Name: הדמיית תאים חיים של גלובוסים שלמים של Ex Vivo באמצעות מחזיק חדשני מודפס בתלת-ממד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: למדו שיטת הדמיית תאים חיים ברזולוציה גבוהה של קרנית פצועה באמצעות מחזיק מודפס בתלת-ממד. פרוטוקול זה מאפשר מעקב בזמן אמת אחרי סיגנל סידן ונדידה תאית בגלובוסים שלמים ex vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות ל-NIH על תמיכת המענק הבאה: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) ו-5T32GM008541-24 (KS). ברצוננו להודות גם לקרן לחקר העיניים של אריות מסצ'וסטס ולקרן השתלות הקרנית של ניו אינגלנד.

ההליכים המערבים נבדקים מן החי אושרו על ידי האגודה למחקר בראייה ורפואת עיניים לשימוש בבעלי חיים בטיפול עיניים ומחקר ראייה ופרוטוקול IACUC של אוניברסיטת בוסטון (201800302).
1. עיצוב המחזיקים ופס העטיפה המודפסים בתלת מימד
<ol><li>עצב את המחזיקים המודפסים בתלת-ממד ואת פס הכיסוי תוך התחשבות בקוטר הממוצע של גלובוסים של עכברים, והדפס את העיצוב בתלת-ממד (איור 1A, B).</li>
	<li>שמור על קוטר הדופן הפנימית של המחזיק מעט גדול יותר מהקוטר הממוצע של כדור הארץ כדי לקחת בחשבון את הגדלים השונים של עכברים בודדים. שמור על גובה המחזיק בכמחצית מקוטר הגלובוס, והבטח התאמה הדוקה של הגלובוס כאשר הוא מאובטח על-ידי פס הכיסוי המודפס בתלת-ממד.</li>
	<li>הגדילו את מכסה המחזיק לאורך הקוטר החיצוני של המחזיק ברוחב של 1/4 עד 1/2 מקוטר המחזיק. מוט הכיסוי הוא בגודל המאפשר גישה לגלובוס כאשר הוא מאובטח במחזיק לצורך הידרציה והסרת העין בסיום הניסוי.</li>
	<li>הדפס את המחזיק ואת פס הכיסוי.</li>
</ol>2. איסוף דגימות
<ol><li>עכברי המתת חסד (עכברים זכרים C57BL/6 בגילאי 9-12 שבועות ו-27 שבועות שימשו למחקר זה) תוך שימוש בפרוטוקולים מבוססים בהתאם להנחיות המוסדיות. עבור פרוטוקול זה, לבצע המתת חסד עם פחמן דו חמצני ואחריו עריפת ראש.</li>
	<li>הסר את ראש העכבר והנח אותו מיד על קרח כדי לשמור על הכדאיות של הרקמה. ניתן לנטרל את הגלובוסים באמצעות כלי דיסקציה תוך מניעת נזק לרקמות.</li>
	<li>פרופטוז את כדור הארץ באמצעות פינצטה. גזור את עצב הראייה באמצעות מספריים לנתיחה ממש מתחת למקום שבו הוא מוחזק על ידי הפינצטה. הערה: לאמצעי זהירות נוספים, בצע את השלבים הבאים במכסה מנוע של זרימה למינרית.</li>
	<li>לדגום את הגלובוסים ב-2 מ"ל של מדיום בצלחת תרבית תאים p35 כולל מחוון סידן ו/או כתם קרום התא במשך שעה אחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בתנאי תאורה נמוכים. יש לוודא שהגלובוסים שקועים במדיום הכתמים לקבלת צביעה אחידה.<ol><li>עבור הניסויים שבוצעו כאן, השתמש במחוון הסידן, Fluo4-AM (1:100)2, וכתם נגדי של קרום התא, כתם קרום פלזמה אדום עמוק (1:10,000)2, עם ריכוז סופי של 1% (v/v) DMSO ו-0.1% (w/v) חומצה פלורונית ב-2 מ"ל של מדיום נטול סרום קרטינוציטים (KSFM) עם תוספי הצמיחה הבאים: 25 מיקרוגרם/מ"ל תמצית יותרת המוח של בקר, גורם גדילה אפידרמלי 0.02 ננומטר, 0.3 mM CaCl2, ופניצילין-סטרפטומיצין (100 יחידות/מ"ל ו-100 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה). הערה: תנאי הדגירה וזמני הדגירה משתנים בהתאם למחוון הסידן, סוג הרקמה ונפח הדגימה. בעת שימוש בחומצה פלורונית, מומלץ להיזהר מכיוון שהיא הופכת את הרקמה לחדירה. פרוטוקול זה דורש 10% חומצה פלורונית. ריכוזים נמוכים יותר של חומצה פלורונית נקבעו בניסוי כלא יעילים, וריכוזים גבוהים יותר מסתכנים בנזק לרקמה.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הכנת מחזיקי המדגם
<ol><li>הדביקו את המחזיקים לכיסוי תחתון זכוכית נקי עם דבק שלא נעשה בו שימוש בעבר. הדבק המשמש בפרוטוקול זה מגיע ממיכלים חד-פעמיים כדי להבטיח סטריליות ומכל חדש שלא נפתח משמש בכל פעם.</li>
	<li>שטפו את המחזיק ב-70% אתנול. הניחו דבק על המחזיק והדביקו את המחזיק למכסה התחתון של הזכוכית. ודא שאין דבק נמצא באזור הפנימי של המחזיק מכיוון שדבק יכול פלואורסצנטי, מה שמסבך את ההדמיה.</li>
