Name: אוסף של שורש אלפלפה מפריש כדי לחקור את ההשפעה של di(2-ethylhexyl) פתלאט על ייצור מטבוליטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: חקור את השפעת הזנוביוטיקה על אלפלפה באמצעות ניתוח מטבולומיקה לא ממוקדת. שיטה זו מאפשרת זיהוי סוגים שונים של מופרשי שורש ומסייעת בבניית טביעת אצבע מטבולית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה במשותף על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (41877139), הפרויקטים העיקריים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (41991335), תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2016YFD0800204), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (מס 'BK20161616), תוכנית "135" ותוכנית הגבולות של האקדמיה הסינית למדעים (ISSASIP1615).

מטרת פרוטוקול זה היא לספק צינור כללי, מניסוי תרבית הידרופונית ועד אנליזה מטבולית, המכמת את ההשפעה של DEHP על הפרשות שורש אספסת.
1. ניסוי תרבית הידרופונית
הערה: פרוטוקול זה מציג דוגמה לניסוי תרבית הידרופונית אספסת שנועד להשיג שתילי אספסת (Medicago sativa) תחת לחץ של ריכוזים שונים של DEHP. נקבעו שלושה טיפולים: הבקרה ללא תוספות, ותמיסת התזונה זינקה עם 1 מ"ג ק"ג-1 ו-10 מ"ג ק"ג-1 של די(DEHP. ריכוזי DEHP נקבעו על פי התכולה האמיתית של DEHP בקרקע23. לכל טיפול היו שישה עותקים משוכפלים.
<ol><li>יש לעקר זרעי אספסת עם 0.1% נתרן היפוכלוריט למשך 10 דקות ו-75% אלכוהול אתילי למשך 30 דקות.<ol><li>שטפו את הזרעים המעוקרים מספר פעמים במים מזוקקים ולאחר מכן נבטו על נייר פילטר לח בצלחת פטרי סטרילית בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס בחושך.</li>
	</ol></li>
	<li>מעבירים 20 זרעים אחידים, מונבטים וגדולים ושמנמנים לסלסלת קליטה בבקבוק תרבית מלא בתמיסה מזינה, המורכב (במיקרומטר): Ca(NO 3)2, 3,500; NH 4 H2PO4, 1,000; KNO3, 6,000; MgSO4, 2,000; Na2Fe-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), 75; ח 3בו3, 46; MnSO4, 9.1; ZnSO4, 0.8; CuSO4, 0.3; וכן (NH4 )6Mo7O24, 0.02. התאם את pH הפתרון ל- 7.0 באמצעות 0.1 M KOH. חדש את כל הפתרונות מדי שבוע.</li>
	<li>הניחו את כל בקבוקי התרבית בתא גדילה מבוקר בעוצמת אור של 150-180 μmol m-2 s-1 עם תקופת צילום של 16 שעות בכל יום, ב 27 ° C ו 20 ° C המייצגים יום (16 שעות) ולילה (8 שעות), בהתאמה.</li>
