורסצנטי DND-189. נצפתה רמה נמוכה מאוד של קולוקליזציה של טיפות שומנים וליזוזומים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור כי נדידת מוקד היא בעיה נפוצה בדימות תאים חיים.

ייתכן שיהיה צורך במיקוד מחדש לאחר כשעתיים של הדמיה בהילוך מהיר. לאחר פיתוחו, הדמיית SRS בהילוך מהיר שימשה למחקרים שונים כדי לעקוב אחר מולקולות ללא תוויות או מולקולות מסומנות עם טקסט ראמאן בתאים חיים.