מיצוי לומיקן מממברנת מי השפיר וקביעת טמפרטורת האחסון שלו
14 באוקטובר 2022
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את מיצוי הלומיקאן מממברנת מי השפיר (AM) ואת תנאי האחסון שלהם כתמצית AM (AME) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, 4 מעלות צלזיוס וטמפרטורת החדר (RT) במשך 6, 12, 20 ו-32 ימים כדי לכמת את החלבונים ואת ריכוז הלומיקאן.
שיטה זו נועדה להדגים טכניקה פשוטה למיצוי חלבונים, שימושית להשגת חלבונים שופעים וגורמים אחרים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחלץ גורמים וחלבונים אחרים הנמצאים בקרום מי השפיר וגם, כדי לקבל חלבונים ממקורות אחרים כגון בעלי חיים ורקמות צמחיות. מתחילים בהפשרה של 100 מיליגרם של קרום מי השפיר המתקבל מבנק האמניון.
לאחר ההפשרה, מוסיפים 10 מיליליטר מתמיסת המלח המאוזנת הסטרילית לצלחת פטרי ושוטפים את הממברנה במשך שתי דקות. לאחר מכן, הסר את תמיסת המלח המאוזנת המשומשת לתוך וחזור על התהליך עד שלא נראה זכר למדיום גליצרול בצלחת פטרי. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של dispase II לממברנה לדגור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 30 דקות.
בסוף הדגירה, לבצע דה-אפיתל מכני עם מגרד תא שוטר גומי. לאחר מכן, דמיינו את הממברנה מתחת למיקרוסקופ הפוך כדי לאשר דה-אפיתליאליזציה. לאחר מכן, לשטוף את קרום מי השפיר דה-אפיתל עם תמיסת מלח מאוזנת סטרילית כפי שהודגם קודם לכן, ומניחים אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר.
לאחר מכן, לטבול את הצינור המכיל את הממברנה בחנקן נוזלי במשך 40 דקות. לאחר הקפאה עם חנקן נוזלי, לטחון ידנית את הממברנה במשך שתיים עד שלוש דקות במכתש, מקורר מראש במינוס 85 מעלות צלזיוס, עד לקבלת אבקה דקה. לאחר מכן, להוסיף 2.5 מיליליטר של פתרון מעכב פרוטאז ו solubilize את הממברנה אבקה דקה.
מנקים את קירות הטיט בעזרת סכין אזמל ומעבירים את התערובת לצינור של חמישה מיליליטר. מערבבים את הצינור במשך 30 שניות. לאחר מכן, הומוגניות תערובת הרקמות על ידי צנטריפוגה ראשונה ב 34 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ומיד צנטריפוגה זה שוב ב 3, 360 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
בסוף הצנטריפוגה, לאסוף את supernatant, שהוא תמצית קרום מי השפיר, בצינור חדש. לאחר מכן, aliquot 0.7 מיליליטר בצינור מיקרוצנטריפוגה אחר של שני מיליליטר עבור נקודות זמן וטמפרטורות שונות. כמות החלבון הכוללת והריכוז הלומיקן בתמצית קרום מי השפיר הושפעו מזמן ומתנאי אחסון.
ריכוז החלבון הבסיסי היה דומה בין כל תמציות מי השפיר. עם זאת, ריכוז חלבון גבוה משמעותית נצפה בתמצית שאוחסנה במשך 32 ימים בארבע מעלות צלזיוס ו -20 ימים במינוס 20 מעלות צלזיוס. לומיקן בתמצית קרום מי השפיר היה גבוה משמעותית בדגימה שאוחסנה לתקופה של 12 יום בהשוואה לדגימות שאוחסנו במשך 30, 20 ושישה ימים בארבע ומינוס 20 מעלות צלזיוס.
תוצאות אלה הציעו כי זמן האחסון והטמפרטורה המתאימים להשגת הריכוז הגבוה ביותר של לומיקן הוא 12 ימים במינוס 20 מעלות צלזיוס. יש לנקוט משנה זהירות בעת הארקת קרום מי השפיר הקפוא. ההארקה צריכה להיות עדינה מכיוון שהיא עלולה ליפול מהטיט.
נדרשים מחקרים נוספים כדי לקבוע את התפקיד של תמצית קרום מי השפיר lumican בתאי אפיתל הקרנית ולקבוע את המינון האידיאלי של lumican עבור אפיתל מחדש של הקרנית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה למיצוי לומיקן (lumican) מקרומי השליה (AM) ואחסונו בתנאים שונים. המחקר מכמת את ריכוזי החלבון והלומיקן לאורך פרקי זמן שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- Lumican הוא פרוטאוגליקן המעורב בתהליכים ביולוגיים שונים.
