Name: יצירת אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים בריאים וספציפיים למחלות רשתית הנגרמים על ידי בני אדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: למד שיטה יעילה להפקת אורגנואידים נוורטינליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. הפרוטוקול משלב תרביות דביקות ותלויות לאפיון מחלות רשתית ויישומים רגנרטיביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים על התמיכה המדעית והטכנית של ד"ר צ'יטרה קנאבירן, גנטיקאית; ד"ר סובהדרה ג'לאלי, יועצת רשתית; ד"ר מילינד נאיק, כירורג אוקולופלסטי; וד"ר סוואתי קליקי, אונקולוג עיניים במכון העיניים LV Prasad, היידראבאד לקראת יצירת קווי iPSC נורמליים וספציפיים למטופל. המחברים מודים על מענקי המו"פ של מועצת המחקר למדע והנדסה, המחלקה למדע וטכנולוגיה (IM), (SB/SO/HS/177/2013), המחלקה לביוטכנולוגיה (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019), ומלגות מחקר בכירות מ- ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) ו- CSIR (V.K.P.), ממשלת הודו.

<ol><li>Dandona, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+visual+impairment+in+India%3A+the+Andhra+Pradesh+Eye+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).</li>
<li>Sen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+retinitis+pigmentosa+in+South+Indian+population+aged+above+40+years%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years.</a> Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).</li>
<li>Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trend+of+retinal+diseases+in+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Trend of retinal diseases in developing countries.</a> Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).</li>
<li>RetNet - Retinal Information Network. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sph.uth.edu/retnet/">https://sph.uth.edu/retnet/</a> (2022).</li>
<li>Cicero, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+retinitis+pigmentosa%3A+retinal+organoids+generated+from+the+iPSCs+of+a+patient+with+the+USH2A+mutation+show+early+developmental+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361(2019).</li>
<li>Lane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+and+rescue+of+RP2+Retinitis+pigmentosa+using+iPSC-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).</li>
<li>Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+retinitis+pigmentosa+through+patient-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100438(2021).</li>
<li>Gonzalez-Cordero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+human+retinal+development+from+human+pluripotent+stem+cells+generates+transplantable+populations+of+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).</li>
<li>Meyer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+vesicle-like+structures+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+facilitate+a+customized+approach+to+retinal+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment.</a> Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).</li>
<li>Zhu, J., Lamba, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-based+retinal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.</a> Bio-Protocol. 8 (12), 2882(2018).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communications. 5, 4047(2014).</li>
<li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 766(2017).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95(2019).</li>
<li>Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+development+of+rod+photoreceptors+in+retinal+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+by+supplementation+with+9-cis+retinal%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100033(2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP%2C+TGFbeta+and+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Mellough, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-1+signaling+plays+an+important+role+in+the+formation+of+three-dimensional+laminated+neural+retina+and+other+ocular+structures+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).</li>
<li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li>
</ol>

לכל המחברים אין ניגוד עניינים או גילויים כספיים.

hiPSCs הם כלי רב עוצמה לחקר התפתחות איברים ורקמות במבחנה. שחזור פנוטיפ המחלה על ידי הבחנה בין hiPSCs בריאים לעומת ספציפיים למחלה לכיוון שושלת הרשתית יכול לעזור בהשגת תובנות חדשות יותר על הפתופיזיולוגיה של צורות שונות של ניוון רשתית תורשתי. מספר פרוטוקולים תוארו ואומצו להתמיינות חוץ גופית של PSCs לסוגי תאי רשתית. רובם כרוכים בשימוש במדיום תרבית המכיל קוקטיילים מורכבים של גורמי גדילה רקומביננטיים, תוספים, מולקולות קטנות וריאגנטים, כגון: תוספי N1, N2 ו-B27; חוסמי איתות BMP ו- TGFβ כמו Noggin, SB431542, LDN...

