Name: בדיקת סידן פלואורסצנטית דו-תוספת לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: למד שיטת סידן פלואורסצנטית דו-תוספת לסינון קולטנים מצומדים לחלבון G בקנה מידה גבוה. השיטה מאפשרת זיהוי אגוניסטים ואנטגוניסטים בבת אחת בתאי CHO-K1 המבטאים קולטן קינין מ-Rhipicephalus microplus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרס USDA-NIFA-AFRI לבריאות ורווחת בעלי חיים (פרס מספר 2022-67015-36336, PVP [מנהל הפרויקט]) ומקרנות תחרותיות מתוכנית המענקים למחלות וקטוריות חרקים של טקסס A&M AgriLife (FY'22-23) ל- P.V.P. קבוצת הסגל A.W.E.S.O.M.E. של המכללה לחקלאות ומדעי החיים, TAMU, מוכרת על עזרה בעריכת כתב היד. טבלה משלימה S2 מכילה נתונים מספריית מולקולות קטנות פנימית, אקראית, שהתקבלו ממעבדתו של ד"ר ג'יימס סאצ'טיני באוניברסיטת A&M בטקסס A&M AgriLife Research.

<ol><li>Hanlon, C. D., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outside-in+signaling+-+A+brief+review+of+GPCR+signaling+with+a+focus+on+the+Drosophila+GPCR+family%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family.</a> Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).</li>
<li>Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-protein+coupled+receptors+%28GPCRs%29+in+insects-A+potential+target+for+new+insecticide+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development.</a> Molecules. 26 (10), 2993(2021).</li>
<li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven-transmembrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 639-650 (2002).</li>
<li>Pietrantonio, P. V., Xiong, C., Nachman, R. J., Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+in+arthropod+vectors%3A+Omics+and+pharmacological+approaches+to+elucidate+ligand-receptor+interactions+and+novel+organismal+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors in arthropod vectors: Omics and pharmacological approaches to elucidate ligand-receptor interactions and novel organismal functions.</a> Current Opinion in Insect Science. 29, 12-20 (2018).</li>
<li>Hilger, D., Masureel, M., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+GPCR+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of GPCR signaling complexes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (1), 4-12 (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, Y., Li, T., Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-protein+coupled+receptors+%28GPCRs%29%3A+Signaling+pathways%2C+characterization%2C+and+functions+in+insect+physiology+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">G-protein coupled receptors (GPCRs): Signaling pathways, characterization, and functions in insect physiology and toxicology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 5260(2021).</li>
<li>Hansen, K. B., Bräuner-Osborne, H. FLIPR® assays of intracellular calcium in GPCR drug discovery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHansen%2C+KB+%22G+Protein-Coupled+Receptors+in+Drug+Discovery%22">G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery</a>. Leifert, W. , Humana Press. Totowa, NJ. (2009).</li>
<li>Bauknecht, P., Jekely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+combinatorial+deorphanization+of+Platynereis+neuropeptide+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-scale combinatorial deorphanization of Platynereis neuropeptide GPCRs.</a> Cell Reports. 12 (4), 684-693 (2015).</li>
<li>Frooninckx, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+GPCRs+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide GPCRs in C. elegans.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 167(2012).</li>
<li>Caers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+two+decades+of+research+on+insect+neuropeptide+GPCRs%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: An overview.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 151(2012).</li>
<li>Šimo, L., Koči, J., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors+for+the+neuropeptides%2C+myoinhibitory+peptide+and+SIFamide%2C+in+control+of+the+salivary+glands+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptors for the neuropeptides, myoinhibitory peptide and SIFamide, in control of the salivary glands of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (4), 376-387 (2013).</li>
<li>Šimo, L., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptidergic+control+of+the+hindgut+in+the+black-legged+tick+Ixodes+scapularis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal for Parasitology. 44 (11), 819-826 (2014).</li>
<li>Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486(2013).</li>
<li>Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcium+bioluminescence+assay+for+functional+analysis+of+mosquito+%28Aedes+aegypti%29+and+tick+%28Rhipicephalus+microplus%29+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2732(2011).</li>
<li>Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cattle+fever+tick%2C+Rhipicephalus+microplus%2C+as+a+model+for+forward+pharmacology+to+elucidate+kinin+GPCR+function+in+the+Acari%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, as a model for forward pharmacology to elucidate kinin GPCR function in the Acari.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1008(2019).</li>
<li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12 (1), 27-38 (2003).</li>
<li>Cox, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+characterization%2C+and+expression+of+a+G-protein-coupled+receptor+from+Lymnaea+stagnalis+and+identification+of+a+leucokinin-like+peptide%2C+PSFHSWSamide%2C+as+its+endogenous+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cloning, characterization, and expression of a G-protein-coupled receptor from Lymnaea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as its endogenous ligand.</a> Journal of Neuroscience. 17 (4), 1197-1205 (1997).</li>