	<li>העבירו 15 שתילי אספסת אחידים לבקבוק זכוכית חדש לניסויי תרבית תחת לחץ של 1 מ"ג ק"ג-1 ו-10 מ"ג ק"ג-1 DEHP לאחר שבועיים. עטפו את בקבוקי הזכוכית ברדיד אלומיניום ופרפילם כדי למנוע פוטוליזה ותנודתיות של DEHP. כדי להחיל את אותם תנאים, גם לעטוף את בקבוקי הבקרה עם רדיד אלומיניום parafilm. יש להשלים את התמיסה התזונתית מדי יום כדי לשמור על רמת הנוזלים.</li>
	<li>הניחו וסובבו את הבקבוקים באופן אקראי כל יומיים כדי להבטיח תנאי גידול עקביים לשתילי האספסת.</li>
	<li>לאחר 7 ימים של טיפוח, להסיר את שתילי אספסת מן הבקבוקים לשטוף עם מים טהורים מספר פעמים, מתכונן לאוסף של exudates שורש.</li>
</ol>2. איסוף, מיצוי וניתוח מטבולומי של הפרשות שורשים
הערה: פרוטוקול זה מחולק לשלושה חלקים: ניסוי איסוף, ניסוי מיצוי וניתוח מטבולי של הפרשות השורש. מטרת ניסוי האיסוף היא להעביר את המטבוליטים המופרשים בדגימות צמחים למערכת התמיסה לצורך מיצוי לאחר מכן.
<ol><li>ניסוי איסוף<ol><li>מעבירים 10 שתילי אספסת אחידים לצינורות צנטריפוגות מלאים ב-50 מ"ל מים מעוקרים שעברו דה-יוניזציה. לטבול את השורשים במים כדי לאסוף שורש exudates במשך 6 שעות; שמור על הצינורות זקופים. בצע לפחות שישה עותקים משוכפלים עבור כל טיפול.</li>
		<li>עטפו את צינורות הצנטריפוגה ברדיד אלומיניום כדי להגן על השורשים מפני אור.</li>
		<li>מוציאים את הצמחים ומייבשים בהקפאה את הנוזל שנאסף לאפיון מטבוליטים.</li>
	</ol></li>
	<li>ניסוי מיצוי<ol><li>הוסף 1.8 מ"ל של תמיסת מיצוי (מתנול:H2O = 3:1, V/V) לצינורות ולמערבולת למשך 30 שניות.</li>
		<li>החל גלי אולטרסאונד על הצינורות במשך 10 דקות באמבט מי קרח.</li>
		<li>צנטריפוגה את הדגימות ב 4 ° C ו 11,000 × גרם במשך 15 דקות.</li>
		<li>בזהירות להעביר 200 μL של supernatant לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. קח 45 μL של supernatant מכל דגימה וערבב אותו לתוך דגימות בקרת איכות (QC) בנפח סופי של 270 μL, המשמש לכיול של נתוני מטבוליזם של דגימות.</li>
		<li>ייבשו בהקפאה את התמציות ברכז ואקום. המשך ייבוש עם 5 μL של התקן הפנימי (ribonucleol).</li>
		<li>לאחר אידוי ברכז ואקום, להוסיף 30 μL של הידרוכלוריד methoxyamination (מומס בפירידין בריכוז של 20 מ"ג mL-1) לצינורות לדגור את הצינורות ב 80 ° C במשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 40 μL של מגיב bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) (עם 1% trimethylchlorosilane [TMC], V/V) ומקם את הצינורות ב 70 ° C למשך 1.5 שעות עבור derivatization.</li>
