בדיקת סינון תוכן גבוהה לזיהוי תרכובות ציטוטוקסיות תאיות תלויות נוגדנים

ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים, או ADCC בקיצור, יכולה להיות מתווכת על ידי תאי הרג טבעיים, שאנו מכנים תאי NK, גרנולוציטים והמקרופאגים. אלה הם תאי ההשפעה של ADCC. אם נוגדן כגון trastuzumab, אשר מכוון לקולטן גורם גדילה אפידרמלי, HER2, נקשר לתאי הגידול, אז תאים משפיעים אלה משתמשים בקולטני FcyR שלהם כדי לקשור את אזור FC קבוע של הנוגדנים.

הנוגדן מגשר בין תאי הגידול לבין תאי ההשפעה נושאי קולטן FcyR, וגורם לשחרור הגרגירים ציטוטוקסיים שלהם. זה מוביל אפופטוזיס של התאים הסרטניים. ADCC עשוי להיות יעיל נגד גידולים שאינם מגיבים להשפעות האנטי-שגשוגיות של trastuzumab.

כדי להקים את מערכת ADCC, עלינו לדגור במשותף על תאי קרצינומה חיוביים של השד JIMT-1 נגד HER2 עם קו התאים NK-92 בנוכחות נוגדן נגד HER2 trastuzumab. קו התאים JIMT-1 בו אנו משתמשים לבדיקה מבטא ביציבות את החלבון הפלואורסצנטי הירוק. ראשית, קודד את לוח ההקרנה בעל 96 בארות תוכן גבוה עם מדיום JIMT.

פיפטה 50 מיקרוליטר של בינוני לתוך כל באר של הצלחת. הכניסו את הצלחת לאינקובטור CO2 למשך שעה. ציפוי חיוני לחיבור תאי JIMT-1 למשטח הזכוכית של הצלחת.

במהלך שלב הציפוי, טריפסיניזציה של תאי JIMT-1. לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS סטרילי. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של Trypsin-EDTA לצלוחית.

החזירו את הבקבוק לאינקובטור CO2 למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, הקש על הבקבוק כדי לבדוק אם תאי JIMT-1 התנתקו. עצור את העיכול עם שני מיליליטר של מדיה JIMT-1 ולאסוף את תרחיף התא לתוך צינור 15 מיליליטר.

לאחר מכן, ספרו את תאי JIMT-1 עם כחול טריפאן בתא יצוק כחול. התאם את מספר התא ל- 133, 000 תאים למ"ל. שואפים את מדיום הציפוי, ולאחר מכן מוסיפים 75 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר.

אפשרו לתאים להיצמד במהלך דגירה של לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור CO2. למחרת, שאפו את המדיום והוסיפו 50 מיקרוליטר טרי JIMT-1 בינוני לבארות, והעבירו את הצלחת למעבדת הסינון בעלת התפוקה הגבוהה. הרובוט משמש להעברת תרכובות הבדיקה אל מיקרו-צלחות הסינון בעלות התוכן הגבוה.

בעזרת הזרוע הרובוטית, הרובוט תופס את יחידת כלי הסיכה, המכוילת להעברת 25 ננוליטר. העבירו סך של 100 ננוליטר של תרכובות בדיקה מצלחת ספריית התרכובות לצלחת הבדיקה בארבעה שלבים. ודא כי הריכוז הסופי של תרכובות הבדיקה הוא 20 micromolar.

בין כל שלב, ראשית, לשטוף את כלי הסיכה ב 50% DMSO, ולאחר מכן ב 70% אתנול. דוגרים על הצלחת במשך שעה באינקובטור CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. תאי NK בתרבית צלוחיות תרבית רקמה T25.

בעוד הטיפול התרופתי בתאי JIMT-1 נמשך, אספו את תאי ה-NK מבקבוק T25 לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. ספור את תאי NK-92 עם כחול טריפאן בתא ספירה כחול. התאם את מספר התא ל- 400, 000 תאים למ"ל.

צנטריפוגה נפח של תרחיף תאי NK המכיל 400, 000 תאים למ"ל ב 150 גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. הכן את מדיום ADCC על ידי הוספת 20 מיקרוגרם לכל מ"ל נוגדן anti-HER2 trastuzumab למדיום JIMT-1. פיפטה 20, 000 תאי NK בתווך ADCC 50 מיקרוליטר לתאי היעד JIMT-1 GFP.