<li>Dircksen, H. Chapter 32 - Crustacean bioactive peptides. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDircksen%2C+H+%22Handbook+of+Biologically+Active+Peptides+%28Second+Edition%29%22">Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition)</a>. Kastin, A. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 209-221 (2013).</li>
<li>Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+evolutionary+origins+of+insect+renal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tracing the evolutionary origins of insect renal function.</a> Nature Communications. 6, 6800(2015).</li>
<li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14 (1), 55-67 (2005).</li>
<li>Radford, J. C., Davies, S. A., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+G-protein-coupled+receptor+analysis+in+Drosophila+melanogaster+identifies+a+leucokinin+receptor+with+novel+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Systematic G-protein-coupled receptor analysis in Drosophila melanogaster identifies a leucokinin receptor with novel roles.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38810-38817 (2002).</li>
<li>Brock, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leucokinin-like+peptide+receptor+from+the+cattle+fever+tick%2C+Rhipicephalus+microplus%2C+is+localized+in+the+midgut+periphery+and+receptor+silencing+with+validated+double-stranded+RNAs+causes+a+reproductive+fitness+cost%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost.</a> International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).</li>
<li>Nässel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucokinin+and+associated+neuropeptides+regulate+multiple+aspects+of+physiology+and+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Leucokinin and associated neuropeptides regulate multiple aspects of physiology and behavior in Drosophila.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1940(2021).</li>
<li>Kim, Y. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+peptidergic+ensembles+associated+with+organization+of+an+innate+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central peptidergic ensembles associated with organization of an innate behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14211-14216 (2006).</li>
<li>Al-Anzi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leucokinin+pathway+and+its+neurons+regulate+meal+size+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The leucokinin pathway and its neurons regulate meal size in Drosophila.</a> Current Biology. 20 (11), 969-978 (2010).</li>
<li>Yurgel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+pair+of+leucokinin+neurons+are+modulated+by+feeding+state+and+regulate+sleep-metabolism+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions.</a> PLoS Biology. 17 (2), 2006409(2019).</li>
<li>Nässel, D. R., Zandawala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+neuropeptide+signaling+in+Drosophila%2C+from+genes+to+physiology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior.</a> Progress in Neurobiology. 179, 101607(2019).</li>
<li>Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+and+downstream+leucokinin+neurons+modulate+larval+turning+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).</li>
<li>Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+leucokinin+receptor+is+critical+for+in+vivo+fluid+excretion+post+blood+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding.</a> FEBS letters. 585 (22), 3507-3512 (2011).</li>
<li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucokinin+mimetic+elicits+aversive+behavior+in+mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+and+inhibits+the+sugar+taste+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).</li>
<li>Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+random+small+molecule+library+screen+identifies+novel+antagonists+of+the+kinin+receptor+from+the+cattle+fever+tick%2C+Rhipicephalus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">A random small molecule library screen identifies novel antagonists of the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae).</a> Pest Management Science. 77 (5), 2238-2251 (2021).</li>
<li>Torfs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinin+peptide+family+in+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The kinin peptide family in invertebrates.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).</li>
<li>Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+Ca2%2B+mobilization+assays+in+GPCR+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (5), 511-523 (2017).</li>
<li>Zhang, J. -H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+GPCR+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li>
<li>Offermanns, S., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%CE%B115+and+G%CE%B116+couple+a+wide+variety+of+receptors+to+phospholipase+C%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (25), 15175-15180 (1995).</li>
<li>Murgia, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+phenotypic+screening+identifies+novel+chemistries+that+disrupt+mosquito+activity+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-content phenotypic screening identifies novel chemistries that disrupt mosquito activity and development.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 182, 105037(2022).</li>
<li>Lismont, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+BRET-based+biosensors+be+used+to+characterize+G-protein+mediated+signaling+pathways+of+an+insect+GPCR%2C+the+Schistocerca+gregaria+CRF-related+diuretic+hormone+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Can BRET-based biosensors be used to characterize G-protein mediated signaling pathways of an insect GPCR, the Schistocerca gregaria CRF-related diuretic hormone receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 122, 103392(2020).</li>
</ol>

למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.

המטרה של HTS היא לזהות מולקולות פגיעות באמצעות סינון מספר עצום של מולקולות קטנות. לכן, התוצאות מדוגמה זו מייצגות רק חלק קטן מניסוי HTS קונבנציונלי. יתר על כן, מולקולות הפגיעה שזוהו צריכות להיות מאומתות במבחנים במורד הזרם, כגון בדיקה תלוית מינון על אותו קו תאים רקומביננטי ועל קו תאים CHO-K1 הנושא רק את הווקטור הריק, אשר ניתן לבצע בו זמנית כדי להציל מולקולות קטנות. מבחני ציטוטוקסיות יסייעו להוכיח כי חוסר תגובה בתוספת השנייה אינו נובע מתמותת תאים. יש לבצע בדיקות ביולוגיות אחרות כדי לאמת את הפעילות ברקמות המבודדות במבחנה...

קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs), הנמצאים משמרים ועד בני אדם, מייצגים את משפחת-העל הגדולה ביותר של קולטנים באורגניזמים רבים1. הם ממלאים תפקידים קריטיים בוויסות כמעט כל התהליכים הביולוגיים בבעלי חיים. ישנם 50-200 GPCRs בגנום של פרוקי רגליים, כלומר הם מייצגים את משפחת קולטני הממברנההגדולה ביותר 2. הם מסווגים לשש מחלקות עיקריות, A-F, בהתבסס על דמיון הרצף והפונקציות שלהם3. GPCRs מתמרים אותות חוץ-תאיים שונים, כגון אלה של הורמונים, נוירופפטידים, אמינים ביוגניים, גלוטמט, פרוטון, ליפוגליקופרוטאינים ופוטונים4. GPCRs מצמידים לחלבוני G הטרוטרימרים (Gα, Gβ ו-Gγ) כדי להעביר אותות במורד הזרם. GPCRs המצומדים לחלבוני Gαs או Gα i/o מגבירים או מקטינים, בהתאמה, את רמות האדנוזין מונופוספט (cAMP) התוך-תאיים 3', 5'-מחזורי על-ידיהפעלה או עיכוב של אדניליל ציקלאז. GPCRs המצומדים ל-Gαq/11 גורמים לשחרור סידן ממאגרי הסידן ברשתית האנדופלסמית על-ידי הפעלת מסלול הפוספוליפאז C (PLC)-אינוזיטול-1,4,5-טריפוספט (IP3). GPCRs המצומדים ל- Gα12/13 מפעילים את גורמי החלפת הנוקלאוטידים RhoGTPase 5,6. GPCRs הם המטרה של יותר מ -50% של תרופות אנושיות ו acaricide, amitraz4. כאשר GPCRs מתמרים אותות כה מגוונים, הם מהווים יעדים מבטיחים לפיתוח חומרי הדברה חדשניים המשבשים תפקודים פיזיולוגיים ספציפיים לחסרי חוליות.
המטרה של HTS היא לזהות מולקולות פגיעות שיכולות לווסת את תפקודי הקולטן. HTS כולל פיתוח בדיקות, מזעור ואוטומציה7. GPCRs נוירופפטידים של פרוקי רגליים מעורבים ברוב הפונקציות הפיזיולוגיות, כגון התפתחות, נפילה ואקדיזיס, הפרשה, גיוס אנרגיה ורבייה4. רוב הנוירופפטידים GPCRs של פרוקי רגליים ומטזואנים מאותתים דרך מפל איתות הסידן 2,6,8,9,10, כגון בקולטני הפפטיד המיואינהימבורי וה-SIFamide של הקרצייה השחורה Ixodes scapularis; הליגנדות שלהם הן אנטגוניסטיות במבחני תנועתיות אחוריים, כאשר SIF מעורר התכווצות ו- MIP מעכב אותו11,12. קולטן דמוי NPY של יתוש הקדחת הצהובה, Aedes aegypti, מווסת את נקבת הפונדקאית המחפשת13. בהשוואה למבחנים חלופיים אחרים לגיוס סידן, כגון בדיקת הסידן הביולומינסנציהaequorin 14, בדיקת הסידן הפלואורסצנטי קלה לביצוע, אינה דורשת העברה של חלבונים אחרים המזהים סידן רקומביננטי, והיא חסכונית. בדיקת הסידן הפלואורסצנטי מייצרת אות ממושך בהשוואה לאות הקינטי המהיר המתקבל בבדיקת הסידן הביולומינסנציה של אקוורין14,15.
בדוגמה כאן, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, התבטא באופן רקומביננטי בקו התאים CHO-K1 ושימש לבדיקת סידן פלואורסצנטי. יש רק גן אחד של קולטן קינין שנמצא במיקרופלוס R. ; הקולטן מאותת דרך מסלול איתות תלוי חלבון Gq ומפעיל את השטף של Ca2+ ממאגרי סידן לתוך החלל התוך-תאי16. ניתן לזהות ולכמת את התהליך הזה על-ידי פלואורופור, שמעורר אות פלואורסצנטי בעת קשירת יוני סידן (איור 1).
קולטן קינין הוא GPCR ספציפי לחסרי חוליות, השייך לקולטנים דמויי רודופסין מסוג A. קינין הוא נוירופפטיד איתות עתיק שנמצא במולוסקה, סרטנאים, חרקים ואקרי 4,17,18. קולופטרנים (חיפושיות) חסרים את מערכת האיתות של קינין; אצל היתוש Aedes aegypti, יש רק קולטן קינין אחד שקושר שלושה אדסקינינים, בעוד שלדרוזופילה מלנוגסטר יש קולטן קינין אחד עם דרוסוקינין כליגנדייחודי 19,20,21. אין קינינים הומולוגיים או קולטני קינין אצל בעלי חוליות. למרות שהתפקוד המדויק של קינין אינו ידוע בקרציות, הנקבות המושתקות ב-RNAi של קולטן קינין של R. microplus מראות ירידה משמעותית בכושר הרבייה22. קינינים הם פפטידים פלוטרופיים בחרקים. ב Drosophila melanogaster, הם מעורבים הן במערכת ויסות העצבים המרכזית והן ההיקפית 23, טרום אקדיזה24, האכלה 25, מטבוליזם 26, ודפוסי פעילות שינה26,27, כמו גם תנועה זחל 28. קינינים מווסתים את ההתכווצות האחורית, דיאורזיס והזנה ביתוש A. aegypti 29,30,31. לפפטידים של קינין יש פנטפפטיד C-terminal Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2 שמור, שהוא הרצף המינימלי הנדרש לפעילות ביולוגית32. הספציפיות של פרוקי הרגליים, הגודל הקטן של הליגנד האנדוגני, מה שהופך אותם לנוחים להפרעות של מולקולות קטנות, והתפקודים הפליאוטרופיים בחרקים הופכים את קולטן קינין למטרה מבטיחה להדברה4.