		<li>קררו את הדגימות לטמפרטורת החדר והוסיפו 5 מיקרוליטר של אסטרי מתיל חומצות שומן (FAMEs) (בכלורופורם) לדגימות QC.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח מטאבולומי<ol><li>הזריקו 1.0 μL של התמציות המפורקות למערכת כרומטוגרף גז המצומדת לספקטרומטר מסות זמן טיסה (GC-TOF-MS) לניתוח פרופיל מטאבולומי באמצעות מצב מפוצל.<ol><li>השתמש בעמוד נימי (30 מ 'x 250 מיקרומטר x 0.25 מיקרומטר) להפרדת הפרשות שורשים, עם הליום כגז מוביל בקצב זרימה של 1.0 מ"ל min-1. הגדר את טמפרטורת ההזרקה ל- 280 ° C, ושמור על טמפרטורת קו ההעברה וטמפרטורת מקור היונים ב- 280 ° C ו- 250 ° C, בהתאמה.</li>
			<li>להפרדה, יש להשתמש בתוכנית התנור הבאה: חימום איזותרמי בדקה אחת ב-50°C, כבש תנור בטמפרטורה של 10°C/min-1 בטמפרטורה של 310°C, וחימום איזותרמי סופי ב-310°C למשך 8 דקות.</li>
			<li>בצע מצב התנגשות אלקטרונים עם -70 eV של אנרגיה. קבל ספקטרום מסות באמצעות מצב ניטור סריקה מלא עם טווח סריקת מסה של 50-500 m/z בקצב של 12.5 ספקטרום/שנייה.</li>
		</ol></li>
		<li>סנן פסגות בודדות כדי להסיר רעש. ערך הסטייה מסונן בהתבסס על הטווח הבין-רבעוני.</li>
		<li>מלא את הערכים החסרים במחצית מערכי המינימום, תקן ונרמל את הנתונים.</li>
		<li>ייבא את הנתונים הסופיים בפורמט .csv לתוכנת ניתוח סטטיסטי לצורך ניתוח רב-משתני.</li>
		<li>חפש את המטבוליטים במסד הנתונים של האנציקלופדיה לגנים וגנומים של קיוטו (KEGG) (משאב מסד נתונים להבנת פונקציות ושירותים ברמה גבוהה של המערכת הביולוגית), וסווג את המטבוליטים לקטגוריות שונות, כגון פחמימות, חומצות, שומנים, אלכוהולים ואמינים. השתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטי כדי לבנות תרשים עוגה כדי לציין את האחוז של כל קטגוריה בכל הפרשות הבסיס.</li>
		<li>החל תחזיות אורתוגונליות מפוקחות על ניתוח מבנים סמויים - הבחנה (OPLS-DA) כדי להדגים את ההבדלים בין קבוצות.</li>
		<li>המסך שינה באופן משמעותי מטבוליטים כמטבוליטים דיפרנציאליים בהתבסס על חשיבות משתנה בהקרנה (VIP) > 1 ו - p < 0.05 (מבחן t של סטודנט).</li>
		<li>השתמש בנתוני חילוף החומרים כדי לבנות מפות חום עם תוכנת הניתוח הסטטיסטי והשתמש בשינויי הקיפול תחת טיפולים שונים כדי לבנות היסטוגרמות.</li>
		<li>חפש את המטבוליטים הדיפרנציאליים במסד הנתונים KEGG וב- Pubchem והידור את המסלולים המטבוליים המכילים את המטבוליטים הדיפרנציאליים. ביצוע ניתוח העשרת מסלולים או ניתוח טופולוגיה.</li>
	</ol></li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.

