Name: שיטה מדרגית ומבוססת תאים להערכה פונקציונלית של גרסאות Ube3a (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: למד שיטה מדרגית להערכת השפעת גרסאות missense בגן Ube3a, ליגאזת אוביקוויטין הקשורה בתסמונת אנגלמן ובאוטיזם. השיטה משתמשת בתאי HEK293T ומדידת לוציפראז כדי לזהות גרסאות עם אובדן או רכישת פונקציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרס גשר לעצמאות של קרן סימונס (פרס SFARI #387972; J.J.Y.), פרס חוקר צעיר של NARSAD מהקרן לחקר המוח וההתנהגות (J.J.Y.), מלגת מחקר מקרן אלפרד פ. סלואן (J.J.Y.), ומענקי מחקר מקרן תסמונת אנג'למן (J.J.Y.), קרן וייטהול (J.J.Y.) ו- NIMH (R01MH122786; ג'יי.ג'יי.).

1. שיבוט מוטגנזה ליצירת גרסאות Ube3a
<ol><li>שכפלו את כל גרסאות Ube3a לפלסמיד pCIG2 (איור 1A), וקטור ביקיסטרוני המכיל מקדם עוף-β-אקטין ואתר כניסה לריבוזום פנימי (IRES) עבור ביטוי EGFP19. מבנים באורך מלא של Ube3a מכילים רצף תגי Myc מסוף N והם משוכפלים ל-pCIG2 באמצעות אתר SacI בגודל 5' ואתר XmaI בגודל 3 אינץ'. בנוסף, אתרי EcoRI, EcoRV ו-PstI טבעיים בתוך רצף הקידוד Ube3a משמשים גם להחלקת שברים. הערה: ניתן להשיג גרסאות לא מזוהות עבור Ube3a באמצעות הספרות ובמאגרים נגישים לציבור כגון מסד הנתונים ClinVar1. גרסאות נוספות שאינן מדווחות ניתן להשיג באמצעות תקשורת אישית עם מרכזים רפואיים.</li>
	<li>השתמש בשיטת מוטגנזה דו-שלבית מותאמת של מגה-פרימר20 כדי להכניס מוטציות למסגרת הקריאה של Ube3a . בשלב הראשון, תכננו את האוליגונוקלאוטיד המוטגני המכיל את המוטציה הרצויה (הדוגמה המוצגת בפרוטוקול זה היא יצירת וריאנט UBE3A Q588E) שלצדו לפחות 30 זוגות בסיסים (bp) של הומולוגיה 5′ ו-3′ למוטציה (איור 1B וטבלה 1).</li>
	<li>השתמשו באוליגונוקלאוטיד המוטגני יחד עם אוליגונוקלאוטיד משלים עבור ה-PCR בסיבוב הראשון כדי ליצור מגה-פרימר של 200-400 bp המכיל את המוטציה (איור 1C; טבלה 2 וטבלה 3). השתמש בכל 50 μL של נפח התגובה PCR עבור אלקטרופורזה ג'ל agarose באמצעות ג'ל 1% וטיהור ג'ל לאחר מכן (טבלת חומרים). יש להצמיד את מוצר ה-PCR ב-30 μL שלH2O שעבר דה-יוניזציה (diH2O) לשימוש בסיבוב השני של ה-PCR בשלב הבא.</li>
	<li>הגדר את ה-PCR בסיבוב השני כפי שצוין (איור 1C; טבלה 2 וטבלה 3). שלב זה ייצור מקטעי דנ"א גדולים יותר (בדרך כלל באורך של ~1-1.5 קילובייט) המכילים את אתרי המוטציה וההגבלה הסופית המתאימים לשיבוט משנה (איור 1C).</li>
	<li>לאחר השלמת תגובת ה-PCR, יש לטהר את המוצר המתקבל באמצעות ערכת טיהור PCR (טבלת חומרים). יש לעכל ב-30 μL ולעכל את כל המוצר המטוהר ואת מבנה ה-pCIG2 Ube3a WT עם אנזימי ההגבלה המתאימים (הדוגמה מראה עיכול עם EcoRI ו-XmaI).</li>
	<li>לאחר שעתיים של עיכול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, פתרו את תוצרי העיכול באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז (1% ג'ל), וטיהרו את המוצרים המתאימים באמצעות ג'ל. הגדר קשירת בהתאם לפרוטוקול היצרן (טבלת חומרים), הפוך את מוצרי הקשירה לזן חיידקים DH10B (טבלת חומרים), ולאחר מכן צלחת עם בחירת אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל).</li>
	<li>למחרת, בחרו שתיים עד ארבע מושבות כדי לחסן תרביות של 3 מ"ל המכילות מרק לוריא (LB) ו-100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. תנו לתרביות לגדול בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור מסלולי עם רעידות (225 סל"ד).</li>
	<li>למחרת, השתמש ב-1-1.5 מ"ל של תרבית החיידקים כדי למזער את הדנ"א הפלסמיד (טבלת החומרים). להציל את התרבות הנותרת על ידי הצבתם ב 4 °C (64 °F). סנן את הפלסמידים המצומצמים על ידי ריצוף סנגר באמצעות אוליגונוקלאוטיד שנקשר ~200 bp מהמוטציה הרצויה.</li>
	<li>השתמש בתרביות החיידקים שנשמרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לחסן מחדש תרביות של 50 מ"ל כדי למידיפרפ את הפלסמיד הנכון (טבלת החומרים). רצף מלא של רצף הקידוד Ube3a כדי לאמת את הרצף הנכון של הדנ"א.</li>