הרשתית היא רקמה רגישה לאור הנמצאת בחלק האחורי של עין החוליות הממירה אותות אור לדחפים עצביים על ידי תופעה ביוכימית הידועה בשם מסלול פוטו-טרנסדוקציה. הדחפים העצביים הראשוניים הנוצרים בתאי הפוטורצפטור של הרשתית מתומרמים לתאי עצב אחרים ברשתית ולתאי גנגליון ברשתית (RGCs) ומגיעים לקליפת המוח הראייתית, המסייעת בתפיסת תמונה ובתגובה חזותית.
על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), כ -1.5 מיליון ילדים עיוורים, מתוכם מיליון באסיה. ניוון רשתית תורשתי (IRD) היא מחלה מסנוורת חמורה הפוגעת ב-1 מכל 4,000 אנשים ברחבי העולם בגילאי 1,2,3, בעוד ששכיחות העיוורון הקשור לניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) נעה בין 0.6%-1.1% במדינות מתפתחות4. IRDs נגרמים על ידי פגמים גנטיים תורשתיים ביותר מ -300 גנים שונים המעורבים בהתפתחות הרשתית ותפקוד5. שינויים גנטיים כאלה גורמים לשיבוש תפקודי הרשתית התקינים ולניוון הדרגתי של תאי הרשתית, כלומר תאי קולטני האור והאפיתל הפיגמנטי ברשתית (RPE), ובכך מובילים לאובדן ראייה חמור ולעיוורון. התקדמות עצומה הושגה במצבים מסנוורים אחרים המערבים את הקרנית, העדשה וכו'. עם זאת, ניוון רשתית וניוון עצב הראייה אין כל טיפול מוכח עד כה. מכיוון שלרשתית אנושית בוגרת אין תאי גזע6, מקורות חלופיים כגון תאי גזע עובריים (ESC) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם במטופל (iPSCs) יכולים לספק אספקה בלתי מוגבלת של סוגי תאים רצויים וטומנים בחובם הבטחה גדולה לפיתוח אורגנואידים מורכבים של רקמות הדרושות למחקרי מידול מחלות חוץ גופיות ולפיתוח טיפולים רגנרטיביים7, 8,9,10.
מספר שנים של מחקר רשתית הובילו להבנה טובה יותר של אירועים מולקולריים המתזמרים התפתחות רשתית מוקדמת. רוב הפרוטוקולים ליצירת תאי רשתית ואורגנואידים תלת-ממדיים מ-PSCs שואפים לשחזר אירועים התפתחותיים אלה במבחנה, על ידי תרבית התאים בקוקטייל מורכב של גורמי גדילה ומולקולות קטנות כדי לווסת את התהליכים הביולוגיים הידועים באופן מדורג. אורגנואידי הרשתית הנוצרים כך מורכבים מתאי רשתית עיקריים: תאי גנגליון רשתית (RGCs), אינטרנוירונים, פוטורצפטורים ואפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. למרות ניסיונות מוצלחים למדל IRDs באמצעות אורגנואידים ברשתית, הדרישה לקוקטייל המורכב של גורמי גדילה ומולקולות קטנות במהלך התמיינות והיעילות הנמוכה יחסית של יצירת אורגנואידים ברשתית מציבה אתגר גדול ברוב הפרוטוקולים. הם כוללים בעיקר היווצרות של גופים עובריים, ולאחר מכן התמיינות מדורגת שלהם לשושלות רשתית באמצעות תנאי תרבית מורכבים בשלבים שונים של התפתחות חוץ גופית 20,21,22.
כאן מדווחת שיטה פשוטה וחזקה לפיתוח אורגנואידים נוירו-רשתית תלת-ממדיים מורכבים מבקרה בריאה ו-hiPSCs ספציפיים למחלות רשתית. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בהבחנה ישירה של תרביות hiPSC כמעט משתלבות ללא צורך בהיווצרות גוף עוברי. כמו כן, המורכבות של מדיום התרבות היא פשוטה יותר, מה שהופך אותו טכניקה חסכונית לשחזור שניתן לאמץ בקלות על ידי חוקרים חדשים. היא כוללת מערכת תרבית היברידית המורכבת מתרביות חד-שכבתיות דבקות במהלך 4 השבועות הראשונים של התמיינות הרשתית עד להופעתם של אשכולות קדמוניים מובהקים של שדה עיניים (EFPs) המאורגנים בעצמם. יתר על כן, האיים הנוירו-רשתית המעגליים בתוך כל EFP נקטפים ידנית ומגודלים בתרביות תרחיף במשך 1-2 שבועות כדי להכין גביעי רשתית תלת-ממדיים רב-שכבתיים או אורגנואידים המורכבים ממבשרי נוירו-רשתית מתרבים PAX6+ ו-CHX10+ . תרבית ממושכת של אורגנואידים ברשתית בתווך המכיל טאורין של 100 מיקרומטר למשך 4 שבועות נוספים הביאה להופעתם של מבשרי קולטני אור RCVRN + ו-CRX+ ותאים בוגרים עם שלוחות בסיסיות דמויות מקטע פנימי.