מבחן "התוספת הכפולה" (איור 2) מאפשר זיהוי של אגוניסטים או אנטגוניסטים באותה בדיקת HTS15. הוא מותאם מבדיקת "תוספת כפולה" המשמשת בדרך כלל בתעשיית התרופות לגילוי תרופות33. בקצרה, התוספת הראשונה של תרופות לצלחת התא מאפשרת זיהוי של אגוניסטים פוטנציאליים בספרייה הכימית כאשר אות פלואורסצנטי גבוה יותר מזוהה בהשוואה ליישום של בקרת הממס. לאחר 5 דקות של דגירה עם מולקולות קטנות אלה, אגוניסט ידוע (פפטיד קינין) מוחל על כל הבארות. אותן בארות שקיבלו באופן אקראי אנטגוניסט מצלחת התרופה מציגות אות פלואורסצנטי נמוך יותר על תוספת אגוניסטית בהשוואה לבארות הבקרה שקיבלו את הממס בתוספת הראשונה. בדיקה זו מאפשרת זיהוי של אגוניסטים ואנטגוניסטים פוטנציאליים עם אותם תאים. בפרויקט HTS סטנדרטי, מולקולות פגיעות אלה יאומתו עוד יותר באמצעות מבחני מינון-תגובה ועל ידי מבחני פעילות ביולוגית נוספים, שאינם מוצגים כאן.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig01.jpg"> איור 1: המחשה של מנגנון בדיקת הסידן הפלואורסצנטי. חלבון ה-Gq מפעיל את מסלול איתות הסידן התוך-תאי. קולטן קינין (קולטן מצומד לחלבון G) בא לידי ביטוי רקומביננטי בתאי CHO-K1. כאשר הליגנד האגוניסט נקשר לקולטן, חלבון ה-Gq הקשור לקולטן קינין מפעיל את PLC, מה שמזרז את ההמרה של מולקולת PIP2 ל-IP3 ו-DAG. לאחר מכן, IP 3 נקשר ל-IP3R על פני השטח של הרשתית האנדופלסמית, מה שמוביל לשחרור Ca 2+ לתוך הציטופלסמה, שם יוני Ca2+ נקשרים לפלואורופורים ומעוררים אות פלואורסצנטי. ניתן לקבל את אות הפלואורסצנציה על ידי עירור ב 490 ננומטר ולזהות ב 514 ננומטר. קיצורים: GPCR = קולטן מצומד חלבון G; PLC = פוספוליפאז C; PIP2 = פוספטידילינוזיטול 4,5-ביספוספט; IP3 = אינוזיטול טריספוספט; DAG = דיאצילגליצרול; IP3 R = קולטן IP3. נוצר באמצעות BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig02.jpg"> איור 2: תהליך העבודה של הקרנה בתפוקה גבוהה של מולקולות קטנות על קולטן מצומד לחלבון G המתבטא בתאי CHO-K1. (A) תאי CHO-K1 רקומביננטיים המבטאים ביציבות את קולטן הקינין נוספו לצלחת 384 באר (10,000 תאים/באר) באמצעות מערכת טיפול בנוזל (25 μL/well) ודוגרו באינקובטור CO2 לח במשך 12-16 שעות. (ב ) חיץ הבדיקה המכיל את הצבע הפלואורסצנטי (25 μL/well) נוסף ללוחית התא באמצעות מערכת טיפול בנוזל. הצלחת דוגרה במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ושיוותה ב-RT למשך 30 דקות נוספות. (D) תמיסות סמים מצלחת ספרייה של 384 בארות וממס ריק (כולם ב-0.5 μL/well) נוספו ללוחית הבדיקה התאית באמצעות מערכת טיפול בנוזלים. (E) תגובות פלואורסצנטיות של סידן תאי נמדדו עם קורא הצלחות מיד לאחר הוספת תמיסות התרופה; תרכובות המעוררות אותות פלואורסצנטיים גבוהים מהממוצע נבחרו כפגיעות אגוניסטיות. להיטים אנטגוניסטיים שחוסמים את ה-GPCR (אייקון למטה) נחשפו לאחר הוספת האגוניסט הפפטידי במהלך שלב G. (F) באותה צלחת בדיקה, לאחר 5 דקות של דגירה של התאים עם תרכובות הקרנה, פפטיד אגוניסט אנדוגני Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) של קולטן קינין קרציות נוסף לכל באר (1 μM). (G) תגובות פלואורסצנטיות תאיות לאחר תוספת הפפטיד האגוניסטית נמדדו על ידי קורא הלוחות באופן מיידי. תרכובות המעכבות את האות הפלואורסצנטי נבחרו כפגיעות אנטגוניסטיות. קיצורים: GPCR = קולטן מצומד חלבון G; RT = טמפרטורת החדר; RFU = יחידות פלואורסצנטיות יחסיות. נוצר באמצעות BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table><tbody><tr><td>0.25% טריפסין-EDTA</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15050-065</td><td>עם פנול אדום</td></tr><tr><td>0.4% טריפן כחול</td><td>MilliporeSigma</td><td>T8154</td><td>נוזלי, סטרילי</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>תרמו פישר</td><td>AM12400</td><td>צינורות מיקרופוגה ללא RNase</td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>קורנינג</td><td>29443-045</td><td>קורנינג קוסטאר סטריפט עטוף בנפרד&nbsp;</td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>קורנינג</td><td>29443-047</td><td>קורנינג קוסטאר סטריפט עטוף בנפרד&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td>סטרילי</td></tr><tr><td>20 ומיקרו; טיפים לסינון L</td><td>USA Scientifc Inc.