	<li>המתן עד שהדבק יתמצק. ודא שהמחזיק מאובטח מפני הכיסוי. הערה: לוחות תאים P35 עם כיסויים עם תחתית זכוכית שימשו לניסויים שהוצגו בכתב יד זה. ניתן להחליף שקופיות ו/או לוחות אחרים עם תחתית זכוכית בהתאם לצרכי הניסוי.</li>
</ol>4. פצע של גלובוסים בעין
<ol><li>הסר את הגלובוסים מתמיסת הכתם באמצעות טפטפות עיניים סטריליות, תוך הקפדה על מניעת נזק לרקמות באזור העניין. שוטפים את הגלובוסים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות מי מלח סטריליים עם אגירת פוספטים להסרת כתמים עודפים, ומניחים את הגלובוסים בתווך להובלה למיקרוסקופ.</li>
	<li>פצעו את הגלובוסים באמצעות מחט סטרילית של 25 גרם באזור העניין.<ol><li>באמצעות טפטפת עיניים סטרילית, הרימו והחזיקו את כדור הארץ מהחלק האחורי של העין. זה ישמור על יציבות הגלובוס, ימנע ממנו להתגלגל ויאפשר ליצור פצעים עקביים. באמצעות מערך זה, עצב הראייה יהיה בתוך פיית טפטפת העין, והקרנית תהיה פונה החוצה.</li>
		<li>לפצע שריטה, העבירו בעדינות מחט סטרילית של 25 גרם על פני הקרנית החשופה. לפצע ניקוב, יש ללחוץ בעדינות את המחט ישירות לתוך הקרנית המרכזית. ודא שהפצע אינו מנקב את הקרנית. הערה: דלג על שלב זה אם אין צורך בתגובת פצע או בסביבה פצועה לצורך הניסוי. מחקרים קודמים הראו כי גם פצעי שריטה וגם פצעי ניקוב בקרניות מורין המיוצרים בשיטה זו עקביים הן בקוטר והן בעומק10. אישור מידות הפצע בין גלובוסים עצמאיים בוצע באמצעות ניתוח אזור עניין.</li>
	</ol></li>
</ol>5. מיקום המדגם על המחזיק
<ol><li>הניחו את אזור הקרנית או האזור הלימבולי על הכיסוי באזור הפנימי של המחזיק והתייצבו באמצעות הכיסוי המודפס בתלת-ממד (איור 1C-H).</li>
	<li>ודא כי הגלובוס ממוקם כראוי וכי אתר העניין נמצא במגע עם מכסה הזכוכית. לאחר שהגלובוס הוכנס למחזיק, אל תנסה להסיר את הגלובוס מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לרקמות.</li>
	<li>הדביקו את העטיפה המודפסת בתלת-ממד למחזיק באמצעות דבק, כדי להבטיח ייצוב. ודא שפס הכיסוי נצמד למחזיק ולא לגלובוס. הערה: האזור שיש להצטלם ממוקם למטה מכיוון שהפרוטוקול נכתב לשימוש במיקרוסקופ הפוך. ניתן להתאים את הפרוטוקול למיקרוסקופים זקופים באמצעות מחזיקים בעלי רדיוס פנימי קטן יותר והסרת מוט הכיסוי. התוצאה תהיה פחות ייצוב כדור הארץ.</li>
</ol>6. הדמיה לדוגמה
<ol><li>הפעל את המיקרוסקופ ואת התא הסביבתי וודא שהתא לח. הגדר את התא הסביבתי ל-35 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך הניסוי. הערה: מיקרוסקופים עם תאים סביבתיים עדיפים להליך זה כדי למנוע התייבשות ולשמור על כדור הארץ בטמפרטורות אופטימליות אך אינם נדרשים.</li>
	<li>הניחו את הכיסוי, המחזיק והגלובוס המיוצב על במת המיקרוסקופ בתוך התא הסביבתי והתמונה באמצעות טכניקות הדמיה של תאים חיים9.</li>
	<li>יש לטפטף מדיית צמיחה נוספת על הכיסוי כדי למנוע התייבשות ולשמור על כדאיות הרקמות. ודא שיש מספיק מדיום בבאר כדי לכסות את הגלובוס במחזיק. בהתאם למשך ההדמיה, יש להוסיף מדיום טרי בעת הצורך לאורך כל הניסוי.</li>
	<li>התחל בניסויים באמצעות טכניקות ופרוטוקולים של הדמיית תאים חיים. השתמש בהגדרות לייזר בהספק נמוך כדי לשמר את הרקמה ולמנוע נזק לרקמות בניסויים ממושכים. השתמש במטרות מתאימות למרחקי עבודה ארוכים. הניסויים בכתב יד זה בוצעו באמצעות מטרה של פי 20. הערה: כוח הלייזר וההגברה, משך הניסוי, המיקום ומישור ההדמיה הם כולם משתנים בהתאם לפרמטרים הניסוייים. ניסויי הדמיה על גלובוסים שלמים שאורכם נע בין שעה ל-4 שעות בוצעו בהצלחה בפרסומים קודמים10.</li>
	<li>הקלט ושמור נתונים בתבנית הקובץ המועדפת. התוכנה המשמשת את המיקרוסקופ מייצרת קבצי .czi להקלטת נתונים.</li>
	<li>יש להשליך את הגלובוסים בהתאם לפרוטוקולים המוסדיים הסטנדרטיים בסוף הפרוטוקול.</li>
</ol>