<table><tbody><tr><td>0.22 ומיקרו; מסנני מזרק m</td><td>TPP</td><td>99722&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>6 צלחות באר</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד CHX10; עכבר חד שבטי</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC365519</td><td>1:50 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן Anti-CRX; ארנב חד שבטי</td><td>Abcam</td><td>ab140603</td><td>1:300 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן נגד MiTF, עכבר חד שבטי</td><td>Abcam</td><td>ab3201</td><td>1:250 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן נגד התאוששות; ארנב רב-שבטי&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Millipore</td><td>AB5585</td><td>תוסף B-27 דילול 1:300</td></tr><tr><td>(פי 50), ללא סרום</td><td>תרמו פישר</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה בסיסי פיברובלסטים (bFGF)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810R</td><td>צנצנת קופלין אפנדורף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(50 מ"ל)</td><td>טרסון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קורנינג מטריג'ל hESC מוסמך מטריקס</td><td>קורנינג</td><td></td><td></td>354277</tr><tr><td>CryoTubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>V7884</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, תוסף GlutaMAX (מדיום בסיסי)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA פולימראז</td><td>תרמו פישר</td><td>EP0709</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s פוספט חוצץ</td><td>מלח תרמו פישר</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>חיוני 8 ערכה בינונית</td><td>תרמו פישר</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>אתילן דיאמין טטראצטיחומצה דיסודיום מלח דיהידראט (EDTA)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>פלקון לא מטופל TC צלחת פטרי מטופלת, 60 מ"מ&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Fetal&nbsp; בקר&nbsp; סרום, מוסמך, ארצות הברית&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>GelDocXR+ עם תוכנת מעבדת תמונות</td> מערכת תיעוד <td>ג'ל BIO-RAD</td><td></td><td>Agarose&nbsp;</td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX</td><td>תרמו פישר</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>1:300 דילול</td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG (H+L), Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td>1:300 דילול</td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG (H+L), Alexa Fluo 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>1:300 דילול</td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב- IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:300 דילול</td></tr><tr><td>HistoCore MULTICUT</td><td>Leica</td><td></td><td>לחתך</td></tr><tr><td>החלפת סרום נוקאאוט</td><td>תרמו פישר</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>חומצה L-Acsorbic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>N2 תוסף (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>לכימות RNA</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Qualigens</td><td>23995</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipets, 9 אינץ', לא סטרילי, Unplugged</td><td>Corning</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן רקומביננטי נגד Otx2 , ארנב חד שבטי</td><td>Abcam</td><td>ab183951</td><td>1:300 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן רקומביננטי נגד PAX6; ארנב חד שבטי</td><td>Abcam</td><td>ab195045</td><td>1:300 דילול</td></tr><tr><td>רקומביננטי נוגדן נגד RPE65, ארנב חד שבטי</td><td>Abcam</td><td>ab231782</td><td>1:300 דילול</td></tr><tr><td>רקומביננטי חלבון נוגין אנושי</td><td>R& D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות 10 מ"ל</td><td>TPP</td><td>94010</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות 5 מ"ל</td><td>TPP</td><td>94005</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט טריבייסי דיהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>סטארפרוסט ( מצופה סילאן) שקופיות מיקרוסקופיות</td><td>Knittel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III מערכת סינתזה של גדיל ראשון</td><td>Thermo Fisher</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III מערכת סינתזה של גדיל ראשון עבור RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp; מגיב</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 מ' EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade מדיום הרכבה עם DAPI&nbsp;</td><td>מעבדות וקטור</td><td>H-1200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A27940</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 דיהידרוכלוריד (מעכב רו-קינאז)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>Zeiss</td><td></td><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td></tr></tbody></table>