	<li>צור מלאי עבודה של פלסמידים בגרסה Ube3a, כמו גם את הכתב המופעל על ידי β-קטנין (BAR)21, TK-Renilla luciferase, Ube3a מת ליגאז (מוטציית UBE3A C820A), וקטור ריק pCIG2 בריכוז של 100 ng/μL באמצעות H2O סטרילי עבור שלבי ההעברה הבאים.</li>
</ol>2. הכנה והעברה של תאי כליה עובריים אנושיים 293T (HEK293T)
<ol><li>בצע את הבדיקות בתאי HEK293T שגודלו במדיום הנשר המהונדס (DMEM) של דולבקו, בתוספת גלוטמין, 10% סרום בקר עוברי (FBS) וחומר אנטיביוטי-אנטימיקוטי כפי שתואר קודםלכן 17. לגדל את התאים באינקובטור סטרילי ולח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.</li>
	<li>באמצעות ארון בטיחות ביולוגית, צלחת תחילה את תאי HEK293T המרחפים על לוחות 96 בעלי תחתית שטוחה שטופלו בתרבית רקמה בצפיפות של 2.2 × 104 תאים לכל באר ב-100 μL של מדיית תרבית ולאפשר להם לגדול בן לילה.</li>
	<li>ביום השני, העבירו את התאים בארון בטיחות ביולוגית עם פלסמידים של פיירפליי ורנילה לוציפראז (טבלה 4) ופלסמידים של Ube3a במשולש. בצע את הטרנספקציות ב-10 μL של הנפח הכולל לכל באר באמצעות יחס של 10:1:8 של פלסמידים (50 ng של BAR, 5 ng של TK-Renilla, ו-40 ng של Ube3a פלסמיד לכל באר, בהתאמה), כפי שתואר קודם לכן18, ו-0.4 μL של מגיב טרנספקציה (טבלה 4). הערה: עבור כל ניסוי, וקטור ריק (GFP בלבד) וקידוד פלסמיד ליגאז-מת Ube3a גם הם מועברים כדי לשמש כבקרות שליליות.</li>
	<li>צור תערובת אב עבור הטרנספקציות עבור כל גרסה בצינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל (טבלה 4) ודגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, התסיסו בעדינות את תערובת הטרנספקציה על ידי הקשה על הצינור, ולאחר מכן הוסיפו 10 μL של תערובת הטרנספקציה ישירות למדיית הצמיחה הקיימת בבארות.</li>
	<li>לאחר מכן, החזירו את התאים לאינקובטור ואפשרו לפלסמידים להתבטא במשך 48 שעות. החלפת מדיית הצמיחה אינה הכרחית.</li>
	<li>נטר את יעילות ההעברה על ידי פלואורסצנציה של GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאי HEK293T עוברים טרנספקציה יעילה בשיטה זו, ו->80% מהתאים צריכים לבטא GFP לאחר 48 שעות.</li>
</ol>3. מדידת פעילות לוציפראז
הערה: פעילות לוציפראז מוערכת באמצעות מערכת זמינה מסחרית הבודקת הן את Firefly והן את Renilla luciferase (טבלת חומרים) בהתאם לפרוטוקול היצרן.
<ol><li>שאפו בזהירות את מדיית התרבית מתאי HEK293T שעברו טרנספקציה, ולאחר מכן שטפו את התאים בתמיסת מלח קרה עם מאגרי פוספט (PBS). שאפו את ה-PBS והניחו את התאים על ידי הוספת 25 μL של חיץ ליזיס שאינו דנטורינג ודגירה במשך 15 דקות עם נדנדה עדינה על קרח.</li>
	<li>לאחר מכן, הוסף 20 μL של ליזאט שנוצר (אין צורך בצנטריפוגה) לתוך צלחת בדיקה חדשה של 96 בארות המכילה 100 μL של מגיב מצע לוציפראז Firefly. מערבבים את הצלחת בעדינות על ידי הקשה.</li>
	<li>טען את הצלחת על קורא צלחות ומדוד את עוצמת האור באמצעות גלאי עליון עם גובה קריאה של 1 מ"מ וזמן אינטגרציה של 1 שניות. הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את הרווח של הגלאי בהתבסס על עוצמת האות.</li>
	<li>מיד לאחר קריאת לומינסנציה של פיירפליי לוציפראז, הוסף 100 μL של מצע Renilla luciferase לבארות. צעד זה מרווה בו זמנית את פעילות לוציפראז Firefly תוך הערכת פעילות רנילה לוציפראז. מערבבים את הדגימות על ידי תסיסה עדינה של הצלחת ומודדים שוב את הלומינסנציה כדי להעריך את פעילות רנילה לוציפראז. הערה: בעוד שניתן להשתמש בלוחות אחרים לבדיקה זו, שימוש בלוחות עם מסגרות שחורות ובארות לבנות יספק את התוצאות הרגישות ביותר מכיוון שהדבר מגביר את אות לוציפראז תוך מזעור הרעש.</li>
	<li>לכמת את תגובות הכתבים כיחס לוציפראז של פיירפליי ל-Renilla luciferase (Firefly/Renilla), ולממוצע את הערכים של מדידות המשולש. לאחר מכן, נרמל את הערך Firefly/Renilla עבור כל וריאנט כנגד הערכים עבור תאים מסוג בר (WT) Ube3a המבטאים כדי להשוות את הפעילות היחסית של חלבונים משתנים.</li>
</ol>