<ol><li>Kneer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+induces+pre-type+2+diabetes+with+regional+changes+in+corneal+sensory+nerves+and+altered+P2X7+expression+and+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization.</a> Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Ca2%2B+mobilizations%3A+A+quantitative+approach+to+predict+their+importance+in+cell-cell+communication+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing.</a> PLoS One. 14 (4), 0213422(2019).</li>
<li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li>
<li>Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+but+not+gap+junctions+play+a+role+in+injury-induced+Ca2%2B+waves+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+changes+in+Ca%282%2B%29+mobilization+and+protein+phosphorylation+implicated+in+impaired+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).</li>
<li>Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y2+receptor+mediates+the+epithelial+injury+response+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).</li>
<li>Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+of+global+neuronal+states+in+Caenorhabditis+elegans+under+isoflurane+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia.</a> Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).</li>
<li>Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73(2018).</li>
<li>Rhodes, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pannexin1%3A+Role+as+a+sensor+to+injury+is+attenuated+in+pretype+2+corneal+diabetic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Cellular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium.</a> Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338(2021).</li>
<li>Segars, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+dependent+changes+in+corneal+epithelial+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721(2022).</li>
<li>Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+epithelial+and+stromal+corneal+stiffness+occur+with+age+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity.</a> Bioengineering. 7 (1), 14(2020).</li>
<li>Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinoreceptor+P2X7+regulation+of+Ca%282%2B%29+mobilization+and+cytoskeletal+rearrangement+is+required+for+corneal+reepithelialization+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury.</a> The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).</li>
<li>Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+euthanasia+and+enucleation+on+mouse+corneal+epithelial+axon+density+and+nerve+terminal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology.</a> The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).</li>
</ol>

אין לנו ניגודי עניינים לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה של תאים חיים המשתמשת במחזיק מודפס בתלת-ממד כדי לייצב ולשתק עיניים שלמות של בעלי חיים. הוא נועד לעקוף מספר חסרונות משמעותיים המוכרים בפרוטוקולי הדמיה קודמים של תאים חיים של רקמת קרנית ex vivo . פרוטוקול זה מציע יתרונות רבים להדמיית תאים חיים של גלובוסים שלמים. הוא מפחית באופן משמעותי נזק מיותר לרקמות שעלול להפריע לתגובת ריפוי הפצע לפצעי שריטה שנגרמו בניסוי. זה כולל פגיעה בעצבים ובאפיתל כתוצאה מדיסקציה וחשיפה לאור UV. יתר על כן, פרוטוקול זה מקל על הידרציה וכדאיות של רקמות על ידי שיתוק...

