מיקרו-דגימה בניתוח חלבונים ממוקד מבוסס ספקטרומטריית מסה של חלבונים בעלי שפע נמוך

פרוטוקול זה נותן לך סקירה שלב אחר שלב על איך להכין חרוזים לניקוי אהדה ופרוטאוליזה של חלבונים, וכיצד להשתמש בהם בקביעת חלבונים בשפע נמוך ממיקרו-דגימות מיובשות. היתרון העיקרי הוא שניתנים לכם הכלים להכין ולבצע דגימה יעילה ביותר של דגימות מורכבות מנפחים קטנים מאוד. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לסמנים ביולוגיים אחרים של חלבונים כל עוד יש לך גישה לנוגדנים יעילים כדי ללכוד את החלבון או את הפפטיד הפרוטאוטיפי.

אתה צריך להיות זהיר מאוד כאשר אתה מתאים את ה- pH לטיפול חומצה של הנוגדן, במיוחד אם אתה מכין נפח קטן של חרוזים. כדי להתחיל, להעביר את הנפח הרצוי של תמיסת נוגדנים לצינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון קושר חמישה מיליליטר, ולהוסיף מוט ערבוב מגנטי קטן לתמיסת הנוגדנים. השתמש במד pH עם מיקרואלקטרודה כדי למדוד את ה- pH, ולהתאים את ה- pH על ידי הוספת תחילה 10 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית טוחנת אחת ולאחר מכן הפחתת נפח ככל שה- pH מתקרב ל -2.5.

רשום את הנפח הכולל של חומצה הידרוכלורית טוחנת אחת הדרושה כדי להתאים את ה- pH ל -2.5. מוציאים את המיקרואלקטרודה, ודגרים על הנוגדן החומצי על קרח, על מערבל מגנטי למשך שעה. כדי לנטרל את תמיסת הנוגדנים, מדדו את ה- pH והתאימו אותו לשבע על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסידי טוחנת אחת ולאחר מכן הפחתת נפח הנתרן הידרוקסידי ככל שה- pH מתקרב לשבע.

רשום את הנפח הכולל של נתרן הידרוקסידי טוחנת אחת. מערבבים היטב את תרחיף החרוזים המגנטי על מערבל מערבולת, ומוציאים נפח המכיל את הכמות הרצויה של תרחיף חרוזים. לדוגמה, כדי להכין מיליליטר אחד של השעיית חרוזים, למשוך נפח המכיל 20 מיליגרם של חרוזים.

הניחו את מתלה החרוזים על מדף מגנטי למשך דקה, והסירו את הסופרנטנט. שוטפים את החרוזים פעמיים בנפח שווה של מים מסוג I, ומערבבים באמצעות מערבל מערבולת לאחר כל תוספת של תמיסת השטיפה. לאחר מכן, הניחו את התמיסה שוב על מדף מגנטי למשך דקה אחת, והוציאו את הסופרנאטנט כפי שהוצג קודם לכן.

הוסף נוגדן לטיפול בחומצה, חיץ בוראט 0.5 מולארי וחיץ צימוד לצימוד נוגדנים לחרוזים המגנטיים. מערבבים באמצעות מערבל מערבולת, ומסובבים בטמפרטורת הסביבה למשך הלילה באמצעות מערבל דגימות מקצה לקצה, רצוי עם סיבוב הדדי ורטט. לאחר מכן, צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 239 גרם.

מניחים את הצינור על המגנט למשך שתי דקות, ומסירים את הסופרנטנט. לאחר שטיפת החרוזים, הניחו את הצינור שוב על המגנט למשך דקה אחת, ובצעו את אותו הליך כדי להסיר את הסופרנטנט. אחסנו אותו במאגר הרצוי באמצעות ריכוז המלאי הרצוי של חרוזים במקרר.

יש לאפשר איסוף של 10 מיקרוליטר של סרום במיקרו-דגימה סופגת נפח של 10 מיקרוליטר, או VAMS, באמצעות הנחיות היצרן, ולייבש באוויר בטמפרטורת הסביבה למשך שעתיים לפחות. הסר את ה- VAMS מהמחזיק והכנס אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון בעל שני מיליליטר. הוסף 1, 000 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום ביקרבונט 100 מילימולרית, ולחלץ VAMS במשך שעה אחת ב 22 מעלות צלזיוס באמצעות מערבל מבוקר טמפרטורה ב 1, 000 סל"ד.

העבירו את התמצית לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בקושר חלבון נמוך של 1.5 מיליליטר עבור פרוטאוליזה טריפטית. הוסיפו 30 מיקרוליטר של חרוזי טריפסין שטופים לכל תמצית VAMS כדי להתחיל את העיכול, ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-1,000 סל"ד באמצעות מיקסר מבוקר טמפרטורה או דומה. צנטריפוגה ב 2, 655 גרם במשך חמש דקות, ולהעביר את supernatant לצינור חדש שני מיליליטר קישור חלבון נמוך microcentrifuge.