<ol><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClinVar%3A+Public+archive+of+relationships+among+sequence+variation+and+human+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype.</a> Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).</li>
<li>Lek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein-coding+genetic+variation+in+60%2C706+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans.</a> Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).</li>
<li>Starita, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+interpretation%3A+Functional+assays+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Variant interpretation: Functional assays to the rescue.</a> American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).</li>
<li>Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HPV-16+E6+and+E6-AP+complex+functions+as+a+ubiquitin-protein+ligase+in+the+ubiquitination+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53.</a> Cell. 75 (3), 495-505 (1993).</li>
<li>Albrecht, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinted+expression+of+the+murine+Angelman+syndrome+gene%2C+Ube3a%2C+in+hippocampal+and+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons.</a> Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).</li>
<li>Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Angelman+syndrome+candidate+gene%2C+UBE3A%2FE6-AP%2C+is+imprinted+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).</li>
<li>Vu, T. H., Hoffman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+Angelman+syndrome+gene%2C+UBE3A%2C+is+restricted+to+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).</li>
<li>Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UBE3A%2FE6-AP+mutations+cause+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome.</a> Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).</li>
<li>Jiang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+Angelman+ubiquitin+ligase+in+mice+causes+increased+cytoplasmic+p53+and+deficits+of+contextual+learning+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation.</a> Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).</li>
<li>Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angelman+syndrome%3A+Insights+into+genomic+imprinting+and+neurodevelopmental+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes.</a> Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).</li>
<li>Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comorbidity+of+autism+with+the+genomic+disorders+of+chromosome+15q11.2-q13%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13.</a> Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).</li>
<li>Urraca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interstitial+duplication+15q11.2-q13+syndrome+includes+autism%2C+mild+facial+anomalies+and+a+characteristic+EEG+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Autism+Research%22%5BJournal%5D)">The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature.</a> Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).</li>
<li>de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+the+understanding+of+autism+disease+mechanisms+through+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics.</a> Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).</li>
<li>Scheffner, M., Staub, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HECT+E3s+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">HECT E3s and human disease.</a> BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).</li>
<li>Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+Angelman+syndrome-associated+mutations+in+the+E3+ubiquitin+ligase+E6-associated+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).</li>
<li>Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+specifies+axons+during+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling specifies axons during brain development.</a> Cell. 142 (1), 144-157 (2010).</li>
<li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autism-linked+UBE3A+T485A+mutant+E3+ubiquitin+ligase+activates+the+Wnt%2Fbeta-catenin+pathway+by+inhibiting+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).</li>
<li>Weston, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+disease-linked+hyperactivating+mutations+in+UBE3A+through+large-scale+functional+variant+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6809(2021).</li>
<li>Hand, R., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin2+regulates+the+initial+axon+guidance+of+cortical+pyramidal+neurons+projecting+medially+to+the+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum.</a> Neural Development. 6, 30(2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).</li>
<li>Biechele, T. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+beta-catenin%2FTCF+transcription+with+beta-catenin%2FTCF+transcription-based+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs.</a> Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).</li>
<li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Autism-linked+mutation+disables+phosphorylation+control+of+UBE3A%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A.</a> Cell. 162 (4), 795-807 (2015).</li>
<li>Kuhnle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angelman+syndrome-associated+point+mutations+in+the+Zn%282%2B%29-binding+N-terminal+%28AZUL%29+domain+of+UBE3A+ubiquitin+ligase+inhibit+binding+to+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).</li>
<li>Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+E6-AP+gene+%28UBE3A%29+encodes+three+potential+protein+isoforms+generated+by+differential+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing.</a> Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).</li>
<li>Avagliano Trezza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+nuclear+UBE3A+causes+electrophysiological+and+behavioral+deficits+in+mice+and+is+associated+with+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).</li>
<li>Bossuyt, S. N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+nuclear+UBE3A+activity+is+the+predominant+cause+of+Angelman+syndrome+in+individuals+carrying+UBE3A+missense+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations.</a> Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה יעילה ומדרגית להערכת הפעילות האנזימטית של גרסאות Ube3a. ישנם מספר פרטים טכניים המחייבים שיקול דעת זהיר בעת שימוש בבדיקה זו. שיקול אחד הוא הבחירה בפלסמידים של כתב Wnt המשמשים בבדיקה זו. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש באופן ספציפי ב-β-catenin מופעל reporter (BAR)21, כתב המכיל שרשור של 12 רכיבי תגובה של גורם תאי T (TCF) המופרדים על ידי רצפי מקשרים שתוכננו במיוחד כדי למזער רקומבינציה ואובדן של אתרי קשירת TCF. ישנם פלסמידים נוספים מבוססי Wnt המבוססים על לוציפראז המתו...