יצירת אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים בריאים וספציפיים למחלות רשתית הנגרמים על ידי בני אדם

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

תאי גזע פלוריפוטנטיים יכולים לייצר אורגנואידים מורכבים של רקמות השימושיים למחקרי מודלים של מחלות חוץ גופיות ולפיתוח טיפולים רגנרטיביים. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה, חזקה ומדורגת יותר ליצירת אורגנואידים ברשתית במערכת תרבית היברידית המורכבת מתרביות חד-שכבתיות דבקות במהלך 4 השבועות הראשונים של התמיינות הרשתית עד להופעתם של אשכולות קדמוניים מובהקים של שדה העין (EFPs) המאורגנים באופן עצמאי. יתר על כן, האיים הנוירו-רשתיים בצורת סופגנייה, עגולים ושקופים בתוך כל EFP נקטפים ידנית ומתורבתים תחת תרחיף באמצעות צלחות תרבית לא דבקות במדיום התמיינות רשתית למשך 1-2 שבועות כדי ליצור כוסות אופטיות תלת-ממדיות רב-שכבתיות (OC-1M). אורגנואידים לא בשלים אלה ברשתית מכילים PAX6+ ו-ChX10+ מתרבים ומבשרי רשתית רב-עוצמה. התאים המקדימים מורכבים באופן ליניארי בתוך האורגנואידים ומופיעים כפסיעות רדיאליות נפרדות. לאחר 4 שבועות לאחר תרבית התרחיף, אבות הרשתית עוברים דום פוסט-מיטוטי והתמיינות שושלת ליצירת אורגנואידים רשתית בוגרים (OC-2M). שושלת קולטני האור מתפתחת בתוך השכבות החיצוניות ביותר של אורגנואידים ברשתית. תאים קולטי אור CRX+ ו-RCVRN+ אלה בשלים מורפולוגית כדי להציג הרחבות פנימיות דמויות סגמנט. ניתן לאמץ שיטה זו ליצירת אורגנואידים ברשתית באמצעות תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). כל השלבים והנהלים מוסברים ומודגמים בבירור כדי להבטיח שכפול וליישומים רחבים יותר במדע בסיסי ובמחקר תרגומי.

התמיינות של hiPSCs לשושלות עיניים מושגת על-ידי תרבית תאים בקוקטיילים שונים של מדיום תרבית המכיל תוספי מזון וגורמי גדילה בשלבים עוקבים בנקודות זמן שונות, כפי שמתואר באיור 1. תרביות hiPSC נשמרות בתווך Essential 8, מדיום תחזוקת תאי גזע פלוריפוטנטי. ברגע שהם מגיעים למפגש של 70%-80% (איור 2A), המדיום מוחלף ב-Differentiation Induction Medium (DIM) ביום 0 (עיין בשלב 3.2) המכיל 1 ng/mL bFGF, 1 ng/mL Noggin ו-1% תוספת N2. יחד עם תוסף N2 הגורם לעצבים, Noggin, מעכב איתות B...

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להבחנה של hiPSCs לצברי שדות עיניים ויצירת אורגנואידים נוירו-רשתית באמצעות תנאי תרבית פשוטים המערבים הן מערכות תרבית הדבקה והן מערכת תרבית תלייה. סוגים אחרים של תאי עין, כגון RPE ואפיתל הקרנית, יכולים גם הם להיות מבודדים משדות עיניים בוגרים בתרביות רשתית.