</td><td>P1121</td><td>סטרילי, מחסום</td></tr><tr><td>25 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>קורנינג</td><td>29443-049</td><td>קורנינג קוסטאר סטריפט עטוף בנפרד&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 50 מ"ל</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>בוגר, סטרילי</td></tr><tr><td>150 מ"ל ידידותי אוטומטי</td><td>Integra Bioscience</td><td>6317</td><td>סטרילי, עטוף בנפרד לזריעת תאים ביום 1</td></tr><tr><td>150 מ"ל שמורה ידידותית אוטומטית</td><td>Integra Bioscience</td><td>6318</td><td>סטרילי, מוערם, להעמסת צבע ביום 2</td></tr><tr><td>384/ 12.5 ומיקרו; L קצות שמירה נמוכים</td><td>Integra Bioscience</td><td>6405</td><td>מסנן סטרילי ארוך</td></tr><tr><td>384/ 12.5 ומיקרו; טיפים</td><td>L Integra Bioscience</td><td>6404</td><td>מסנן ארוך וסטרילי</td></tr><tr><td>384 בארות צלחת</td><td>גריינר</td><td>781091</td><td>CELLSTAR, פוליסטירן שקוף ומיקרו; אטמי צלחת אלומיניום שקופים, שחורים/</td></tr><tr><td>שטוחים</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-AS-200</td><td></td></tr><tr><td>עטיפת רדיד אלומיניום</td> על בסיס פוליאסטר <td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biosafty cabinet II</td><td>NuAire</td><td>NU-540-300</td><td></td></tr><tr><td>מונה תאים</td><td>Nexcelom</td><td>AutoT4</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות ספירת תאים</td><td>Nexcelom</td><td>SD-100</td><td>20 &micro; L תא</td></tr><tr><td>CO2 חממה לחה</td><td>Thermo Fisher</td><td>Forma Series II</td><td></td></tr><tr><td>מנורת שולחן</td><td>SunvaleeyTEK</td><td>RS1000B</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>MilliporeSigma</td><td>276855</td><td>אנהידוס, >99.9%</td></tr> <tr><td>צלחת תרופות</td><td>קורנינג</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג</td><td>מבודד פוספט של Dulbecco</td><td>21-031- CV</td><td>DPBS, 1x ללא סידן ומגנזיום</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Koptec</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>F-12K תערובת נוטריינטים&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>45000-354</td> <td>(Kaighn's Mod.) עם L-גלוטמין</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Equitech-Bio</td><td>SFBU30</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת סידן פלואורסצנטי</td><td>ENZO Lifescience</td><td>ENZ-51017</td><td>בדיקות 10x96</td></tr><tr><td>G418 סולפט</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10131-027</td><td>אנטיביוטיקה סלקטיבית גנטיצין 50 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>מאגר האנק</td><td>MilliporeSigma</td><td>55037C</td><td>HBSS שונה, עם סידן, עם מגנזיום, ללא פנול לקרוא</td></tr><tr><td>מאגר HEPES</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>1 טוחנת</td></tr><tr><td>HTS אחסון נתונים פלטפורמת</td><td>CDD כספת&nbsp;</td><td></td><td>https://www.collaborativedrug.com/</td></tr> <tr><td>מערכת טיפול בנוזלים</td><td>Integra Bioscience</td><td>Viaflo</td><td>384/12.5 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>צלחת צנטריפוגה</td><td>תרמו פישר</td><td>Sorvall ST8</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחת</td><td>BMG טכנולוגיה</td><td>Clariostar</td><td></td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rhimi-K-1 אגוניסט פפטיד</td><td>Genscript</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>QFSPWGamide</td></tr><tr><td>T-75 בקבוק</td><td>בז</td><td>353136</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון g רקומביננטי