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה הפכה את ריצוף האקסומים והגנומים לשגרתי במסגרות קליניות 1,2. זה הוביל לגילוי של מספר רב של וריאנטים גנטיים, כולל מיליוני וריאנטים של מיסנס שבדרך כלל משנים חומצת אמינו אחת בחלבון. הבנת המשמעות הפונקציונלית של וריאנטים אלה נותרה אתגר, ורק לחלק קטן (~2%) מהווריאנטים הידועים של מיסנס יש פרשנות קלינית 1,3.
דוגמה בולטת לבעיה זו היא Ube3a, גן המקודד יוביקוויטין ליגאז E3 המכוון לחלבוני סובסטרט לפירוק4. Ube3a שוכן בתוך כרומוזום 15q11-13 ומתבטא אך ורק באלל 5,6,7 שעבר בירושה אימהית. תצפיות מהגנטיקה של מחלות מצביעות על כך שפעילות לא מספקת או מוגזמת של האנזים UBE3A גורמת להפרעות נוירו-התפתחותיות מובהקות. מחיקת כרומוזום אימהי 15q11-13 גורמת לתסמונת אנג'למן (AS)8, הפרעה המאופיינת במוגבלות אינטלקטואלית קשה, ליקויים מוטוריים, התקפים, התנהגות שמחה עם חיוך תכוף, ותווי פנים דיסמורפיים 8,9,10. לעומת זאת, שכפול או שילוש של כרומוזום אימהי 15q11-13 גורם לתסמונת Dup15q, מצב הטרוגני המוכר כאחת הצורות הסינדרומיות הנפוצות ביותר של אוטיזם11,12,13. בנוסף, ישנם מאות וריאנטים שגויים שזוהו ב- Ube3a, שרובם נחשבים לווריאנטים בעלי משמעות לא ברורה (VUS) מכיוון שמשמעותם התפקודית והקלינית אינה ידועה. לפיכך, יש עניין רב בפיתוח שיטות שיכולות להעריך באופן אמפירי גרסאות Ube3a כדי לקבוע אם הם תורמים למחלות נוירו-התפתחותיות.
האנזים UBE3A שייך למשפחת התחום HECT (הומולוגית ל-E6-AP C-terminus) של ליגאזות יוביקוויטין E3 שכולן מחזיקות בתחום ה-HECT המפורסם, המכיל את המנגנון הביוכימי הדרוש כדי לקבל יוביקוויטין פעיל מאנזימי E2 ולהעבירו לחלבוני סובסטרט14. מבחינה היסטורית, האפיון של אנזימי E3 הסתמך על מערכות מבחנה משוחזרות הדורשות אנסמבל של חלבונים מטוהרים 4,15,16. שיטות כאלה הן איטיות ועתירות עבודה ואינן ניתנות להערכת הפעילות של מספר רב של גרסאות. בעבודה קודמת, UBE3A זוהה כמפעיל את מסלול ה-Wnt בתאי HEK293T על ידי ויסות תפקוד הפרוטאזום כדי להאט את הפירוק של β-קטנין17. תובנה זו מאפשרת את השימוש בכתבי מסלול Wnt כשיטה יעילה ומהירה לזיהוי גרסאות אובדן ורווח של פונקציה של Ube3a18. הפרוטוקול שלהלן מתאר בפירוט שיטה ליצירת וריאנטים של Ube3a וכן כתב מבוסס לוציפראז להערכת שינויים בפעילות של וריאנטים של Ube3a.