קרנית הקרנית היא מבנה שקוף ואווסקולרי המכסה את המשטח הקדמי של העין אשר שובר את האור כדי לאפשר ראייה ומגן על פנים העין מפני נזק. מכיוון שהקרנית חשופה לסביבה, היא רגישה לנזקים הן מסיבות מכניות (גירוד) והן מזיהום. פגיעה בקרנית אצל חולה בריא בדרך כלל מחלימה תוך 1-3 ימים. עם זאת, בחולים עם מחלות רקע, כולל מחסור בתאי גזע לימבליים וסוכרת מסוג II, תהליך הריפוי של פצעי הקרנית יכול להיות ממושך מאוד1. מכיוון שהקרנית מאוד מופנמת, כיבים אלה שאינם מרפאים את הקרנית ושחיקות חוזרות ונשנות של הקרנית כואבים מאוד ופוגעים מאוד באיכות החיים של המטופלים החווים אותם1.
איתות תאי כאשר קרנית בריאה נפגעת, אירועי איתות סידן בתאים הסמוכים לפצע מקדימים וגורמים לנדידה תאית לתוך מיטת הפצע, שם הם סוגרים את הפציעה ללא סיכון של הצטלקות 2,3. אירועי איתות אלה אופיינו היטב במודלים של תרביות תאי אפיתל בקרנית באמצעות הדמיית תאים חיים2. ניסויים ראשוניים הדגימו איתות סידן גבוה יותר באופן משמעותי לאחר פציעה בתאים שאינם סוכרתיים בהשוואה לתאים סוכרתיים. עם זאת, אפיון אירועי האיתות הסלולרי בגלובוסים ex vivo התגלה כאתגר טכני.
הדמיית תאים חיים מחקרים קודמים תיעדו בהצלחה אירועי איתות סידן ממודלים של תרביות תאים במבחנה של ריפוי פצעי בקרנית 4,5,6. פיתוח מתודולוגיה להפקת תמונות באיכות גבוהה של אירועי איתות אלה ברקמת ex vivo הוא עניין רב מכיוון שהוא יאפשר לחקור אירועים אלה במערכת מורכבת ונאמנה יותר לחיים. גישות קודמות כללו כריתה של הקרנית ואחריה אימוביליזציה בג'ל PEGהמושרה על ידי UV 7,8,9. אימוביליזציה היא צעד חיוני אך מאתגר בעבודה עם רקמות חיות, מכיוון שהיא חייבת להישאר בת קיימא ולחות לאורך כל הניסוי. יתר על כן, אסור שאימוביליזציה תפגע ברקמה. בעוד שתמיסת PEG שיתקה את הרקמה, הרזולוציה והאיכות של התמונות שהופקו לא היו עקביות. לכן, מחזיקי הדפסה בתלת-ממד פותחו כדי לשתק גלובוסים שלמים כדי להפיק תמונות באיכות גבוהה יותר עם פחות סיכון לנזק לרקמות.
הגישה מחזיק ייחודי המודפס בתלת-ממד פותח כדי לשתק גלובוסים שלמים של ex vivo להדמיית תאים חיים. מחזיק זה מונע נזק משני מקורות עיקריים: הוא מאפשר הדמיה של כדור הארץ ללא צורך לנתח את הקרנית, והוא מבטל את החשיפה לאור UV. ללא מקורות נזק אלה, התמונות שהתקבלו ייצגו בצורה מדויקת יותר את התגובה לפציעות השריטות שנעשו בניסוי. יתר על כן, המחזיק שהודפס בתלת-ממד כויל לממדים המדויקים של עין המורין. זה סיפק התאמה טובה בהרבה מאשר אימוביליזציה בפתרון PEG, מה שהוביל לתמונה באיכות גבוהה יותר ביעדים בעלי עוצמה נמוכה יותר עקב ירידה בתנועת הרקמות. פס כיסוי המחובר לחלק העליון של המחזיק מבטיח כי הגלובוס נשאר ללא תנועה לאורך כל משך הניסוי וכי אין תזוזה של הגלובוס כאשר מדיית הצמיחה מוחלת כדי לשמור על הידרציה וכדאיות. היכולת להדפיס את המחזיק למידות מדויקות מאפשרת לנו גם לייצר התאמה אופטימלית לעיניים מורין בגדלים שונים בשל הגיל או מצב המחלה. טכנולוגיה זו יכולה להיות מיושמת באופן רחב יותר כדי לפתח מחזיקים לעיניים של מינים שונים בהתבסס על מידותיהם.