פרוטוקול זה מספק הדרכה כללית כיצד לאסוף ולמדוד את הפרשות השורש של אספסת תחת לחץ DEHP, כמו גם כיצד לנתח את נתוני חילוף החומרים. יש להקדיש תשומת לב רבה לכמה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. בניסויים בתרבית הידרופונית, שתילי אספסת תורבתו הידרופונית בבקבוקי זכוכית מלאים בתמיסות מזון עם ריכוזים שונים של DEHP. יש להגן על בקבוקי הזכוכית מפני אור על ידי כיסויים ברדיד אלומיניום לאורך כל תקופת התרבית, על מנת למנוע פוטוליזה של DEHP ולהבטיח אחידות בריכוזי DEHP בכל פתרונות התרבית25,26</...

Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) הוא תרכובת כימית סינתטית הנמצאת בשימוש נרחב פלסטיק ופולימרים שונים כמו plasticizer כדי לשפר את הפלסטיות שלהם ואת החוזק. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מחקרים הציעו כי DEHP הוא משבש אנדוקריני ויש לו השפעה שלילית על מערכות הנשימה, העצבים והרבייה של בני אדם ובעלי חיים אחרים 1,2,3. בהתחשב בסיכון הבריאותי שלה, הסוכנות להגנת הסביבה של ארצות הברית, האיחוד האירופי ומרכז ניטור הסביבה של סין סיווגו כולם DEHP ברשימת המזהמים העדיפים. הקרקע נחשבת לכיור חשוב של DEHP בסביבה, בשל יישום חיפוי פלסטיק ודשנים אורגניים, השקיה במי קולחין ויישום חוות בוצה4. כצפוי, DEHP זוהה בכל מקום בקרקעות חקלאיות, שתכולתן מגיעה אפילו עד מיליגרם לקילוגרם של אדמה יבשה באזורים מסוימים בסין 5,6. DEHP יכול להיכנס לצמחים בעיקר דרך השורשים ולעבור הגדלה ביולוגית ברמות טרופיות שונות במערכות אקולוגיות בקרקע7. לכן, הועלה חשש משמעותי לגבי עקה הנגרמת על ידי DEHP בצמחים במהלך העשורים האחרונים.
צמחים בדרך כלל פגיעים לחשיפה ל- DEHP. לחץ DEHP נצפה כגורם להשפעה שלילית על נביטת זרעים ומטבוליזם תקין, ובכך מעכב צמיחה והתפתחות של צמחים 8,9. לדוגמה, DEHP יכול לגרום נזק חמצוני לתאי מזופיל, להפחית את תכולת הכלורופיל והאוסמוליטים, ולהגביר את פעילות האנזימים נוגדי החמצון, מה שבסופו של דבר גורם לירידה ביבול ובאיכות של צמחי מאכל10,11. עם זאת, רוב המחקרים הקודמים על תגובת צמחים לעקה DEHP התמקדו בעקה חמצונית ובמאפיינים פיזיולוגיים וביוכימיים. המנגנונים המתאימים הקשורים למטבוליזם של צמחים נחקרים פחות. הפרשת שורשים היא מונח גנרי המתאר תרכובות ששורשי הצמח מפרישים ומשחררים לסביבה. הם נחשבו כאמצעי האינטראקציה בין צמחים לאדמת ריזוספרה, וממלאים תפקיד חשוב בתמיכה בצמיחה ובהתפתחות של צמחים12. ידוע כי הפרשות שורשים מהוות כ-30%-40% מכלל הפחמן הפוטוסינתטי13. בסביבות מזוהמות, הפרשות שורשים מעורבות בשיפור הסבילות של צמחים לעקה של מזהמים באמצעות חילוף חומרים או הרחקה חיצונית14. כתוצאה מכך, הבנה מעמיקה של תגובת שורשי הצמח להעקה של זיהום עשויה לסייע בחשיפת המנגנונים הבסיסיים הקשורים לביוכימיה של התא ולתופעות ביולוגיות15.
טכנולוגיית מטבולומיקה מספקת אסטרטגיה יעילה למדידת מספר רב של מטבוליטים של מולקולות קטנות בו זמנית בתוך תאים 16,17, רקמות18, ואפילו הפרשה של אורגניזמים 19, כולל סוכרים, חומצות אורגניות, חומצות אמינו ושומנים. בהשוואה לשיטות ניתוח כימיות מסורתיות או קלאסיות, גישת המטבולומיקה מגדילה מאוד את מספר המטבוליטים שניתן לזהות20, מה שיכול לסייע בזיהוי מטבוליטים בדרך תפוקה גבוהה יותר ובזיהוי מסלולים מטבוליים מרכזיים. מטבולומיקה נמצאת בשימוש נרחב בתחום המחקר של תגובה ביולוגית בסביבות עקה, כגון מתכות כבדות21, מזהמים מתפתחים22 וננו-חלקיקים19. רוב המחקרים הללו על צמחים התמקדו בשינויים המטבוליים ברקמות הפנים של הצמח, בעוד שמעטים דווחו על התגובה של הפרשת שורשים לעקה סביבתית. לכן, מטרת מחקר זה היא להציג הנחיות כלליות לאיסוף הפרשות שורש אספסת כדי לחקור את ההשפעה של DEHP על ייצור מטבוליטים. התוצאות יספקו הנחיית שיטה למחקר המשך של מטבולומיקה של צמחים על ידי DEHP.

