מיקרו-הנדסה הידרוג'ל קולגן תלת-ממדית עם יישור סיבים לטווח ארוך

שיטה זו מאפשרת לנו להנדס הידרוג'ל קולגן תלת-ממדי עם רמות מבוקרות של יישור סיבים כדי למדל סביבות המצויות ברקמה בריאה וחולה בגוף. טכניקה זו מספקת גישה מיקרופלואידית פשוטה להנדס הידרוג'לים של קולגן מיושר, להחדיר תאים ולכמת כיצד תאים מתנהגים בסביבות תלת-ממדיות מוגדרות טופוגרפית. מי שידגימו את ההליך יהיו ניל ג'ושי, מהראן מנסורי, אן ביירלי וג'סטין וידאס עבור המעבדה שלי.

כדי להתחיל, הרכיבו יריעת PDMS בעובי 250 מיקרומטר על מנשא פלסטיק וחתכו את העיצוב המיקרופלואידי באמצעות חותך מלאכה בעומק להב של 0.5 מילימטרים, מהירות של סנטימטר אחד לשנייה וכוח גבוה. באמצעות אמבטיה קולית, לנקות את מגזרות ערוץ microfluidic במשך חמש דקות. שוטפים את התעלות הסוניות במים נטולי יונים, ומייבשים אותן על פלטה חמה בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

אחסנו את התעלות בכלי פטרי נקי ומכוסה עד לשימוש. כדי לייצר את שכבת כיסוי PDMS ולתפקד את פני השטח לשינוי עתידי, להכין תמיסת 2% aminopropyl triethoxysilane בכוס זכוכית על ידי הוספת מיליליטר אחד של aminopropyl triethoxysilane ל 49 מיליליטר של אצטון. לאחר מכן, יש לדלל תמיסת 25% גלוטראלדהיד ל-5% מים שעברו דה-יוניזציה.

הפוך שני מיליליטר של פתרון עבור כל 24 מ"מ על 50 מ"מ לכסות להחליק. נקו את החלקות הכיסוי בסוניק אמבטיה למשך חמש דקות באמצעות IPA. יש לשטוף את ה-IPA מחליקי הכיסוי באמצעות מים שעברו דה-יוניזציה.

סרט חלק של מים על תלוש הכיסוי מציין כי IPA נשטף היטב. יבשו את הכיסוי על פלטה חמה במשך חמש דקות בחום של 100 מעלות. הניחו את החלקות הכיסוי המיובשות בצלחות פטרי נקיות, וודאו שהן אינן חופפות.

בעזרת שרביט פריקת קורונה, חושפים את פתקי הכיסוי לפריקה של קורונה למשך דקה כל אחד. הסר את החלקות הכיסוי תוך חמש דקות מרגע החשיפה לקורונה וטבול כל החלקת כיסוי בתמיסת אמינופרופיל טריאתוקסיסילן למשך 10 שניות, כדי להבטיח שהחלקת הכיסוי שקועה לאחר מכן, הסר את החלקות הכיסוי מתמיסת האמינופרופיל טריאתוקסיסילן, טבול אותן באצטון למשך 10 שניות וייבש אותן באוויר דחוס. הניחו את הכיסוי היבש בחזרה לתוך צלחת הפטרי, כשהצד המטופל פונה כלפי מעלה.

פיפטה מיליליטר אחד של תמיסת גלוטראלדהיד על פני השטח של כל החלקת כיסוי. יש לכסות משטח רב ככל האפשר מבלי לאפשר לתמיסה להישפך מעבר לקצה החלקת הכיסוי. הניחו להחלקות הכיסוי לשבת במגע עם התמיסה במשך 30 דקות ולאחר מכן שטפו במים נטולי יונים, במשך 20 שניות.

יבשו את החלקות הכיסוי באמצעות אוויר דחוס והחזירו אותן לצלחות הפטרי, הצד שטופל בפלזמה כלפי מעלה לחיתוך הבסיס המגנטי המודולרי בלייזר, גזרו את העיצובים משכבת PMMA באמצעות הגדרות לייזר מתאימות, כגון מספר המעברים וההספק. יש לכוונן את הגדרות הלייזר כך שניתן יהיה להתקין את המגנטים בלחיצה בשכבת PMMA. שטפו את החלק החתוך בלייזר באמצעות מים וסבון כדי להסיר לכלוך מתהליך החיתוך בלייזר.