<table><tbody><tr><td>1.75 חומצה פולילקטית כחולה (PLA) פלסטיק</td><td>Creality (שנזן, סין)</td> <td>N/A</td><td>חומר למחזיק</td></tr><tr><td>צלחת 35 מ"מ, מס' 1.5 כיסוי, קוטר זכוכית 14 מ"מ, מצופה פולי-D-ליזין</td><td>MatTek Corporation (אשלנד, MA)</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td>היטב להדמיה.&nbsp;</td></tr><tr><td>תוכנת Autodesk Fusion 360</td><td>Autodesk (סן רפאל, קליפורניה).</td><td>תוכנה</td><td>המשמשת להדפסת המחזיקים.</td></tr><tr><td>BD 25 G 7/8 מחטים סטריליות לשימוש חד פעמי 100 מחטים/קופסה</td><td>Thermo Fisher Scientific (וולת'אם, MA)</td><td>305124</td><td>לפצעים המושרים בניסוי לגלובוס</td></tr><tr><td>CellMask DeepRed</td><td>Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה)</td><td>C10046</td><td>כתם נגד קרום התא. מחוון סידן. ריכוז 1:10,000 עם ריכוז סופי של 1% (v/v) DMSO ו-0.1% (w/v) חומצה פלורונית</td></tr><tr><td>Complete Home Super Glue</td><td>Walgreens (Deerfield, IL)</td><td>N/A</td><td>לחיבור המחזיק לבאר ההדמיה</td></tr><tr><td>מדפסת תלת מימד Ender 3 Pro&nbsp;</td><td>Creality (שנזן, סין)</td><td>N/A</td><td>להדפסת המחזיק</td></tr><tr><td>FIJI/ImageJ</td><td>ImageJ (Bethesda, MD)</td><td>מספר רישיון: GPL2</td><td>תוכנה המשמשת לאישור עקביות של עומק וקוטר הפצע בין גלובוס עצמאי באמצעות ניתוח אזור עניין</td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>F14201</td><td>מחוון סידן. ריכוז 1:100 עם ריכוז סופי של 1% (v/v) DMSO ו-0.1% (w/v) חומצה פלורונית</td></tr><tr><td>ג'יבקו בינוני ללא קרטינוציטים</td><td>(וולת'ם, מסצ'וסטס 17005042</td><td></td> <td>25 מ"ג/מ"ל תמצית יותרת המוח בקר, 0.02 ננומטר EGF, 0.3 מ"מ CaCl<תת>2</תת>, ופניצילין-סטרפטומיצין (100 יחידות/מ"ל, 100 ומיקרו; g/mL, בהתאמה) נוסף</td></tr><tr><td>ל-Phophate-Buffered Saline בינוני (PBS)</td><td>Corning, Medlabtech (Manassas, VA)</td><td>21-040-CV</td><td>שימש לשטיפת כתם עודף מהקרניות לפני הדמיית</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Zeiss Confocal 880 עם AiryScan</td><td>Zeiss (Thornwood, NY)</td><td>N/A</td> נעשה <td>שימוש במטרת הגדלה של פי 20</td></tr></tbody></table>