<table><tbody><tr><td>אדוניטול</td><td>SIGMA</td><td></td><td>&ge; 99%</td></tr> <tr><td>זרעי אספסת</td><td>האקדמיה למדעי החקלאות של ג'יאנגסו (נאנג'ינג, סין)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזון אנליטי</td><td>Sartorius</td><td>BSA124S-CW</td><td></td></tr><tr><td>BSTFA</td><td>REGIS Technologies</td><td></td><td>עם 1% TMCS,</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td> V/V <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Fresco17</td><td></td></tr><tr><td>עמודה כרומטוגרפית</td><td>Agilent</td><td>DB-5MS (30 מ' וזמן; 250 &mu; m & זמנים; 0.25 &mu; m)</td><td></td></tr> <tr><td>Di (2-ethylhexyl) phthalate</td><td>ד"ר Ehrenstorfer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FAMEs</td><td>ד"ר Ehrenstorfer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כרומטוגרפיה גז (GC)</td> <td>Agilent</td><td>7890A</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר שחיקה</td><td>שנחאי Jingxin Technology Co., Ltd</td><td>JXFSTPRP-24</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר מסה (MS)</td> <td>LECO</td><td>PEGASUS HT</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>CNW Technologies</td><td></td><td>HPLC</td></tr><tr><td>Methoxyaminatio hydrochloride</td><td>TCI</td><td></td><td>AR</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה צינור</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf איכות</td><td>1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>תנור</td><td>שנחאי Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd</td><td>DHG-9023A</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Adamas</td><td></td><td>HPLC</td></tr><tr><td>R software</td><td></td><td></td><td>תוכנה לניתוח סטטיסטי (העשרת מסלול, טופולוגיה)</td></tr><tr><td>SIMCA16.0.2&nbsp;</td><td></td><td></td><td>תוכנת ניתוח סטטיסטי (OPLS-DA וכו ')</td></tr> <tr><td>מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Forma 900 סדרת</td><td></td></tr><tr><td>אולטרסאונד</td><td>שנזן Fangao Microelectronics Co., Ltd</td><td>YM-080S</td><td></td></tr><tr><td>מייבש ואקום</td><td>Taicang Huamei מפעל מכשירים ביוכימיים</td><td>LNG-T98</td><td></td></tr></tbody></table>

אוסף של שורש אלפלפה מפריש כדי לחקור את ההשפעה של di(2-ethylhexyl) פתלאט על ייצור מטבוליטים

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production

הפרשות שורשים הן המדיה העיקרית של תקשורת מידע והעברת אנרגיה בין שורשי הצמח לסביבה. השינוי בהפרשת ההפרשה של שורשים הוא בדרך כלל אסטרטגיית ניקוי רעלים חיצונית לצמחים בתנאי עקה. פרוטוקול זה נועד להציג הנחיות כלליות לאיסוף הפרשות שורש אספסת כדי לחקור את ההשפעה של di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) על ייצור מטבוליטים. ראשית, שתילי אספסת גדלים תחת לחץ DEHP בניסוי תרבית הידרופונית. שנית, הצמחים מועברים לצינורות צנטריפוגות המכילים 50 מ"ל מים אולטרה-טהורים מעוקרים למשך 6 שעות כדי לאסוף הפרשות שורשים. לאחר מכן התמיסות מיובשות בהקפאה במייבש בהקפאה בוואקום. הדגימות הקפואות מופקות ומפורקות באמצעות מגיב bis(trimethylsilyl)) trifluoroacetamide (BSTFA). לאחר מכן, התמציות המפורקות נמדדות באמצעות מערכת כרומטוגרף גז יחד עם ספקטרומטר מסה בזמן טיסה (GC-TOF-MS). נתוני המטבוליטים שנרכשו מנותחים לאחר מכן על בסיס שיטות ביואינפורמטיקה. מטבוליטים דיפרנציאליים ומסלולי חילוף חומרים שהשתנו באופן משמעותי צריכים להיחקר לעומק כדי לחשוף את ההשפעה של DEHP על אספסת לאור הפרשות שורש.

בניסוי הזה אספו הפרשות שורש אספסת, חילצו ונותחו בהתאם לשיטות לעיל (איור 1). הוקמו שלוש קבוצות טיפול: בקרה, ריכוז נמוך של DEHP (1 מ"ג L−1), וריכוז גבוה של DEHP (10 מ"ג L−1).
בסך הכל התגלו 778 פסגות בכרומטוגרף של הביקורת, מתוכן ניתן לזהות 314 מטבוליטים על פי ספקטרום המסות. כפי שניתן לראות באיור 2, ניתן לסווג את המטבוליטים האלה לשישה סוגים בהתבסס על השפע היחסי: פחמימות (28.6%), חומצות (15.58%), שומנים (13.87%), אלכו...

