איסוף דינמי בזמן אמת של נוזל חוץ-תאי בהיפוקמפוס מחולדות מודעות באמצעות מערכת מיקרודיאליזה
21 באוקטובר 2022
הפרוטוקול כאן מספק דגימה דינמית מפורטת בזמן אמת של נוזל חוץ-תאי מההיפוקמפוס של חולדות ערות באמצעות מערכת מיקרודיאליזה.
נוזל חוץ-תאי בהיפוקמפוס וצפיפות על ידי מיקרודיאליזה במוח טכניקה תורמת לניטור מיקרו ספציפי למחלה של מחלות עצבים מרכזיות. מיקרודיאליזה מוחית טכנית משיגה דינמיות וחקירה מתמשכת של נוזל מוח אינטרסטיציאלי באזורי מוח ספציפיים של חולדות לא מורדמות. התחילו בקיבוע החולדה המורדמת על מאתר מוח סטריאוטקסי ונגבו את אזור הניתוח המגולח עם פוד פובידון ומקלון אתנול שלוש פעמים לפני הניתוח.
לאחר מכן בצע חתך פנים גולגולתי של 1.5 ס"מ באמצע עם מספריים כירורגיים והסר את הפריאוסטאום באמצעות מספריים כירורגיים ומלקחיים אופתלמיים. בהתחשב בברגמה כמיקום הבסיסי, באמצעות מקדח גולגולתי חודר את האנדוקרניום כדי לקדוח צמצם של שני מילימטר באזור CA1 בהיפוקמפוס. כעת תקנו את סטילט הצנתר על ידית האחיזה של מאתר מוח סטריאוטקסי והתאימו את מיקום מעטפת המיקרודיאליזה במיקום הקדמי, הבינוני והגחוני הגבי.
כוונן את המסתם הדורסו-ונטרלי של מאתר הסטריאו במוח והשתיל את מעטפת המיקרודיאליזה באזור CA1 בעומק של 3.5 מילימטרים. קדח שלושה פתחים נוספים בקוטר שני מילימטר כך ששלושת הצמצמים יוצרים משולש שבו צמצם הגשושית ממוקם במרכז. השתל ברגים לתוך הצמצמים בעומק של מילימטר אחד ולקבע את קטטר הבדיקה עם מלט דנטלי.
לאחר מכן השתמש בתפר כירורגי 4-O כדי לסגור את העור. חבר את המיקרומזרק של משאבת המיקרודיאליזה למכשיר פעילות ערה ACSF ולאוסף דגימות קריוגניות בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, כדי לפרוק את האוויר בצנרת, להגדיר את משאבת מיקרודיאליזה בקצב של מיקרוליטר אחד לדקה.
לאחר מכן חברו את הצינור ואת בדיקת המיקרודיאליזה במוח והפעילו את משאבת המיקרודיאליזה בקצב של מיקרוליטר אחד לדקה כדי להזריק ACSF לתוך הבדיקה עד שפני השטח של הבדיקה לחים מעט. לטבול את הבדיקה בתמיסת הזרקת נתרן הפרין לשימוש לאחר מכן. כדי לאסוף את HECF מהחולדה הערה, הכניסו את בדיקת המיקרודיאליזה של המוח לתוך צנתר הבדיקה והניחו את החולדה בחדר עם ריפוד כדי להבטיח שהחולדות חופשיות לנוע.
הפעל את בקר הסיבוב הרב-ערוצי כדי למנוע שזירה של צינורות המיקרודיאליזה במהלך התנועה החופשית של החולדה. לאחר מכן הפעל את משאבת המיקרומזרק ושאב את ACSF בקצב של מיקרוליטר אחד לדקה. לאחר שיווי משקל של 60 דקות של מערכת איסוף HECF מיקרודיאליזה, לאסוף HECF מעת לעת.
לאחר הפסקת הדגימה, הוציאו את בדיקת המיקרודיאליזה של המוח מקטטר הבדיקה. טבלו את הגשושית במים שעברו דה-יוניזציה ושטפו במים שעברו דה-יוניזציה למשך 12 שעות כדי להסיר שקיעי מלח תקועים מהצינור ומהבדיקה. הסר את הבדיקה והכנס אותה לתמיסת טריפאין של 0.05% בארבע מעלות צלזיוס.
נוזל חוץ-תאי בהיפוקמפוס הנרכש בטכניקת המיקרודיאליזה במוח הוא דמוי מים, חסר צבע ושקוף בקצב הדגימה שנקבע. ההליכים החשובים ביותר הם השתלת המיקרודיאליזה בזהירות באזור CA1 והחדרת הבדיקה לצנתר הפופ. טכניקת המיקרודיאליזה פשוט מאפשרת לסייע לשינוי דינמי של סמני מחלה באזורי מוח ספציפיים, חומר יעילות התרופה וקטבוליזם הרקמה של מרכיבי התרופה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לדגימה דינמית בזמן אמת של נוזל חוץ-תאי בהיפוקמפוס (HECF) בחולדות עירות באמצעות טכניקת מיקרודיאליזה של המוח. תהליך זה מאפשר לחוקרים לנטר סממנים ספציפיים למחלות במערכת העצבים המרכזית על ידי קבלת דגימה רציפה מאזורים ספציפיים במוח ללא הרדמה של נסייני המחקר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מחלות נוירודגנרטיביות
- טכניקות מיקרודיאליזה
רקע
- הבנת הדינמיקה של הנוזל החוץ-תאי חיונית לחקר מנגנונים נוירונליים ופלסטיות.
- שיטות נוכחיות כוללות בדרך כלל טכניקות פולשניות שעלולות להשפיע על ההקשר הביולוגי.