אין להשתמש בממסים, מכיוון שהם עלולים להפיץ מיקרו-סדקים בקצוות החתוכים בלייזר. כדי להרכיב את הפלטפורמה, דחפו מגנטים ביד לתוך הבסיס החתוך בלייזר. עובי המגנטים חייב להיות קטן מעובי בסיס PMMA כדי להבטיח שהמגנטים צמודים לפני השטח של הבסיס.

יש לקלף את הגב מהדבק הרגיש ללחץ, או יריעת PSA, ולחבר את הבסיס לכיסוי שטופל בגלוטראלדהיד כאשר הצד המתפקד פונה כלפי מעלה. הניחו בעדינות את מגרעת תעלת PDMS בחלל שהוגדר על-ידי המסגרת. לחץ כלפי מטה עם פינצטה בעלת קצה רחב כדי להסיר בועות אוויר ולהבטיח מגע קונפורמי.

הניחו את אלבומין סרום הפרות, או כיסוי התעלה שטופל ב-BSA על גבי מגרעת התעלה כשצד ה-BSA פונה כלפי מטה. ודא שיציאות הכניסה והשקע מיושרות עם הערוץ. המכשיר מוכן להזרקת קולגן I.

הכניסו משאבת מזרק, מזרק סטרילי מקורר, תמיסת קולגן I מנוטרל מקורר ומחט נעילה סטרילית בזווית של 20 מעלות 90 מעלות לתוך ארון בטיחות ביולוגית. מעמיסים את תמיסת הקולגן I לתוך המזרק, ונמנעים מבועות. חברו את קצה המחט למזרק, טענו את המזרק למשאבת המזרק, כשהמחט פונה כלפי מטה, וטבלו את המחט בתמיסת קולגן I.

הגדר את משאבת המזרק לקצב הזרימה הנדרש בין 50 ל -2, 000 מיקרוליטר לדקה. מניחים תעלות PDMS מוכנות על שקע מעבדה ומפלסות עם המחט. הכנס את המחט ליציאת הכניסה של תעלת PDMS.

מזריקים את התעלה עד לטיפה של 30 מיקרוליטר קולגן שאני אוספת בצד היציאה. הורידו את שקע המעבדה והפרידו בעדינות את המחט מהתעלה שזה עתה התמלאה. יש לחזור על הפעולה עד שכל התעלות התמלאו בתמיסת קולגן I.

יש להעמיס את התעלות המלאות לתוך צלחות הפטרי לצד מגבון נקי ללא סיבים רווי במים נטולי יונים, כדי למנוע התייבשות של הקולגן החדש שיוצר I Gel. מכסים את צלחת הפטרי ומניחים את התעלות הטעונות באינקובטור למשך שעתיים לפני שלב הקילוף. לקילוף ואיזון מדיה, התחילו בהרמת כיסוי PDMS באמצעות פינצטה כדי לחשוף את ג'ל הקולגן I הפולימרי.

הוסיפו 650 מיקרוליטר של מצע גידול אנדותל לבאר. לחלופין, חברו מודול נוסף כדי להוסיף שכבת קולגן נוספת או לספק יכולות זילוח מדיה. השאירו את המכשירים באינקובטור למשך ארבע שעות לפחות כדי לאזן את הג'ל והמדיה.

החלף את המדיה לפני הזריעה בתאים. פונקציונליות החלקה של כיסוי הזכוכית אפשרה הרמת תעלה ותפקוד כיסוי PDMS עם BSA מנע חיבור קולגן I. יישור סיבי הקולגן I לא נפגע לאחר הסרת הכיסוי.

תמונות של HUVECs בתרבית על המקטע המיושר של המטריצה הראו יישור מוגבר של סיבי אקטין בהשוואה ל- HUVECs בקטע עם סיבים אקראיים. הגישה שלנו מאפשרת לנו למדל את המיקרו-סביבה של הגידול ולכמת כיצד סוגי תאים שונים מגיבים. אנו יכולים גם להציג ערוצי זרימה לתמיכה בניסויים ארוכי טווח.