<table><tbody><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA (1x), פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb סולם DNA</td><td>Lambda Biotech</td><td>M108-S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp סולם DNA</td><td>Lambda Biotech</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>10x מאגר עבור T4 DNA Ligase עם 10 מ"מ ATP</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>B0202A</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion HF מאגר תגובה</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטריית</td><td>קורנינג</td><td>30004CI</td><td></td></tr><tr><td>שחור/לבן Isoplate-96 מסגרת שחורה צלחת באר לבנה</td><td>PerkinElmer</td><td>6005030</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin מלח דיסודיום</td><td>המערב התיכון Scientific</td><td>KCC46000-5</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירת תאים רוזנת&nbsp; שקופיות</td><td>Invitrogen מאת Thermo Fisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess II מונה סלולרי אוטומטי&nbsp;</td><td>טכנולוגיות</td><td></td> חיים <td>מכונת ספירת תאים</td></tr><tr><td>אוליגוס DNA מותאם אישית</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות (IDT)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>דאוקסינוקלאוטיד (dNTP) תערובת פתרונות</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX, פירובט</td><td>גיבקו</td><td>10569044</td><td>מדיום בזאלי לתמיכה בצמיחה של קו תאים HEK293T</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>מערכת בדיקת מדווח כפול לוציפראז</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>R3101S</td><td>אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מוסמך, מומת בחום</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>סרום בקר עוברי</td></tr><tr><td>פישרברנד מנות תרבית רקמות מטופלות פני השטח</td><td>פישרברנד</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 מגיב טרנספקציה</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>טעינת ג'ל צבע סגול (6x)</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>B7024A</td> תאי HEK293T <td></td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>יעילות גבוהה ig 10B תאים מוכשרים כימית</td><td>גנומיקה שלמה</td><td>1011-12</td><td>תאי E. coli DH10B</td></tr><tr><td>ערכת מידי פלסמיד HiSpeed</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td>Midi prep</td></tr><tr><td>pCIG2 פלסמיד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pGL3 BAR פלסמיד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HF DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0530L</td><td>DNA פולימראז</td></tr><tr><td>ProFlex 3 x 32 באר מערכת PCR</td><td>מערכות ביולוגיות יישומיות על ידי טכנולוגיות</td><td></td> חיים <td>Thermocycler</td></tr><tr><td>pTK Renilla פלסמיד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep ספין Miniprep Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Mini prep</td></tr><tr><td>QIAquick ג'ל מיצוי ערכת (250)</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>טיהור</td></tr> <tr><td>ג'לערכת טיהור PCR מהירה QIAquick (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>טיהור PCR</td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>SacI-HF</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>R3156S</td><td>אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>סינרגיה HTX קורא רב-מצבי</td><td>BioTek</td><td></td><td>&nbsp; קורא צלחות מריץ תוכנת Gen5 v3.08 (BioTek)</td></tr> <tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202L</td><td>Ligase</td></tr><tr><td>TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, תמיסה פי 50, אלקטרופורזה</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13324</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 96 בארות, Flat</td><td>Bottom Fisherbrand</td><td>FB012931</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide Solution</td><td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>15585011</tr><tr><td>אנזים הגבלה</td> <td>XmaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0180S</td></tr></tbody></table>