הדמיית תאים חיים של גלובוסים שלמים של ex vivo באמצעות מחזיק חדשני מודפס בתלת-ממד

Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder

ריפוי פצעי אפיתל בקרנית הוא תהליך נדידה היזום על ידי הפעלת קולטנים פורינרגיים המתבטאים בתאי אפיתל. הפעלה זו גורמת לאירועי גיוס סידן המתפשטים מתא לתא, החיוניים לייזום תנועתיות תאית לתוך מיטת הפצע, ומקדמים ריפוי פצעים יעיל. מעבדת טרינקאוס-רנדל פיתחה מתודולוגיה להדמיית תגובת ריפוי פצעי הקרנית בגלובוסים ex vivo murine בזמן אמת. גישה זו כוללת הרטבת גלובוס שלם מעכבר שעבר המתת חסד על פי פרוטוקולים שנקבעו ומיד דגירה של כדור הארץ באמצעות צבע מחוון סידן. בשלב זה ניתן ליישם כתם נגדי שמכתים תכונות אחרות של התא כדי לסייע בהדמיה ולהראות ציוני דרך תאיים. הפרוטוקול עבד היטב עם מספר צבעים שונים של תאים חיים המשמשים להכתמה נגדית, כולל אקטין SiR לצביעת אקטין וכתם קרום פלזמה אדום עמוק כדי להכתים את קרום התא. כדי לבחון את התגובה לפצע, אפיתל הקרנית נפגע באמצעות מחט 25 גרם, והגלובוסים ממוקמים במחזיק מודפס בתלת מימד. הממדים של המחזיק המודפס בתלת-ממד מכוילים כדי להבטיח אימוביליזציה של כדור הארץ לאורך כל משך הניסוי, וניתן לשנותם כך שיתאימו לעיניים בגדלים שונים. הדמיית תאים חיים של תגובת הפצע מבוצעת באופן רציף בעומקים שונים ברחבי הרקמה לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. פרוטוקול זה מאפשר לנו להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה ובאיכות פרסום באמצעות מטרה אווירית של פי 20 במיקרוסקופ קונפוקלי. מטרות אחרות יכולות לשמש גם עבור פרוטוקול זה. הוא מייצג שיפור משמעותי באיכות הדמיית התאים החיים בגלובוסים ex vivo murine ומאפשר זיהוי של עצבים ואפיתל.

פרוטוקול זה שימש להפקה עקבית של נתונים ותמונות באיכות פרסום10. התמונות המתקבלות מייצגות שיפור משמעותי בהשוואה לגישות קודמות (איור 2). באמצעות המחזיק המודפס בתלת-ממד, ניתן לצלם תמונות לאורך שכבות הקרנית, וניתן לצפות בגיוס סידן במישורי z שונים (איור 3). גישה זו שימשה להשוואת איתות תאי בין שכבות תאי apical ו- basal בפצע בעכברים צעירים ומבוגרים10.
היציבות המשופרת אפשרה גם הדמיה של גלובוסים ל...

העבודה הנוכחית מתארת פרוטוקול ניסיוני חדשני המשתמש במחזיק מודפס בתלת-ממד כדי לאפשר הדמיית תאים חיים ברזולוציה גבוהה של גלובוסים דחוסים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לצפות בפעילות איתות הסידן התאי באפיתל קרנית פצועה מגלובוסים ex vivo בזמן אמת.

הדמיית תאים חיים של גלובוסים שלמים של Ex Vivo באמצעות מחזיק חדשני מודפס בתלת-ממד

Corneal epithelial wound healing is a migratory process initiated by the activation of purinergic receptors expressed on epithelial cells. This activation ...