הפרשת ההפרשה של שורשים היא בדרך כלל אסטרטגיית ניקוי רעלים חיצונית לצמחים בתנאי עקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך את ההשפעה של קסנוביוטיקה על אספסת באמצעות ניתוח מטבולי לא ממוקד.

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך את ההשפעה של קסנוביוטיקה על אספסת תוך ניתוח מטבולומיקה לא ממוקדת. הטכניקה פשוטה מאוד ונוחה לתפעול וניתן לזהות סוגים נוספים של הפרשות שורש. מה שעוזר לבנות את טביעת האצבע המטבולית של הפרשות שורש הצמח.התחל את עיקור זרעי medicago sativa או אלפלפה על ידי שטיפת הזרעים עם 0.1% hypochlorite נתרן במשך 10 דקות. לאחר מכן יש לשטוף עם 75% אלכוהול אתילי למשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף את הזרעים מעוקרים מספר פעמים עם מים מזוקקים.ואז להנביט אותם על נייר פילטר לח שהונח בצלחת פטרי סטרילית. ב 30 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר הנביטה, מעבירים 20 זרעים גדולים ושמנמנים מונבטים באופן אחיד לסל גריפה בבקבוק תרבית מלא בתמיסה מזינה.הניחו את כל בקבוקי התרבית בתא גידול בתנאים מבוקרים. לאחר שבועיים, העבירו 15 שתילי אספסת אחידים לבקבוק זכוכית חדש כדי לחשוף אותם למיליגרם אחד לקילוגרם ו-10 מיליגרם לקילוגרם DEHP לניסוי התרבית. עטפו את בקבוקי הזכוכית לטיפול ולבקרה ברדיד אלומיניום ופרפילם כדי למנוע פוטוליזה ותנודתיות של DEHP.יש להשלים את התמיסה התזונתית מדי יום כדי לשמור על רמת הנוזלים. הניחו וסובבו את הבקבוקים באופן אקראי כל יומיים כדי להבטיח תנאי גידול עקביים לשתילי האספסת. לאחר שבעה ימי גידול, הוציאו את שתילי האספסת מהבקבוקים.ולשטוף אותם עם מים טהורים מספר פעמים כדי להכין אותם לאוסף של exudates שורש. התחילו את ניסוי איסוף ההפרשה על ידי העברת 10 שתילי אספסת אחידים לצינורות צנטריפוגות מלאים ב-50 מיליליטר מים מעוקרים שעברו דה-יוניזציה. כדי לאסוף הפרשות שורשים, שמרו על הצינורות זקופים במשך שש שעות כשהשורשים שקועים במים.לאחר שתסיים, עטוף את צינורות הצנטריפוגה ברדיד אלומיניום כדי להגן על השורשים מפני אור. מוציאים את הצמחים ומקפיאים לייבש את הנוזל שנאסף לפרופיל מטבוליטים. המשך בניסוי המיצוי על ידי הוספת 1.8 מיליליטר של תמיסת מיצוי לדגימות המיובשות בהקפאה.במערבולת במשך 30 שניות. לאחר מכן, להחיל את גלי אולטרסאונד על צינורות במשך 10 דקות באמבט מי קרח. לפני צנטריפוגת הדגימות.בזהירות להעביר 200 מיקרוליטר של supernatant לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. שאפו 45 מיקרוליטר של סופרנאטנט מצינור הצנטריפוגה וערבבו אותו בדגימות בקרת איכות או QC בנפח סופי של 270 מיקרוליטר. לאחר שתסיים, יבש בהקפאה את התמציות ברכז ואקום.