שיטה מדרגית ומבוססת תאים להערכה פונקציונלית של גרסאות ube3a

A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants

השימוש המוגבר בריצוף ברפואה זיהה מיליוני גרסאות קידוד בגנום האנושי. רבים מהווריאנטים האלה מתרחשים בגנים הקשורים להפרעות נוירו-התפתחותיות, אך המשמעות התפקודית של הרוב המכריע של הווריאנטים עדיין לא ידועה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של וריאנטים עבור Ube3a, גן המקודד E3 יוביקוויטין ליגאז הקשור הן לאוטיזם והן לתסמונת אנג'למן. שכפול או משולש של Ube3a קשור מאוד לאוטיזם, ואילו מחיקתו גורמת לתסמונת אנג'למן. לפיכך, הבנת הערכיות של שינויים בפעילות החלבון UBE3A חשובה לתוצאות קליניות. כאן מתוארת שיטה מהירה, מבוססת תאים, המשלבת גרסאות Ube3a עם כתב מסלול Wnt. בדיקה פשוטה זו ניתנת להרחבה וניתן להשתמש בה כדי לקבוע את הערכיות ואת גודל השינויים בפעילות בכל גרסה של Ube3a . יתר על כן, המתקן של שיטה זו מאפשר יצירת שפע של מידע מבנה-פונקציה, אשר ניתן להשתמש בו כדי לקבל תובנות עמוקות על מנגנונים אנזימטיים של UBE3A.

סריקה פונקציונלית בקנה מידה גדול של וריאנטים של Ube3a missense מזהה נוף רחב של מוטציות אובדן ורווח של תפקוד עבודה קודמת עם מוטנטים של Ube3a הציעה שתגובת Wnt יכולה לשמש ככתב של פעילות החלבון UBE3A התאית. תצפיות אלה הורחבו, ונערכו ניסויי ולידציה נוספים כדי לחקור אם בדיקת BAR מתאימה לדיווח על מגוון פעילויות UBE3A בתא. ראשית, תאי HEK293T עברו טרנספקציה עם כמויות משתנות של דנ"א פלסמיד המקודד ל-WT Ube3a אנושי. הניסוי הזה הראה שתגובת ה-BAR משתנה באופן ליניארי עם כמות ה-Ube3a</e...

שיטה פשוטה ומדרגית פותחה כדי להעריך את המשמעות התפקודית של גרסאות missense ב- Ube3a, גן שאובדן ורווח תפקודו קשורים הן לתסמונת אנג'למן והן להפרעת ספקטרום האוטיזם.

שיטה מדרגית ומבוססת תאים להערכה פונקציונלית של גרסאות Ube3a

The increased use of sequencing in medicine has identified millions of coding variants in the human genome. Many of these variants occur in genes ...