- מיקרודיאליזה מאפשרת איסוף של נוזל אינטרסטיציאלי בזמן שהנבדק ער, ובכך מספקת נתונים רלוונטיים יותר.
- פרוטוקול זה נותן מענה לצורך בניטור רציף של הרכב נוזלי המוח במודלים חיים.
מטרת המחקר
- לשיפור הניטור של סמני מחלה בהיפוקמפוס באמצעות יישום של גישת דגימה לא פולשנית.
- לספק מסגרת מתודולוגית מפורטת עבור חוקרים לשחזור הפרוצדורה.
- להקים מערכת אמינה לצפייה בהשפעות של תרופות ובשינויים מטבוליים לאורך זמן.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- המחקר עושה שימוש במערכת מיקרודיאליזה המושתלת באזור CA1 של ההיפוקמפוס.
- חולדות ערות שאינן תחת הרדמה משמשות כמודל הביולוגי לדגימה של HECF.
- טכניקת המיקרודיאליזה מודדת נוזלים בקצב של 1 µL לדקה.
- שלבים קריטיים כוללים השתלה מדויקת של הקטטר, השגת שיווי משקל ומרווחי דגימה קבועים.
- ניקוי של גשש המיקרודיאליזה לאחר הדגימה מבוצע כדי להבטיח את שלמות הנתונים.
תוצאות עיקריות
- ה-HECF שנאסף הוא צלול וחסר צבע, מה שמאפשר ניתוח של סממני מחלה.
- מתודולוגיה מעמיקה מאפשרת ניסויים בשינויים דינמיים בסביבות נוירונליות.
- מידע המתקבל משיטה זו יכול לסייע בהערכת יעילות תרופות ובהבנת קטבוליזם של רקמות.
מסקנות
- מחקר זה מדגים את הפוטנציאל של מיקרודיאליזה בקידום הבנתנו את הדינמיקה של נוזלי המוח ותהליכי מחלה.
- יכולת הניטור הרציף מאפשרת הערכה של שינויים בזמן אמת בפעולת תרופות ובמצבים מטבוליים.
- תובנות אלו חיוניות לשיפור אסטרטגיות לטיפול במחלות נוירולוגיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
איסוף דינמי בזמן אמת של נוזל חוץ-תאי מהיפוקמפוס (HECF) בחולדות ערות מאפשר ניטור ישיר של שינויים נוירוכימיים הרלוונטיים להתקדמות מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) וליעילות תרופתית. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי במדעי הנוירונים תרגומיים (translational neuroscience) על ידי אספקת נתונים כמותיים של סמנים ביולוגיים ברזולוציית זמן מאזורי מוח רלוונטיים למחלה. גישה זו תומכת בגילוי מוקדם ובהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור פורטפוליו של טיפולים נוירו-תרפויטיים המכוונים למסלולים היפוקמפליים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של הדינמיקה הנוירוכימית העומדת בבסיס מנגנוני מחלות של ה-CNS in vivo.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי כימות השפעות של תרופות ומטבוליטים בהיפוקמפוס.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים באמצעות מדידה ישירה של סממנים חוץ-תאיים הרלוונטיים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק דגימה כמותית ומאומתת של נוזל חוץ-תאי במוח לצורך סריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- מאפשר איסוף הדיר וסטנדרטי של נתונים נוירוכימיים במודלים של בעלי חיים ערים.
- תומך בפיתוח בדיקות להערכת תגובות פרמקודינמיות לתרכובות הפעילות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את מדידת הסמנים הביולוגיים הפרה-קליניים עם נקודות קצה רלוונטיות למחלה בנוירומדע תרגומי.
- מאפשרת המשכיות משלב הגילוי דרך התיקוף הפרה-קליני על ידי מעקב אחר השפעות דינמיות של תרופות in vivo.
- תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על קריאות נוירוכימיות בזמן אמת.
שילוב זרימת עבודה ותהליכי עיבוד
שיטת מיקרודיאליזה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת ניתוח כמותי בזמן אמת של הנוזל החוץ-תאי בהיפוקמפוס בחולדות בהכרה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים עבור מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) על ידי ניטור שינויים דינמיים בסממנים ביולוגיים.
- סריקה: מספק נתונים נוירוכימיים הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק פלטיים כמותיים להשוואת השפעות תרופות ומצבי מחלה בתנאים ניסויים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין מחקרים פרה-קליניים לתרגומיים על ידי התאמת מדידת סממנים ביולוגיים עם נקודות קצה קליניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה רב-פעמית לתהליכי גילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית ותיקוף סממנים ביולוגיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה לדגימה נוירוכימית ומשפר את השחזוריות בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ויעילות הון באמצעות אספקת נתוני ביומרקרים ברי-יישום.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף מותאם סיכון של מועמדים לטיפולים נוירו-תרפויטיים על בסיס ראיות דינמיות in vivo.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח סטריאוטקסי ובשתילת פרוב מיקרודיאליזה.
- דורש מכשור ייעודי לדגימת מיקרודיאליזה ולניתוח כמותי.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של קצבי הדגימה ושל הפרוטוקולים האנליטיים.
- התאמה לאזורי מוח שונים או למודלים של מחלות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- הדגימה מוגבלת לאנליטים שמשקלם נמוך מ-20 kDa, בהתאם למפרט נקודת החיתוך של הפרוב.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Brain Microdialysis Probe Implantation Surgery
2:24
Microdialysis System Connection and Probe Check
3:15
Collection of Hippocampal Extracellular Fluid (HECF) from the Awake Rat
4:02
Maintenance of the Microdialysis System and Devices After Sampling
4:36
Results: Analysis of HECF Collected Using the Microdialysis Sampling Equipment
4:54
Conclusion