המחזיק המודפס בתלת-ממד המשמש בפרוטוקול זה מאפשר לנו לעקוב אחר איתות תאי לטווח קצר ואירועי נדידה סלולרית ארוכת טווח בקרניות פצועות בזמן אמת. על ידי שמירה על כדור הארץ שלם, בר קיימא וחסר תנועה, פרוטוקול זה מפיק תמונות חיות באיכות גבוהה של תאי הקרנית, כולל האפיתל והעצבים. ניתן היה לשנות בקלות את המחזיק המודפס בתלת-ממד עבור גלובוסים בגדלים ומינים שונים.אנו יכולים גם לכוון את העיניים באופן שונה לתמונה של אזורים אחרים או לבצע ניסויי כניסת ננו. כדי להתחיל, לאחר הסרת ראשו של עכבר מורדם, הנח אותו מיד על הקרח כדי לשמור על הכדאיות של הרקמה. לאחר מכן עטפו את הגלובוסים על ידי הנמנמתו, באמצעות פינצטה.ולקצץ את עצב הראייה באמצעות מספריים דיסקציה ממש מתחת למקום שבו הוא מוחזק על ידי פינצטה. דגירה של הגלובוסים בשני מיליליטרים של המדיום בצלחת תרבית תאים P-35, כולל מחוון סידן ו/או כתם קרום התא למשך שעה אחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני בתנאי תאורה נמוכים, כדי להבטיח שהגלובוסים יהיו שקועים במדיום הכתמים להכתמה אחידה. כדי להדביק את המחזיקים לכיסוי תחתון נקי מזכוכית, שטפו את המחזיק ב-70% אתנול והניחו דבק על המחזיק.לאחר מכן, הדביקו את המחזיק לכיסוי התחתון של הזכוכית, וודאו שאין דבק באזור הפנימי של המחזיק, שכן דבק יכול להתנפץ, מה שמסבך את ההדמיה. לאחר שהדבק מתמצק, ודא שהמחזיק מאובטח מפני תלוש הכיסוי. הסר את הגלובוסים מתמיסת הכתם באמצעות טפטפות סטריליות, תוך הקפדה על מניעת נזק לרקמות באזור העניין.שוטפים את הגלובוסים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, תוך שימוש במלח זרחתי סטרילי כדי להסיר כתמים עודפים ולהניח את הגלובוסים בתווך להובלה למיקרוסקופ. כדי לפצוע את הגלובוסים באמצעות מחט סטרילית של 25 מד באזור העניין, הרימו והחזיקו את הגלובוס מהחלק האחורי של העין, באמצעות טפטפת סטרילית כדי לשמור על יציבות הגלובוס ולמנוע ממנו להתגלגל. עבור פצע שריטה, יש להזיז בעדינות מחט סטרילית בגודל 25 מד על פני הקרנית החשופה או ללחוץ בעדינות את המחט ישירות לתוך הקרנית המרכזית לפצע ניקוב, כדי להבטיח שהפצע לא יחדור את קרום מרתף הקרנית.מניחים את אזור הקרנית או הלימבל על מחליק הכיסוי באזור הפנימי של המחזיק, תוך אישור שהגלובוס ממוקם כראוי ושאתר העניין נמצא במגע עם כיסוי הזכוכית. ייצוב באמצעות הכיסוי המודפס בתלת-ממד המודבק למחזיק, באמצעות דבק. ואל תנסה להסיר את כדור הארץ, שכן זה עלול לגרום נזק לרקמות.הפעילו את המיקרוסקופ וקבעו את התא הסביבתי ל-35 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני וודאו את התא הלח. הניחו את מחזיק הכיסוי ואת הגלובוס המיוצב על במת המיקרוסקופ בתוך התא והתמונה הסביבתית, תוך שימוש בטכניקות הדמיה של תאים חיים. על ידי בדיקה של מדיית גידול נוספת על גבי הכיסוי כדי למנוע התייבשות ולשמור על כדאיות הרקמות, ולהבטיח שיש מספיק מדיום בבאר כדי לכסות את כדור הארץ במחזיק.התחל ניסויים באמצעות טכניקות הדמיה של תאים חיים, תוך שימוש בהגדרות לייזר בהספק נמוך כדי לשמר את הרקמה ולמנוע נזק לרקמות ומטרות מתאימות לניסויים ממושכים. הקלט ושמור נתונים בתבנית הקובץ המועדפת של קבצי CZI להקלטת נתונים. נתוני הדמיה באיכות גבוהה של מבנה רב-שכבתי התקבלו עבור קרנית X vivo, מיוצבת באמצעות מחזיק מודפס בתלת-ממד, המדגימה אירועי איתות סידן בשכבות האפיקליות, הבסיסיות והסטרומליות של הקרנית.תמונות Z-stack של קרנית, משותקת במחזיק המודפס בתלת-ממד, בפצע שריטה, התקבלו כדי להמחיש את קרומי התאים ואת איתות הסידן לאורך שכבות הקרנית וגיוס הסידן במישורי Z שונים. ניסוי בסדרת זמן של קרנית בוצע כדי לחקור את נדידת התאים לתוך מיטת הפצע במהלך תגובת הריפוי, וחשף תנועה מועטה של כדור הארץ בכיווני X, Y או Z. זה היה ציין כי על ידי הצבת כדור הארץ במחזיק, אזורים שונים של הקרנית, הן במרכז והן באזור הלימבל הקרנית ניתן לדמיין.פרוטוקול זה מאפשר לנו לדמות עיניים ממודלים של מחלות המציגות הבדלים בריפוי פצעים. אנו יכולים לאפיין סטיות באיתות התא ותנועתיות ברקמה חיה.

live-cell-imaging-intact-ex-vivo-globes-using-novel-3d-printed

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

תהליכים תאיים כגון נדידת תאים מסורתי נחקרו על דו מימדי, משטחי פלסטיק נוקשה. דו"ח זה מתאר טכניקה ישירות חזותי לוקליזציה חלבון וניתוח הדינמיקה חלבון בתאי נודדות בתוך מטריצה ​​יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית תלת מימדי,.