לאחר השלמת הייבוש, מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של ריבונוקלאז סטנדרטי פנימי וממשיכים לייבוש. לאחר אידוי, להוסיף 30 מיקרוליטר של תמיסת הידרוכלוריד methoxyamination ולדגור את הצינורות ב 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, להוסיף 40 מיקרוליטר של מגיב BSTFA לדגימות לפני הצבת צינורות ב 70 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות עבור derivatization.לאחר שהדגירה הסתיימה והדגימה המפורקת מגיעה לטמפרטורת החדר, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של אסטרי מתיל חומצת שומן מומסים בכלורופורם לדגימות המפורקות. באמצעות עמוד נימי בגודל 30 מטר על 250 מיקרומטר על 0.25 מיקרומטר, מפרידים מיקרוליטר אחד של השורש מופרש עם הליום גז נשא בקצב זרימה של 1.0 מיליליטר לדקה. כוונו את טמפרטורת ההזרקה ל-280 מעלות צלזיוס.ולשמור על טמפרטורת קו ההעברה ב 280 מעלות צלזיוס. הגדר את תוכנית התנור להפרדה. לאחר הפרדת התמציות, בצע ספקטרומטריית מסות במצב התנגשות אלקטרונים עם אנרגיה של מינוס 70 אלקטרון וולט.שמרו על טמפרטורת מקור היונים על 250 מעלות צלזיוס. קבל ספקטרום מסות באמצעות מצב ניטור סריקה מלא עם טווח סריקת מסה של 50 עד 500 מסה על ידי טעינה בקצב של 12.5 ספקטרום לשנייה. 778 פסגות התגלו בכרומטוגרף של דגימת הביקורת.מתוכם זוהו 314 מטבוליטים על פי ספקטרום המסות. החומצות חולקו גם לחומצות שומן, חומצות אמינו, חומצות אורגניות וחומצות פנוליות. בנוסף, כמה חומרים נפוצים הנמצאים בדרך כלל בהפרשות שורש התגלו גם בהפרשות שורש אספסת כולל פירימידינים, פירמידינים הידרוקסיים, פלבנואידים, פנולים, קטונים, פירימידינים ודיטרפנים.מפת חום שורטטה בהתבסס על ציון VIP כדי להמחיש את השונות במטבוליטים דיפרנציאליים בין טיפולי DEHP שונים. בהשוואה לדגימות הביקורת, החשיפה ל- DEHP שינתה באופן משמעותי את התוכן של 50 מטבוליטים והפרשת שורש אספסת. כולל בעיקר כמה פחמימות וחומצות אורגניות בעלות משקל מולקולרי נמוך.ניתוח המסלולים המטבוליים הראה כי DEHP עיכב באופן משמעותי את חילוף החומרים של פחמימות שהן תוצר של פוטוסינתזה, מה שמצביע על כך ש- DEHP יכול לדכא את הפוטוסינתזה של אספסת במידה מסוימת: DEHP נראה כמקדם את חילוף החומרים של חומצות שומן המסייעות להתנגד ללחץ מ- DEHP. לפחות יש לבצע את הפרשת שורש הזרע עבור כל טיפול כדי להבטיח ניתוח נתונים מטבוליים מדויק. אנו יכולים לקבוע מטבוליזם דיפרנציאלי ולהמשיך לחקור את הכללים החשובים בהתנהגות הסביבתית של מזהמים.את יחסי הגומלין בין צמחים לבין הקהילה הביולוגית הרחבה יותר של השדה ניתן לפענח בעיקר באמצעות שיטה זו.