הוסף 25 מיקרוליטר של 14 ננוגרם למיליליטר תמיסת תקן פנימי, או IS, המכילה את הפפטיד בעל תווית האיזוטופ היציב בתמיסת אמוניום ביקרבונט 100 מילימולרי. הוסף שני 20 מיקרוליטר של תרחיף חרוזים מגנטי שטוף לכל צינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון המכיל תמצית VAMS מעוכלת ו- IS. בצעו את המיצוי החיסוני במשך שעה באמצעות מערבל דגימות מקצה לקצה בטמפרטורת הסביבה. שטפו את החרוזים המגנטיים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר PBS עם 0.05% פוליסורבט 20.

הסר את צינור המיקרוצנטריפוגה דל החלבון המכיל חרוזים ותמיסת שטיפה מהמדף המגנטי, והפוך בזהירות עד להומוגני. לאחר מכן, הניחו את צינור המיקרוצנטריפוגה דל החלבון על המגנט למשך 30 שניות, הפכו אותו למשך 30 שניות והניחו אותו שוב על המגנט למשך דקה אחת. הסירו את תמיסת הכביסה ושטפו מחדש את החרוזים המגנטיים עם PBS, חומצה הידרוכלורית טריס ואמוניום ביקרבונט.

מוסיפים 15 מיקרוליטר של חומצה פורמית 2% במים מסוג I לכל דגימה, ודגרים במשך חמש דקות ב-22 מעלות צלזיוס וב-1,000 סל"ד באמצעות מיקסר מבוקר טמפרטורה או דומה כדי לנטרל את הפפטידים שנלכדו. לאחר הנחת הפולט על המגנט למשך דקה אחת, העבירו אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בעל 1.5 מיליליטר קושר חלבון נמוך. חזרו על הפעולה פעם אחת, והעבירו את הפולט השני לאותה צינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון כמו הפולט הראשון.

הוסף 20 מיקרוליטר של 100-millimolar אמוניום ביקרבונט לכל eluate. צנטריפוגה אותו, ולהעביר 40 מיקרוליטר של eluate כדי microinserts עבור בקבוקונים HPLC. בתוכנת המכשיר, הגדר את טמפרטורת תנור העמודים ל -25 מעלות צלזיוס ואת קצב הזרימה ל -50 מיקרוליטר לדקה.

לאחר מכן, מקם את הדגימות בדוגם האוטומטי. הכן רצף המכיל את הדגימות להפעלה באמצעות התוכנה הזמינה עבור מערכת LC-MS/MS, והגדר את נפח ההזרקה ל -10 מיקרוליטר. לחץ על Run Sequence בתוכנת המכשיר כדי להתחיל את הרצף, ורשום את אזור השיא של הפפטיד הטריפטי שנלכד על ידי זיקה, ProGRP ספציפי, וה- IS. ספקטרומטריית המסות, או MS, כרומטוגרמות של הפפטיד הפרוטאוטיפי וה- IS לאחר VAMS וכתם סרום מיובש, או DSS, דגימה, כמו גם עבור דגימת סרום ספייק שנוספה ישירות לתמיסת החילוץ מוצגים כאן.

התוצאות המייצגות של יחס שטח השיא של פפטיד ProGRP פרוטאוטיפי ל- IS עבור דגימות סרום עם ProGRP והוחלו על VAMS, DSS או ישירות לתמיסת מיצוי מוצגות באיור זה. מתוצאות אלה, ניתן לראות כי VAMS מספק יחסי שטח דומים לדגימת הביקורת, המצביעים על כך שאין אובדן לחומר הדגימה, בעוד DSS מספק יחס שטח נמוך משמעותית, המצביע על אובדן לחומר הדגימה. באיור זה מוצגת השוואה בין הכרומטוגרמות של שיא הבסיס לאחר מיצוי חלבון שלם לבין מיצוי פפטיד אפיטופי פרוטאוטיפי.

כאשר אתם מכינים בעצמכם חרוזים מצופים נוגדנים או אנזימים, תוכלו להתאים את החרוזים לצרכים הספציפיים שלכם. זה רלוונטי לקביעת חלבונים ממוקדת וניתוח פרוטאומיקה עולמי. שיטות רגישות בקביעת חלבונים מ-VAMS וכתמי דם מיובשים מאפשרות גישות מכוונות מטופל כמו בדיקות חוץ-אשפוזיות במעקב אחר מגוון רחב יותר של מחלות.