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) מייצגים את משפחת-העל הגדולה ביותר של קולטנים והם המטרות של תרופות אנושיות רבות. סינון בתפוקה גבוהה (HTS) של ספריות מולקולות קטנות אקראיות מול GPCRs משמש את תעשיית התרופות לגילוי תרופות ספציפיות למטרה. במחקר זה, נעשה שימוש ב-HTS כדי לזהות ליגנדות חדשניות של מולקולות קטנות של GPCRs נוירופפטידים ספציפיים לחסרי חוליות כבדיקות למחקרים פיזיולוגיים של וקטורים של פתוגנים קטלניים אנושיים ווטרינריים.
קולטן קינין הספציפי לחסרי חוליות נבחר כיעד משום שהוא מווסת תהליכים פיזיולוגיים חשובים רבים אצל חסרי חוליות, כולל דיאורזה, האכלה ועיכול. יתר על כן, הפרמקולוגיה של GPCRs חסרי חוליות רבים מאופיינת בצורה גרועה או אינה מאופיינת כלל; לכן, הפרמקולוגיה הדיפרנציאלית של קבוצות קולטנים אלה ביחס ל- GPCRs הקשורים במטזואנים אחרים, במיוחד בני אדם, מוסיפה ידע ליחסי המבנה-פעילות של GPCRs כמשפחת-על. בדיקת HTS פותחה עבור תאים בלוחות של 384 בארות לגילוי ליגנדות של קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, או קרציית בקר דרומית, Rhipicephalus microplus. קולטן הקרצייה קינין התבטא ביציבות בתאי CHO-K1.
קולטן קינין, כאשר הוא מופעל על ידי נוירופפטידים אנדוגניים של קינין או אגוניסטים אחרים של מולקולות קטנות, גורם לשחרור Ca2+ ממאגרי סידן לתוך הציטופלסמה. בדיקת סידן פלואורסצנטית זו בשילוב עם גישת "תוספת כפולה" יכולה לזהות מולקולות "פוגעות" פונקציונליות של אגוניסט ואנטגוניסט באותה צלחת בדיקה. כל בדיקה נערכה באמצעות לוחות תרופות שנשאו מערך של 320 מולקולות קטנות אקראיות. התקבל גורם Z אמין של 0.7, וזוהו שלוש מולקולות אגוניסט ושני אנטגוניסטים כאשר ה-HTS היה בריכוז סופי של 2 מיקרומטר. ניתן להתאים את בדיקת הסידן הפלואורסצנטית המדווחת כאן לסינון GPCRs אחרים המפעילים את מפל האיתות Ca2+ .