collection-alfalfa-root-exudates-to-study-impact-di-2-ethylhexyl

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

ידע של ההרכב של SAP השיפה כמו גם את המנגנון של התחבורה והטעינה למרחקים ארוכים שלה הוא חיוני להבנה של איתות למרחקים ארוכים בפיתוח ומתח / תגובת פתוגן צמח ולהטמיע תחבורה. כתב יד זה מתאר את האוסף של פליטות השיפה בשיטה EDTA-הקל.

איסוף וניתוח של<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; השיפה exudates שימוש בשיטת EDTA-הקלה

כתב יד זה מתאר כיצד ניתן לכמת ביעילות את שיעורי חילוף החומרים של קוטלי עשבים עם עלים שנכרתו מעשב דיקו, ובכך להפחית את השונות ולהסיר כל השפעות מבלבלות אפשריות של ספיגת קוטלי עשבים או טרנסלוקציה שנצפית בדרך כלל במבחני צמח שלם.

מדידת מחירים של קוטל העשבים מטבוליזם בעשבי Dicot עם Assay נכרת עלה

פרוטוקול זה מתאר טכניקה העברה לצבוע אזמל-ניאון טעינת מודד תקשורת בין תאית בערוצי צומת פער. תקשורת בין תאית גאפ junctional היא תהליך הסלולר עיקרי שבאמצעותו הומאוסטזיס רקמות מתוחזק שיבוש איתות התא הזה יש השפעות בריאותיות שליליות.

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

המטרה של מאמר זה היא לתאר פרוטוקול להפקת מטבוליטים מימית מתאי חסיד מתורבת לניתוח metabolomic, במיוחד, אלקטרופורזה-במסה של נימים.

הפקת מיכלי מטבוליטים מחומרים מתורבתים מMetabolomic לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בספקטרומטר המסה

יש לנו אופטימיזציה של קולטן אסטרוגן זמין מסחרית β הכתב assay עבור הקרנת מזונות פרימטים אנושיים ולא אנושיים לפעילות אסטרוגניים. אימתנו את ההסתעפות הזו בכך שהראינו שסויה ידועה של מזון אסטרוגניים רושמת גבוה, בעוד מזונות אחרים אינם מראים פעילות.

הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב Assay

מוצרים מבוססי גלייפוסט (GBP) הם קוטלי העשבים הנפוצים ביותר בספקטרום רחב ברחבי העולם. במאמר זה אנו מציגים קווים מנחים כלליים לכימות ההשפעה של GBP על מיקרוביום, מניסויי שדה ועד ניתוחי ביואינפורמטיקה.

כימות ההשפעה הפוטנציאלית של מוצרים מבוססי גלייפוסט על מיקרוביום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ויעילה להובלה למרחקים ארוכים של חומצות פרפלואורואלקיל בחיטה.

חקירת הובלה למרחקים ארוכים של חומצות פרפלואורואלקיל בחיטה באמצעות טכניקת חשיפה לשורש מפוצל

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ויעילה לזיהוי מטבוליטים של 2,4-דיברומופנול בצמחים.

הבהרת חילוף החומרים של 2,4-דיברומופנול בצמחים

הפרוטוקול מתאר שיטה חדשה להערכת ציטוטוקסיות אינטגרלית של מטבוליטים של חומרי הדברה טריאזולים בצמחים.

הערכת ציטוטוקסיות של מטבוליטים של חומרי הדברה טריאזולים טיפוסיים בצמחים

אנו מציגים פרוטוקול למערכת ניסויית סמי-הידרופונית מבוססת זכוכית התומכת בגידול של מגוון צמחים מובחנים פילוגנטית עם או בלי מיקרואורגניזמים. המערכת תואמת למצעי גידול שונים ומאפשרת דגימת הפרשה שורשית לא הרסנית לניתוח במורד הזרם.

מערכת צנצנות זכוכית רב-תכליתית ליצירת פרופיל הפרשה סמי-הידרופוני של שורשים

אנו מדגימים שיטת תפוקה בינונית לכימות של אפלטוקסינים ופיטואלכסינים סטילבנואידים בזרעי בוטנים בודדים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים מעולים. שיטה זו פותחה במיוחד לניתוח של מיני ארכיס בר המאותגרים על ידי מיני אספרגילוס אפלטוקסיגניים.

כימות מבוסס SPEP-UPLC לא הרסני של אפלטוקסינים ופיטואלכסינים סטילבנואידים בבוטנים בודדים (Arachis spp.) זרעים

חקור את השפעת הזנוביוטיקה על אלפלפה באמצעות ניתוח מטבולומיקה לא ממוקדת. שיטה זו מאפשרת זיהוי סוגים שונים של מופרשי שורש ומסייעת בבניית טביעת אצבע מטבולית.

אוסף של שורש אלפלפה מפריש כדי לחקור את ההשפעה של di(2-ethylhexyl) פתלאט על ייצור מטבוליטים

גלה סרטונים נוספים