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה להבחנה בין IPCs אנושיים לאורגנואידים נוירו-רשתית תלת-ממדיים מורכבים לצורך מחקר ויישומים רגנרטיביים. טכניקה זו מערבת תרביות דבק ותרחיף, מה שמאפשר בחירה סלקטיבית והעשרה של אורגנואידים ברשתית ותאי RP. הוא יכול להציע אספקה בת קיימא וסדירה של מקורות תאיים לפיתוח טיפולים מבוססי תאים למחלות ניווניות ברשתית.אורגנואידים רשתית כאלה שמקורם בתאי גזע ותאי RPE שימושיים כמו מודלים במבחנה לחקר התפתחות העיניים ומחלות רשתית תורשתיות. שיטה זו ניתנת לשכפול בקלות על ידי מעבדות מחקר שכבר מכירות את הטיפול בתרביות IPSC אנושיות. הדגמה חזותית תומכת מאוד בזיהוי שדות עיניים ובבידוד גביעי רשתית עצביים בהתבסס על מיקומם המרחבי ותכונותיהם המורפולוגיות.כדי להתחיל, לשאוף את המדיום בילה מ 70 עד 80% תרבויות IPSC אנושיות בשש בארות. הוסיפו PBS לבארות, ערבלו אותן ושאפו החוצה את חיץ הכביסה. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת דיסוציאציה של תאים או CDS לכל באר ודגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד שבע דקות עד שהתאים יתעגלו.שאפו את ה-CDS ואספו את תרחיף התא לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. סובב את הצינור ב -1, 000 סל"ד במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא ב-1.2 מיליליטר של תווך Essential 8.יש לפזר 200 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת שש בארות מצופת מטריצה המכילה 1.5 מיליליטר של מדיום תרבית IPSC ו-10 מיקרומולר Y27632. לאחר 12 עד 24 שעות, הסירו את המדיום המשומש והוסיפו מדיום עלייה מלא שחומם מראש ללא 27632 יו' כדי לשמור על התרבויות. שנה את מדיום התרבות כל 24 שעות עד שהתרבויות מגיעות למפגש של 70 עד 80 אחוזים.ביום האפס, שאפו החוצה את מדיום תחזוקת ה- IPSC האנושי והוסיפו מדיום אינדוקציה התמיינות המכיל ננוגרם אחד למיליליטר BFGF וננוגרם אחד למיליליטר Noggin לצלחת שש הקידוחים. דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני. ביום הראשון, שאפו החוצה את המדיום המשומש והוסיפו מדיום אינדוקציה התמיינות המכיל ננוגרם אחד למיליליטר BFGF ו-10 ננוגרם למיליליטר נוגין.דוגרים שוב על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני. ביום השני והשלישי, מוציאים את המדיום המשומש ומוסיפים מדיום אינדוקציה בידול המכיל 10 ננוגרם למיליליטר נוגין. לאחר הוספת שני מיליליטר למדיום באר לצלחת בת שש בארות, דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני ומשנים את התווך כל 24 שעות.ביום הרביעי, להסיר את המדיום בילה ולהוסיף את מדיום התמיינות הרשתית או RDM. בצע את אותו הליך כדי להוסיף שני מיליליטר לכל בינוני באר צלחת שש בארות לדגור את התרביות. שנה את המדיום כל יום.בסביבות היום ה-14 וה-18, התבוננו בתרביות תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 להופעתם של תחומים דמויי רוזטה עצבית המורכבת מאבות מוקדמים של שדה העין. בסביבות היום ה-21 וה-28, התבוננו בתרביות תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 4 ו-10 כדי לצפות בהופעתם של EFPs נפרדים המאורגנים בעצמם עם אי מרכזי של מבנים נוירו-רשתית תלת-ממדיים מעגליים המוקפים בגידולים רציפים של אפיתל עצבי ואפיתל פני העין. לוקחים פיפטה סטרילית של פסטר ומחזיקים את הבסיס ביד אחת ואת קצה הנימים ביד השנייה.