הנפח הסופי הוא 100 מיקרוליטר, וריכוז הטרסטוזומאב הסופי הוא 10 מיקרוגרם למ"ל. מקם את צלחת הבדיקה לתוך ציוד ניתוח תוכן גבוה, אשר יש אינקובטור מובנה להגדיר 37 מעלות צלזיוס. הלוחות מצולמים בשתי נקודות זמן.

ראשית, אנו רוכשים תמונות מיד לאחר הוספת תאי האפקט לתאי היעד, וקבוצת התמונות השנייה מצולמת שלוש שעות לאחר הוספת תאי NK. ראשית, בחר את סוג המיקרו-לוחית. השתמש בלוחיות הקרנה בעלות תוכן גבוה של 96 בארות.

בחר כדי לבחור מיקוד מכיוון שהבדיקה מתבצעת בלוחות עם מטרה של פי 10 במצב לא קונפוקלי. בחר לשלב שניים כדי להכפיל את יחס האות לרעש. בחר את הערוצים המתאימים, זמן החשיפה, עוצמת הלייזר, מישור המיקוד ואורך הגל.

צלם את תמונות השדה הבהיר במהירות של 650-760 ננומטר וזהה את תאי JIMT-1 המומרים על ידי EGFP עם עירור של 488 ננומטר ואורך גל פליטה של 500-550 ננומטר. לפני תחילת המדידה, צלם תמונות לדוגמה באמצעות פונקציית תצלום הבזק כדי לבדוק את ההגדרות הנכונות. לבסוף, הגדר את מספר השדות ואת מספר נקודות הזמן עבור ההדמיה.

בחר, לדוגמה, תשעה שדות ושתי נקודות זמן. כדי לנתח את יעילות ADCC, ספור היטב את תאי ה- JIMT-1 הקיימים ב- ADCC הבקרה. השתמש במודול התאים העדינים כדי לזהות אזורים בתמונה המתאימים לתאים.

זהה כל תא כאזור בתמונה בעל עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה יותר מסביבתו. בחר את התאים באמצעות אלגוריתם M המובנה בקוטר 80 מיקרומטר. הגדר את הגדרת רגישות הפיצול, המחלקת אובייקט גדול לאובייקטים קטנים יותר, לערך 0.5.

התאימו את הסף הנפוץ, שהוא הרמה הנמוכה ביותר של עוצמת פיקסלים, לאפס. אל תכלול זיהוי של אזור רקע עם עוצמה פלואורסצנטית גבוהה של EGFP בשני שלבים. תחילה, החילו את פונקציית חישוב מאפייני העוצמה כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות של EGFP באזור התאים שנבחר קודם לכן.

לאחר מכן, הגדר סף עוצמה מינימלי ומקסימלי באמצעות אפשרות האוכלוסייה הנבחרת, כך שנקבל את מספר תאי היעד הקיימים של JIMT-1 GFP בסוף ADCC. חשב יעילות ADCC על-ידי חלוקת מספר התא שזוהה לאחר שלוש שעות במספר התא שזוהה בזמן אפס. ברצוננו להדגים את היישום המעשי של השיטה שלנו עם תוצאות מייצגות.

הקמנו צלחת בדיקה עם 16 תרכובות שהורדו באופן אקראי מהמדפים. כללנו גם שלוש תרכובות, קולכיצין, וינקריסטין ופודופילוטוקסין עם השפעה מעכבת ADCC צפויה. DMSO שימש כשליטה שלילית.

כל תרופה שימשה בארבע חזרות על הצלחת. האיור מציג את תוצאת מסך הבדיקה. בקבוצת מינוס NK נבדקה רעילות התרופות על תאי JIMT-1.

בקבוצת פלוס NK נוספו תאי NK וטרסטוזומאב, שגרמו לכ-50% ציטוטוקסיות. ההשפעה הצפויה של מעכבי ADCC של שלוש תרכובות הבדיקה יכולה להיות מזוהה עם הבדיקה. הקמנו מערכת לבדיקת תרבית משותפת המדמה את האינטראקציה הרלוונטית מבחינה קלינית בין תאי סרטן השד, תאי NK והנוגדן החד-שבטי הטיפולי trastuzumab.

הבדיקה מבוססת על מיקרוסקופיה אוטומטית בשילוב עם ניתוח תמונה ומתאימה לסינון ספריות תרכובות כימיות לזיהוי תרופות משנות ADCC. ההליך יכול לשמש באופן פוטנציאלי לזיהוי מולקולות אדג'ובנטיות המגבירות תגובה אנטי-סרטנית או לזיהוי כימיקלים עם השפעה שלילית.