צלחת תרופות פנימית (SAC2-34-6170) המורכבת מ-320 מולקולות קטנות אקראיות שימשה להדגמת מבחן HTS זה כדוגמה. ל-HTS הייתה איכות בדיקה מצוינת עם מקדם Z' של 0.7 (טבלה 1). גורם Z' זה משקף את איכות הבדיקה ללא תלות בתרכובות שנבדקו34. גורם Z′ של 0.5 ומעלה מציין טווח דינמי של אות בדיקה טוב בין ה- RFUs של הפקדים החיוביים לבין הבקרות השליליות. למבחנים עם גורם Z קטן מ-0.5 יש טווח דינמי של אות לא אופטימלי, הם בדרך כלל לא אינפורמטיביים לבחירת להיטים, ולכן הם מושלכים. התגובה (ש...

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

בדיקת התוסף הפלואורסצנטי הכפול של סידן בתפוקה גבוהה מאפשרת זיהוי של ליגנדות חדשניות של מולקולות קטנות של קולטן מצומד לחלבון G המאותת דרך מפל הסידן התוך-תאי. היתרון העיקרי של בדיקת התוספת הכפולה הוא זיהוי של אגוניסט ואנטגוניסט HTS בבדיקה אחת עם אותם תאים בתנאי שהאות הפלואורסצנטי נמשך שתי דקות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל GPCR המאותת דרך מפל הסידן, הכולל את רוב משפחת פפטידי הנוירונים פרוקי הרגליים, GPCRs.לצורך שכפול הבדיקה, חשוב לייעל את צפיפות התא, מהירות ההזרקה והריכוז של האגוניסט הידוע למהדורה השנייה. מי שתדגים את ההליך תהיה ביאנקה הנריקס-סנטוס, עמיתת מחקר בתר-דוקטוריאלית במעבדה שלי. התחל את בדיקת הסידן הפלואורסצנטי על ידי הסרת המדיום המושקע מבקבוקון T-75 המכיל 70 עד 90% BMLK שלושה תאים.שטפו את התאים ב-10 מיליליטר של תמיסת מלח או DPBS של דולבקו. לאחר הסרת DPBS, לנתק את התאים באמצעות שני מיליליטר של 0.25% טריפסין ethylenediaminetetraacetic חומצה או EDTA ודגרה במשך שלוש עד חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים שמונה מיליליטר של מדיום סלקטיבי ומעבירים את מתלה התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.לפני צנטריפוגה ההשעיה התא ב 1000 x גרם במשך שלוש דקות. יש להשליך את הסופר-נאטנט ולהשהות את גלולת התא ב-10 מיליליטר של מדיום F-12K המכיל 1% סרום בקר עוברי או FBS ו-400 מיקרוגרם למיליליטר G418 סולפט. כדי לקבוע את צפיפות התאים של התרחיף לצורך דילול נוסף, ערבבו 20 מיקרוליטרים של תרחיף תאים ל-20 מיקרוליטרים של 0.4% טריפן כחול, ולאחר מכן טענו תערובת של 20 מיקרוליטרים לתוך תא ספירת תאים כדי להיקרא על ידי מונה תאים לצפיפות התא.לדלל את תרחיף התא באמצעות אותו מדיום F-12K ולהרכיב את הנפח הסופי ל 15 מיליליטר בצפיפות של ארבע פעמים 10 עד החמישי תאים למיליליטר. כדי לזרוע את התאים בליזין Poly-D או PDL מקודד 384 צלחת היטב. הוסף 25 מיקרוליטר של תרחיף התא המדולל לתוך 384 בארות של הצלחת באמצעות מערכת טיפול בנוזל.יש לדגום את הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באינקובטור הלח. ביום שלמחרת, הפוך במהירות את צלחת הקידוח 384 בעלת 90%. כדי להסיר את המדיום בילה בעדינות מוכתם על מגבות נייר סטריליות פעמיים עד שלוש כדי להסיר את כל הנוזלים מהצלחת.בצע את השלבים הבאים באור העמום הרך בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של צבע ההעמסה לכל באר באמצעות מערכת טיפול בנוזלים על ידי חלוקת 12.5 מיקרוליטרים לכל באר עם שאיפה ומהירות חלוקה של 3.8 מיקרוליטר לשנייה. חזור על שלב פיפטינג זה כדי להגיע לנפח סופי של 25 מיקרוליטר בכל באר.לאחר שתסיימו, כסו את הצלחת ברדיד אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור הסביבה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור הלח של פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. לאחר שיווי משקל הצלחת המכוסה למשך 30 דקות נוספות, התאים מוכנים לבדיקת תפוקה גבוהה או HTS. לאחר מכן, צנטריפוגה צלחת התרופה ב 1200 x גרם צנטריפוגה צלחת במשך דקה אחת.העבר את תמיסת הפפטיד האגוניסט 10x של Rhimi-K-1 למאגר ידידותי לרכב של 150 מיליליטר. בקורא הלוחות, לחץ על נהל פרוטוקולים. לאחר מכן, בפרוטוקול עוצמת הפלואורסצנט של נקודת הקצה, בחר Flow Forte לקריאה מראש, לחץ על התחל מדידה כדי למדוד את אות הרקע עבור כל בדיקת HTS.הכנס את לוחית התא לקורא הלוחות. בלוח המחוונים, לחץ על באר אקראית על הצלחת ולאחר מכן לחץ על גובה מיקוד חדש. לחץ על התאמת המיקוד.לחץ על התאמת רווח. הקצה אותו כ- 5% עד 10% מערך הפלואורסצנציה המרבי הניתן למדידה. לחץ על התחל התאמה.לחץ על התחל מדידה כדי לקרוא את כל הלוח עבור אות הפלואורסצנציה ברקע ביחידות פלואורסצנטיות יחסית או RFU. בזמן קריאת הלוחית, לחץ על מצב נוכחי כדי לראות את ערך הקריאה בזמן אמת. עבור הבדיקה הכפולה הנוספת, פיפטה 10 מיקרוליטר של תמיסת התרופה למעלה ולמטה שלוש פעמים באמצעות מערכת הטיפול בנוזל ושאיפה 1.5 מיקרוליטר מכל באר של צלחת התרופה במהירות שאיפה של 1.0 מיקרוליטר לשנייה.יש לפזר 0.5 מיקרוליטרים של התרכובות לתוך בדיקת התא כדי להגיע לריכוז סופי של שני מיקרומולרים ב-0.2% דימתיל סולפוקסיד או DMSO. לאחר הוספת תרכובות ההקרנה, הנח את צלחת הבדיקה מיד לתוך קורא הלוחות. לחץ על תוכנית הקריאה המוגדרת מראש וקרא את הלוח בכיווני הקריאה קדימה ואחורה.השליכו מיקרוליטר אחד של תמיסת תרופות שנותרה בקצוות על ידי טבילת הטיפים לתוך מאגר פסולת של 150 מיליליטר המכיל כ-50 מיליליטר של DPBS. דגרו את תרכובות הסינון עם התאים למשך חמש דקות בסך הכל, כולל הזמן בתוך קורא הצלחות בארון הבטיחות הביולוגית כשהאורות כבויים. לאחר מכן, הוסף שלושה מיקרוליטרים של הפפטיד האגוניסט Rhimi-K-1 מהמאגר לתוך צלחת הבדיקה באמצעות מערכת הטיפול בנוזל באמצעות 384 12.5 מיקרוליטר טיפים.הכניסו את הצלחת מיד לקורא הצלחות. לחץ על תוכנית הקריאה המוגדרת מראש וקרא את הלוח בכיווני הקריאה קדימה ואחורה. לאחר ביצוע פעולה ידנית לחשב את Z'factor עבור בקרת האיכות של כל בדיקת צלחת.בחר באופן ידני את מולקולות הלהיט ממפות החום בפלטפורמת הנתונים המקוונת של HTS וחשב את הפעלת האחוזים המנורמלת או NPA ופעילות מעכבת, או I0 עבור הלהיטים האגוניסטיים והפגיעות האנטגוניסטיות. לוחית תרופות פנימית SAC2-34-6170 המורכבת מ-320 מולקולות קטנות אקראיות שימשה להדגמת בדיקת HTS זו. ל-HTS הייתה איכות בדיקה מצוינת עם גורם Z'factor של 0.7 המשקף שאיכות הבדיקה אינה תלויה בתרכובות שנבדקו.זה חיוני כדי לקרוא את הצלחת מיד לאחר הוספת אגוניסט כי האות פלואורסצנטי הוא קצר מועד. לאחר הליך זה, יש לאמת את מולקולת הפגיעה שזוהתה באמצעות מבחני תגובת מינון ולבדוק בתאים שאינם מבטאים את GPCR המטרה כדי לא לכלול פגיעות מחוץ למטרה.