מעקרים ומחממים את האזור הסמוך לאמצע קצה הנימים בתנועות סיבוביות עד שהזכוכית הופכת גמישה. לאחר מכן התרחקו מהלהבה ומשכו במהירות את קצה הנימים החוצה כדי ליצור קצה נימי דק עם לומן סגור. החזיקו את הקצה הדק אופקית מול הלהבה והעבירו אותו במהירות דרך הלהבה בתנועה החוצה כדי ליצור וו חלק או קצה נימי בצורת L.תחת מיקרוסקופ סטריאו, בחר ידנית את גביעי הרשתית העצבית הבנויים היטב מה- EFPs הבודדים באמצעות אזור העקמומיות החיצוני החלק של וו הנימים ככף מדידה עדינה. בימים 25 ו-30, יש להוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום התמיינות רשתית שחומם מראש בצלחת 60 מ"מ בחיבור נמוך לתרבית ולשמור על גביעי רשתית לייצור אורגנואידים תלת-ממדיים ברשתית. יש לעשות זאת לפני קצירת גביעי הרשתית העצביים.הניחו מיקרופיפטה של מילימטר אחד כדי לשאוף 100 מיקרוליטר והשתמשו בקצוות מיקרו של מיליליטר אחד עם פתחים רחבים כדי לשאוף ולהעביר את כוסות הרשתית הצפות לצלחות התרבית הנמוכות והטריות שהוכנו קודם לכן. שמרו על גביעי הרשתית ב-RDM כתרביות תרחיף שאינן נצמדות ודגרו עליהן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני. בימים 30 ו -45, בעקבות שיטת הזנה חלקית, להסיר מחצית נפח של המדיום בילה ולהחליף אותו עם נפח שווה של מדיום טרי.ביום ה-45 וה-60, תרבית את אורגנואידי הרשתית למשך שבועיים נוספים ב-RDM המכיל 100 טאורין מיקרומולרי כדי לתמוך בהישרדות טובה יותר ובהתמיינות שושלת של אבות נוירו-רשתית ופיתוח סוגי תאי רשתית בוגרים. אורגנואידים ברשתית מאופיינים בשלבים שונים של הבשלה לביטוי של מספר סמני אב ברשתית באמצעות RT-PCR ואימונוהיסטוכימיה. תוצאות RT-PCR אישרו את ההשראות והביטוי של סמנים נוירו-רשתית באורגנואידים ברשתית בני חודש ואורגנואידים ברשתית בני חודשיים.התמונות הקונפוקליות של מקטעים מסומנים במערכת החיסון של אורגנואידים לא בשלים ברשתית המשתמשים בנוגדנים כנגד סמני האב של הרשתית העצבית Chx10, PAX6 ו-Otx2, ואורגנואידים בוגרים ברשתית המשתמשים בנוגדנים כנגד הסמנים המקדימים של קולטני האור מחלימים ו-CRX מוצגות כאן. השכבה החיצונית המסומנת ביותר של אורגנואידי הרשתית עם תאים קולטי אור מתמיינים מוגדלים ומוצגים בתמונות אלה. השלוחות הפנימיות הבסיסיות דמויות המקטע מסומנות בחצים לבנים.אשכולות EFP עם גביע הרשתית העצבית במרכז וגידולי RPE נודדים מראים פיגמנטציה לאורך הקצוות המובילים. גידולי אפיתל פיגמנטיים מובחנים היטב ממספר EFPs בכל רחבי האי נוירו רשתית מוצגים כאן. הגדלה גבוהה יותר של EFP מראה את אזור הנדידה של אבות RPE ואפיתל פני השטח של העין סביב גביע רשתית נוירו.תרביות דבק מורחבות שפיתחו מונושכבות של תאי RPE לא בשלים המכילים תאים פיגמנטיים ותאים שאינם פיגמנטים מוצגות כאן. תרביות חד-שכבתיות של תאי RPE בוגרים לחלוטין ופיגמנטים מראות מורפולוגיה מרוצפת ביום ה-60. תאי RPE המבטאים PAX6, MITF ו-RPE65 מוצגים באיור זה.תמונות אלה מייצגות EFPs עם צברים חריגים של אבות רשתית עם למינציה מעוותת וחוסר פסיעות. EFP עם גביע נוירו רשתית מיניאטורי, אך חסר את האזור שמסביב של RPE ואפיתל משטח העין מוצגים באיור זה. התמונה המייצגת מראה אגרגטים נוירו-רשתית לא סדירים שנוצרו בתרבית התרחיף.זה מאוד קריטי להתחיל את תהליך ההתמיינות באמצעות תרביות גידול כמעט משולבות של IPCs כדי להשיג אינדוקציה יעילה של שדות עיניים בתוך שלושה עד ארבעה שבועות. אורגנואידים ברשתית ותאי RPE הנוצרים מ- IPC נורמלי וספציפי למטופל יכולים לשמש כמודלים למחלות רשתית ולבדיקת תרופות טיפוליות חדשניות.