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

הרקמה העוברית הדמיה בזמן אמת הוא מאתגר לאורך תקופות זמן ארוכות. כאן אנו מציגים assay לניטור שינויים הסלולר משנה הסלולר בחוט השדרה חומוס לתקופות ארוכות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. טכניקה זו יכולה להיות מותאם לאזורים אחרים של מערכת העצבים בעובר המתפתח.

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

אנו מתארים את הנתיחה וvivo התרבות לשעבר של עור העוברי של עכבר. מערכת התרבות שומרת על ממשק אוויר נוזלי על פני השטח של הרקמות ומאפשרת הדמיה במיקרוסקופ הפוכה. Melanoblasts, רכיב של העור מתפתח, שכותרתו fluorescently המאפשרת את התנהגותם כדי להיות שנצפתה באמצעות מיקרוסקופ confocal.

אקס תרבות Vivo של עור העכבר עוברי וLive-הדמיה של הגירת Melanoblast

הטבע של האינטראקציות בין תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs) ונישות מח עצם הוא הבין היטב. שינויי חומרה מותאם אישית ופרוטוקול רכישה רב שלבים לאפשר את השימוש בשני הפוטונים ומיקרוסקופיה confocal לתמונת vivo לשעבר HSPCs שכותרתו התביית בתוך אזורי מוח עצם, אינטראקציות מעקב ותנועה.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

אנו מדווחים על מכשיר שיטה חדשה ללמוד תאי עוברים. תאים בודדים מסודרים דווקא מערכי microcavity. כליאת 3D שלהם היא צעד לקראת סביבות 3D נתקלו בתנאים פיסיולוגיים מאפשרת התמצאות אברון. על ידי שליטת צורת תא, התקנה זו ממזערת השתנות שדווחה מבחני תקן.

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

אנו מציגים הליך לשליטה אשכול תא ראשוני הצורה מטריצה חוץ-תאית תלת-ממד כדי לקבל צורה דפוס הדיר. מכשיר מעוקב המכיל שני hydrogels שונים הוא מועסק כדי להשיג הדמיה רב כיוונית עבור צורה דפוס רקמות.

שליטה אשכול הראשונית תא 3D היברידית ג'ל קוביה התקן עבור תצורות דפוס הדיר

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במי חמצן מקודד גנטית (H2O2)-biosensor בנוירונים זברה בתרבית וזחלים להערכת תפקידי האיתות הפיזיולוגיים של H2O2 במהלך התפתחות מערכת העצבים. זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים שונים ושונה עם טיפולים ניסיוניים לחקור מינים חמצן תגובתי (ROS) בפיתוח כללי.

ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתרבית והדמיית עוברי עכבר המאפשר הדמיה תלת ממדית + זמן של תאי אב לבביים. ערכת כלי וידאו זו מתייחסת למיומנויות המפתח הנדרשות להדמיה חיה מוצלחת שאחרת קשה לרכוש מפרסומים של טקסט בלבד.

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

עוברי אפרוחים משמשים לחקר גידולי מוח מסוג גליובלסטומה אנושית (GBM) בתרביות משותפות של פרוסות מוח ב-ovo וב-ex vivo. ניתן לתעד התנהגות תאי GBM במיקרוסקופ בהילוך מהיר בתרביות משותפות ex vivo, וניתן לנתח את שני התכשירים בנקודת הקצה של הניסוי על ידי ניתוח קונפוקלי תלת-ממדי מפורט.

שימוש במוח עובר אפרוח כמודל לניתוחי In Vivo ו - Ex Vivo של התנהגות תאי גליובלסטומה אנושיים

למדו שיטת הדמיית תאים חיים ברזולוציה גבוהה של קרנית פצועה באמצעות מחזיק מודפס בתלת-ממד. פרוטוקול זה מאפשר מעקב בזמן אמת אחרי סיגנל סידן ונדידה תאית בגלובוסים שלמים ex vivo.

הדמיית תאים חיים של גלובוסים שלמים של Ex Vivo באמצעות מחזיק חדשני מודפס בתלת-ממד

גלה סרטונים נוספים