a-dual-addition-calcium-fluorescence-assay-for-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

על ידי שימוש לפתור spectrally שני הפוטונים מערכת הדמיה מיקרוסקופית, פיקסל ברמה מפות של העברת אנרגיה תהודה פורסטר (סריג) יעילות מתקבלים עבור תאים להביע את קולטני קרום השערה כדי ליצור הומו-oligomeric קומפלקסים. מן סריג מפות יעילות, אנו מסוגלים להעריך מידע stoichiometric על המתחם oligomer תחת מחקר.

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

וידאו זה מספק פרוטוקול מפורט לחקר פרופיל פרמקולוגי של TRPA1 ערוצי אנושי באמצעות FlexStation 3. פרוטוקול מכסה הפרטים של הכנת התאים, טוען לצבוע ותפעול של הקורא microplate, FlexStation 3.

תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3

בזמן אמת ההקרנה הליך לזיהוי סמים כי אינטראקציה עם חלבון G-מגודרת פנימה מיישר...

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

סרטון זה מדגים בדיקה תאית הכוללת תאי גליובלסטומה המבטאים קולטני כימוקין CXCR4. הבדיקה משתמשת בצבע רגיש לסידן כדי למדוד שינויים פלואורסצנטיים בעת אינטראקציה עם הסוכן, ומציעה תובנות לגבי דינמיקת איתות תאי.

בדיקה סלולרית לזיהוי סוכנים בעלי אינטראקציה CXCR4

Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

וזמינותו הסלולר המתוארת נועד לצורך זיהוי הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4)-סוכנים שמעצבת לעכב או לגרות, תחרותי או allosterically, תאיים Ca2 + שחרור שיזם CXCR4 הפעלה.

קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric

המטרה של פרוטוקול זה נועד להקל על המחקר של קולטני NMDA (NMDAR) בקנה מידה גדול יותר, לאפשר הבחינה של תופעות modulatory של מולקולות קטנות ושימושיהם טיפולית.

וזמינותו תפוקה גבוהה סידן השטף ללמוד קולטני NMDA עם רגישות גליצין/D-סרין, גלוטמט

GPCR-β-מפיגור אינטראקציות הם שדה המתעוררים בגילוי סמים GPCR. מדויק, מדויק וקל להגדיר שיטות נחוצים כדי לפקח על אינטראקציות כאלה במערכות החיים. אנו מראים שיטת compleמנטציה מבנית לניטור GPCR-β-בפיגור בתאי החיים בזמן אמת, וזה יכול להיות מורחב לכל GPCR.

מעקב GPCR-β-arrestin1/2 אינטראקציות בזמן אמת מערכות חיים כדי להאיץ את גילוי הסמים

בהינתן כי GPCRs הם מטרות druggable אטרקטיבי, gpcr ליגנד הקרנה היא הכרחית ובכך לזיהוי תרכובות עופרת ולמחקרים de aniטיזציה. לקראת מאמצים אלה, אנו מתארים את פרסטו-טנגו, פלטפורמת משאב מקור פתוח המשמש ליצירת פרופיל סימולטני של גיוס β-arrestin2 ארעי ב כ 300 GPCRs באמצעות שיטת העיתונאי מבוסס TEV.

חקירה מקבילה של גיוס β-Arrestin2 עבור ליגיון הקרנה בקנה מידה מוקטן של הסרט באמצעות שיטת הטנגו-פרסטו

פותח פרוטוקול משופר לבדיקת ניוד סידן עם תאי אנדותל, המשמש לזיהוי ליגנדות של קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז (PARs). הפרוטוקול החדש מקצר את זמן הבדיקה הכולל ב-90-120 דקות ומניב עקומות ריכוז-תגובה הניתנות לשחזור.

אפיון אפנן קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז עם בדיקת ניוד סידן באמצעות קורא צלחות

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בחיישנים ביולוגיים מבוססי BRET למדידה בזמן אמת של הפעלת חלבון G בתאי HEK293 חיים על גירוי ליגנד קולטן מצומד לחלבון G. כאן, קולטן β2-אדרנרגי וקולטן קנבינואיד מסוג 1 משמשים כדוגמאות להדגמת היעילות של חיישנים עבור מספר תת-סוגים של חלבון G ועל פני GPCRs שונים.

חיישנים ביולוגיים של חלבון G מבוססי BRET למדידת פעילות קולטן מצמד חלבון G בתאים חיים

למד שיטת סידן פלואורסצנטית דו-תוספת לסינון קולטנים מצומדים לחלבון G בקנה מידה גבוה. השיטה מאפשרת זיהוי אגוניסטים ואנטגוניסטים בבת אחת בתאי CHO-K1 המבטאים קולטן קינין מ-Rhipicephalus microplus.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

גלה סרטונים נוספים