generation-retinal-organoids-from-healthy-retinal-disease-specific

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הייצור של תאים ברשתית מתמחה מתאי גזע pluripotent היא נקודת מפנה בהתפתחות מבוססי תאי גזע טיפול למחלות רשתית. המאמר הנוכחי מתאר שיטה פשוטה לדור יעיל של organoids ברשתית, אפיתל פיגמנט הרשתית למחקר בסיסי translational, קליניים.

קסנו נטולת מוגדר ותנאים מזין ללא תרבות לדגמי הדור של האדם נגזר iPSC רשתית תא

כאן אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב ליצירת אורגנואידים רשתית אנושיים בוגרים ומשתמשים בהם בבדיקת רעילות קולטני אור כדי לזהות מועמדים תרופתיים למחלת רשתית ניוונית הקשורה לגיל טלנגיאקטזיה מקולרית מסוג 2 (MacTel).

מסכי רעילות באורגנואידים ברשתית אנושית לגילוי תרופות

באמצעות שיטת התארגנות עצמית, אנו מפתחים פרוטוקול עם תוספת של COCO שיכול להגדיל באופן משמעותי את יצירת הפוטורצפטורים.

אינדוקציה מכוונת של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

כאן אנו מתארים מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית ממוטבת, אשר מתאימה קווי תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים שונים כדי ליצור רקמות רשתית עם רבייה ויעילות גבוהה.

מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית להפקה של רקמות רשתית תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מערכת אינדוקציה תלת-ממדית אופטימלית של הרשתית העצבית המפחיתה את ההידבקות והאיחוי של אורגנואידים ברשתית עם חזרתיות ויעילות גבוהות.

יצירת רשתית עצבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

תאי אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) שמקורם בתאי גזע עשויים לשמש ליישומים מרובים, כולל טיפולים מבוססי תאים לניוון רשתית, מידול מחלות ומחקרי תרופות. כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט להפקת RPE מתאי גזע.

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

מטרת דו"ח זה היא לתאר את הפרוטוקולים לגזור את האפיתל רשתית פיגמנט (RPE) מתאי גזע pluripotent מושרה (iPS) באמצעות גדלים שונים של גופי embryoid.

תאים (iPS) נובע רשתית פיגמנט האפיתל (RPE) מגזע המושרה pluripotent על ידי בגדלים שונים של גופי Embryoid

כתב יד זה מספק נוהל שלב אחר שלב לגזירה ותחזוקה של קרטינוציטים אנושיים משיער מרוט ויצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ללא אינטגרציה (hiPSCs) על ידי וקטורים אפיזומליים.

דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ​​ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

השיטה המוצגת כאן מתארת ​​בפועל ייצור מדרגים טובים (GMP) מערכת בידול -ready לייצר תאי hepatocyte דמוי אדם מתאי גזע פלוריפוטנטיים. היא משמשת חסכונית מערכת הסטנדרטית כדי לייצר תאי hepatocyte דמוי אדם למחקר כבד בסיסי ויישומי אדם.

מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש

למד שיטה יעילה להפקת אורגנואידים נוורטינליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. הפרוטוקול משלב תרביות דביקות ותלויות לאפיון מחלות רשתית ויישומים רגנרטיביים.

יצירת אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים בריאים וספציפיים למחלות רשתית הנגרמים על ידי בני אדם

גלה סרטונים נוספים