- קרומים של מי השפיר הם מקור עשיר בחלבונים ובגורמים שונים.
- הבנת תנאי האחסון חיונית לשמירה על שלמות החלבון.
- ניתן להתאיים שיטה זו לרקמות ביולוגיות אחרות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מיצוי אמין עבור lumican.
- הערכת ההשפעות של תנאי אחסון שונים על היציבות של lumican.
- אספקת שיטה בסיסית למיצוי חלבונים מממברנות ביולוגיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפשרת דגימות של קרום מי שפיר.
- שטיפת הקרום בתמיסת מלח מאוזנת סטרילית.
- אינקובציה עם dispase II לצורך הפקת חלבונים.
- אחסון תמצית AM בטמפרטורות שונות לצורך אנליזה.
תוצאות עיקריות
- מיצוי מוצלח של lumican מקרומי השליה.
- כימות ריכוז החלבון תחת תנאי אחסון שונים.
- יציבות ה-lumican משתנה בהתאם לטמפרטורה ולזמן.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול לחלבונים אחרים ממקורות שונים.
מסקנות
- שיטת המיצוי יעילה להשגת lumican.
- לתנאי האחסון השפעה משמעותית על יציבות החלבון.
- פרוטוקול זה יכול לסייע במחקרים נוספים על חלבונים של קרום השליה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיצוי וכמתור מדויקים של lumican מקרומי Amnion אנושי מאפשרים גישה סטנדרטית לרכיב מטריקס ביו-אקטיבי בעל רלוונטיות פוטנציאלית למחקרים בתחומי תיקון רקמות ועיניים. הבנת היציבות של lumican תחת תנאי אחסון מוגדרים תומכת בתהליכי עבודה הניתנים לשחזור ומספקת בסיס להחלטות בנושא עיבוד ביולוגי עבור יישומים טרנסלציונליים. פרוטוקול זה מציג את מיצוי ה-lumican ככשרון רב-פעמי עבור שלבי פיתוח ומחקר מוקדמים (R&D) בביופארמה ובפיתוח חומרי ביומטריים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של התפקיד הביולוגי של lumican בארגון המטריצה החוץ-תאית ובאפיתליזציה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של lumican כמועמד למחקר ברפואה רגנרטיבית.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת תכשירים סטנדרטיים של lumican למחקרים in vitro.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מקור הניתן לשחזור של lumican לצורך כיול בדיקה וסריקת תרכובות.
- מאפשר הערכה כמותית של ריכוז lumican תחת תנאי אחסון מבוקרים.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי הגדרת פרמטרי המיצוי והאחסון האופטימליים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מספק תמציות מועשרות ב-lumican להערכה פרה-קלינית במודלים רלוונטיים למחלות של תיקון קרנית.
- מאפשר המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על שלמות החלבון לאורך מרווחי אחסון.
- תומך בקבלת החלטות לגבי התקדמות מותאמת סיכונים באמצעות הבהרת פרופילי היציבות של lumican.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
פרוטוקול מיצוי וכימות זה משתלב ברצף שבין שלבי הגילוי המוקדמים לשלב הפרה-קליני, ובכך הוא תומך הן במחקר מונחה-השערה והן בפיתוח ביו-חומרים תרגומיים.
- ביולוגיה של הגילוי: מספקת פלטפורמה לבחינת ההשפעות המכניסטיות של lumican על התנהגות תאים והרכבת המטריקס.
- סריקה: מספקת תכשירי lumican סטנדרטיים לצורך פיתוח בדיקות הניתנות לשחזור והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה כמותית של ריכוז ה-lumican כדי להשוות תנאי אחסון ולבצע אופטימיזציה של זרימות העבודה.
- מחקר תרגומי: שומרת על שלמות התמצית עבור מחקרים פרה-קליניים המשכיים במודלים של תיקון רקמות.
- שימוש חוזר ארגוני: קובעת פרוטוקול שניתן להתאימו למיצויים של חלבונים אחרים מממברנות ביולוגיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתפקידו התפקודי וביציבותו של ה-lumican.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי המיצוי והאחסון, לשיפור השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability).
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות של go/no-go עבור תוכניות של חומרים ביו-חומרים ורפואה רגנרטיבית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של יוזמות מחקר ופיתוח המבוססות על lumican.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות של מיצוי וכמותיות של חלבונים.
- נדרש גישה לאחסון בקירור, לצנטריפוגה ולריאגנטים של מעכבי פרוטאז.
- נדרש סטנדרטיזציה של פרוטוקולי המיצוי והאחסון בין הצוותים השונים.
- ניתן להתאים למקורות רקמה אחרים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- טיפול זהיר במהלך הטחינה נחוץ כדי למנוע אובדן של דגימות, כפי שצוין בפרוטוקול.