השיטה שלנו מספקת דרך מהירה להבין את ההשפעה התפקודית של וריאנטים ב- Ube3a, אוביקוויטין ליגאז שגורם לתסמונת אנג'למן וקשור מאוד לצורה גנטית של אוטיזם המכונה תסמונת Dup15q. האפיון של פעילות הליגאז של יוביקוויטין הוא באופן מסורתי אינטנסיבי ואיטי, ושיטות כאלה קשות ולא ממש מקובלות לאפיין את מאות הווריאנטים שזוהו עבור Ube3a. תסמונת אנג'למן נגרמת על ידי מחיקת הגן האימהי Ube3a, ואילו תסמונת Dup15q נגרמת על ידי שכפול של Ube3a האימהית, ולכן חשוב להסיק כיצד וריאנטים שגויים שינו את הפעילות של האנזים Ube3a, וזה משהו שקשה לעשות מבלי לבדוק אמפירית כל וריאנט.מי שתדגים את ההליך תהיה ג'אלין סטלצר, טכנאית מחקר במעבדה שלי. התחילו בביצוע הבדיקות בתאי HEK293T, שגודלו במדיום הנשר המתוקן של דולבקו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו-חמצני במיכל לח, כפי שמתואר בכתב היד. בארון בטיחות ביולוגית, צלחת את תאי HEK293T המרחפים על צלחת 96 בעלת תחתית שטוחה שטופלה בתרבית רקמה ודגירה של התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות.ביום השני, העבירו את התאים בארון בטיחות ביולוגית עם פלסמידים של פיירפליי ורנילה לוציפראז, ופלסמידים של Ube3a במשולש. בצע את הטרנספקציות בנפח כולל של 10 מיקרוליטר לבאר. צור תערובת מאסטר עבור הטרנספקציות עבור כל גרסה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ודגרה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.לאחר הדגירה, התסיסו בעדינות את תערובת הטרנספקציה על ידי הקשה על הצינור, ולאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תערובת הטרנספקציה ישירות למדיית הצמיחה הקיימת בבארות. לאחר מכן, החזירו את התאים לאינקובטור ואפשרו לפלסמידים להתבטא במשך 48 שעות. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, עקוב אחר יעילות הטרנספקציה על ידי פלואורסצנציה של GFP.יותר מ-80% מהתאים צריכים לבטא GFP לאחר 48 שעות. שאפו בזהירות את מדיית התרבית מתאי HEK293T שעברו טרנספקציה ולאחר מכן, שטפו את התאים עם PBS קר. שאפו את ה-PBS.הוסיפו 25 מיקרוליטרים של חיץ ליזיס שאינו דנטורינג עבור תזה של תאים, ודגרו במשך 15 דקות על קרח עם נדנדה עדינה. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של הליזאט המתקבל לצלחת בדיקה חדשה בת 96 בארות המכילה 100 מיקרוליטרים של מגיב מצע Firefly luciferase, וערבבו את הצלחת בעדינות על ידי הקשה. טען את הלוח לקורא צלחות ומדוד את עוצמת האור באמצעות גלאי עליון עם גובה קריאה של מילימטר אחד וזמן אינטגרציה של שנייה אחת.מיד לאחר קריאת ה- Firefly luciferase luminescence, הוסף 100 מיקרוליטרים של מצע Renilla luciferase לבארות, אשר מרווה את פעילות לוציפראז Firefly תוך הערכת פעילות רנילה לוציפראז. מערבבים את הדגימות על ידי תסיסה עדינה בצלחת ומודדים שוב את הלומינסנציה כדי להעריך את פעילות הרנילה לוציפראז. השווה את הפעילות היחסית של חלבונים משתנים על ידי כימות תגובות המדווחים ונרמול ערך Firefly ו- Renilla עבור כל וריאנט כנגד הסוג הפראי Ube3a.תאי HEK293T שעברו טרנספקציה עם כמויות הולכות וגדלות של קידוד פלסמידים מסוג פראי מסוג Ube3a מראים עלייה ליניארית בתגובת BAR. בדיקת BAR מזהה גרסאות הקשורות למחלה של הפלסמידים, ומדגימה את הדיוק והכלליות של שיטה זו. מסך בדיקת BAR עבור 152 גרסאות Ube3a מציג אובדן שפיר של תפקוד ורווח של מוטציות פונקציה ביחס ל- Ube3a מסוג פראי.הרווח של החלפת פונקציה גלוטמט, אובדן החלפת פרולין פונקציה, ואובדן נוסף של החלפת פונקציה ארגינין בעמדה 588 של Ube3a יצרו השפעות שונות באופן דרסטי, ובכך הדגישו את החשיבות של הערכת וריאנטים אמפיריים. עלילת החום מראה תוצאות BAR מנורמלות לניתוח מוטציות מקיף בעמדה 588 ב- Ube3a. ההצללה הלבנה מייצגת רמות פעילות של Ube3a מסוג פראי, ההצללה הכחולה מציינת אובדן תפקוד, וההצללה האדומה מציינת רווח של מוטציות פונקציה.מעבר להשלכות הקליניות של עבודתנו, Ube3a היא חברה במשפחת תחומי HECT של ליגאזות יוביקוויטין, אשר כולן בעלות התחום הקטליטי HECT המשומר. ואני חושב שאחד ההיבטים המרתקים של העבודה שלנו הוא שהיא מספקת נתונים עשירים של פונקציות מבנה על Ube3a, וניתן להשתמש בזה כדי להשיג הבנה מכניסטית עמוקה יותר עבור סוג זה של אנזימים.

a-scalable-cell-based-method-for-functional-assessment-ube3a

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן, אנו מציגים גישה שיטתית לפיתוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, רגיש...

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

הפרוטוקול הנוכחי מפרט שיטה למדידת הפעילות של אנזימים תפקודי הומולוגי deubiquitinating. בדיקות מיוחדות קוולנטית לשנות את האנזים ולאפשר לגילוי. שיטה זו מחזיקה את הפוטנציאל לזהות מטרות טיפוליות חדשות.

שיטה למדידת הפעילות של אנזימי Deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה

Periventricular קשרי הטרוטופיה (PNH) היא הצורה הנפוצה ביותר של מום ההתפתחות בקליפת המוח (MCD) בבגרות אבל את הבסיס הגנטי שלה אינו ידוע במקרים ספורדיים ביותר. לאחרונה פיתחנו אסטרטגיה לזיהוי גנים מועמדים חדשניים עבור MCDs וכדי לאשר ישירות שלהם תפקיד סיבתי בתוך vivo.

אסטרטגיה רומן המשלב מערך-CGH, רצף שלם-exome and בתוך הרחם אלקטרופורציה בחולדות לזיהוי גנים סיבתי של מומים המוח

אנו מציגים תוכנית אסטרטגית ופרוטוקול לזיהוי וריאנטים גנטיים לא מקודדים המשפיעים על קשירת ה-DNA של גורם השעתוק (TF). פרוטוקול ניסיוני מפורט מסופק לבדיקת משמרת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) וניתוח משקעים של זיקה ל-DNA (DAPA) של קשירת TF DNA תלויה בגנוטיפ.

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את העיצוב ואת הביצועים של ניסויים vivo ב Drosophila ילה melanogaster כדי להעריך את ההשלכות הפונקציונליות של משתנים גנים נדירים הקשורים למחלות האדם.

במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות Drosophila ילה

שיטת החיסוני האלקטרוכימי (ECLIA) היא גישה מקורית לזיהוי כמותי של משתני חלבון MeCP2, המייצרת מדידות כמותית, מדויקת ומדוייקת ובעלת שגיאה בתוך ובין-שיטה נמוכה בטווח עבודה רחב. כאן, הפרוטוקול עבור MeCP2-ECLIA בפורמט 96-ושוב מתואר.

בסיס אלקטרוכימי מבוסס-מיניאונציה עבור גרסאות חלבון MeCP2

פרוטוקול זה מתאר גישות לזיהוי וכמות של הבלטות גדולות של צבירה ו/או אורגנל (~4 μm) המיוצרות על ידי תאי C. elegans בצורה של exophers המאוגדים קרום. אנו מתארים זנים, תנאי גדילה, קריטריונים ניקוד, תזמון, ושיקולי מיקרוסקופ הדרושים כדי להקל על ניתוח של מנגנון גירוש פסולת זה.

גישות כמותיות לניקוד ב-vivo Neuronal Aggregate ו-Organelle הבלטה בוויקות Exopher גדולות ב C. elegans

כאן, המחברים מציגים את התועלת של MULTI-seq עבור פנוטיפ והצמד הבא scRNA-seq ו- scATAC-seq באפיון פרופילי הנגישות של תעתיק וכרומטין ברשתית.

ניתוח מרובב של ביטוי גנים ברשתית ונגישות כרומטין באמצעות scRNA-Seq ו- scATAC-Seq

פרוטוקול זה מסביר כיצד למדוד את ההשפעה של שונות גנטית הקשורה להפרעות נוירו-התפתחותיות על פעילות האנזים דאוביקוויטילציה על ידי שילוב טיהור חלבונים רקומביננטיים עם מבחני מחשוף שרשרת יוביקוויטין.

מדידת הפעילות האנזימטית של אנזימים דאוביקוויטילציה הקשורים להפרעה נוירו-התפתחותית באמצעות בדיקת מחשוף שרשרת יוביקוויטין במבחנה

RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.

פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה

למד שיטה מדרגית להערכת השפעת גרסאות missense בגן Ube3a, ליגאזת אוביקוויטין הקשורה בתסמונת אנגלמן ובאוטיזם. השיטה משתמשת בתאי HEK293T ומדידת לוציפראז כדי לזהות גרסאות עם אובדן או רכישת פונקציה.

שיטה מדרגית ומבוססת תאים להערכה פונקציונלית של גרסאות Ube3a

גלה סרטונים נוספים