Name: שליטה בשבר חלקיקים בפיגומי חלקיקים מחושלים מיקרו-נקבוביים עבור תרבית תאים תלת-ממדית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: חקור שיטות לשליטה בשבר חלקיקים בפיגומי MAP מיקרו-נקבוביים לתרבית תאים תלת-ממדית. טכניקות אלו מאפשרות לשלוט בחוזקה בתכונות החומר ובתגובות התאים ליישומי הנדסת רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים רוצים להודות למכונים הלאומיים לבריאות, למכונים הלאומיים להפרעות נוירולוגיות ושבץ (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599), ולמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (1R01AI152568). עבודה זו בוצעה בחלקה במתקן מכשור החומרים המשותפים של אוניברסיטת דיוק (SMIF), חבר ברשת הננוטכנולוגיה משולשת המחקר של צפון קרוליינה (RTNN), הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע (מספר פרס ECCS-2025064) כחלק מהתשתית הלאומית המתואמת לננוטכנולוגיה (NNCI). המחברים רוצים להודות לפוסט-דוקטורנט לשעבר של המעבדה, ד"ר לוקאס שירמר, כמו גם לאית'ן ניקלו על עזרתם ביצירת המכשיר המודפס בתלת-ממד לניסויים בתרביות תאים.

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Darling, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+by+click+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391(2020).</li>
<li>Truong, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+annealed+particle+hydrogel+stiffness%2C+void+space+size%2C+and+adhesion+properties+impact+cell+proliferation%2C+cell+spreading%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer.</a> Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+microgel+scaffolds+as+platforms+for+3D+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254(2017).</li>
<li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2022).</li>
<li>Wilson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometric+post+modification+of+hydrogel+microparticles+dictates+neural+stem+cell+fate+in+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds.</a> Advanced Materials. 34 (33), 2201921(2022).</li>
<li>Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+microgel+fabrication+technique+on+granular+hydrogel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).</li>
<li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jammed+microgel+inks+for+3D+printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Jammed microgel inks for 3D printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076(2018).</li>
<li>Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+fraction+as+a+bioactive+cue+in+granular+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular%2C+colloidal%2C+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Polymer+Materials%22%5BJournal%5D)">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+variable+height+photolithography+for+valved+multilayer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55276(2017).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Magnetic+Resonance+%28NMR%29+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database.+Organic+Chemistry.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy.</a> JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Roosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+microgel+building+blocks+for+microporous+annealed+particle+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64119(2022).</li>
<li>Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+bioorthogonal+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Letters%22%5BJournal%5D)">Interfacial bioorthogonal crosslinking.</a> ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).</li>
<li>Welzel, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogel+micromechanics+unraveled+by+atomic+force+microscopy-based+nanoindentation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation.</a> Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).</li>
<li>Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroporous+elastic+polyacrylamide+gels+prepared+at+subzero+temperatures%3A+control+of+porous+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure.</a> Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).</li>
<li>Rommel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+microgel+rods+interlinked+into+soft+macroporous+structures+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture.</a> Advanced Science. 9 (10), 2103554(2022).</li>
<li>Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+delivery+from+granular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid delivery from granular hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867(2021).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+governing+polyethylenimine+polyplex+transfection+in+Microporous+Annealed+Particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+formation+through+assembly+of+microgels+containing+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells.</a> Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).</li>
</ol>

ARA ו-TS הגישו פטנט זמני על טכנולוגיה זו.

ייצור מיקרופלואידי של מיקרו-ג'לים HA-NB הוכח כמייצר מיקרו-ג'לים עם טווח צר יותר של התפלגות גודל מאשר ייצור אצווה תחליב 3,9. המיקרו-ג'לים המתוארים בפרוטוקול זה פותחו באמצעות קרוסלינקר הניתן לחיתוך MMP (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) כדי לתמוך בפירוק חומרים. עם זאת, מיקרו-ג'לים של HA-NB יכולים גם להיות מקושרים באמצעות קישור די-תיול חלופי כגון dithiothreitol (DTT), שאינו מתכלה. באופן דומה, ניתן להשתמש בפוטו-יוזמי צילום אחרים, כגון Irgacure 2959 2-hydroxy-4-(2-h...

פיגומי חלקיקים חישוליים מיקרו-נקבוביים (MAP) הם תת-מחלקה של חומרים גרגיריים שבהם אבני הבניין של המיקרוג'ל (μgel) קשורות זו בזו ליצירת פיגום נקבובי בתפזורת. עם המיקרו-ארכיטקטורה הייחודית של פיגומים גרעיניים אלה, הנקבוביות המולדת שנוצרת על ידי החלל הריק בין מיקרוג'ל כדורי מקושר תומכת בחדירה מואצת של תאים ובנדידה1. ניתן לייצר את אבני הבניין של מיקרוג'ל של פיגומי MAP מפולימרים סינתטיים וטבעיים עם שינויים כימיים2. השיטות המתוארות כאן מדגישות באופן ספציפי את השימוש במיקרוג'לים המורכבים מעמוד שדרה של חומצה היאלורונית (HA) המותאם עם ידיות נורבורן פונקציונליות (NB). הידית הפונקציונלית NB בפולימר HA תומכת בתגובות כימיה של קליקים ליצירת מיקרו-ג'לים וקישורם יחד ליצירת פיגומי MAP 3,4. נעשה שימוש בסכמות רבות לקישור המיקרו-ג'לים זה לזה (כלומר, חישול), כגון תגובות אנזימטיות1, 5,6 מבוססות אור וכימיה של קליקים ללא תוספים 3,7 תגובות. כימיה של קליקים ללא תוספים מתוארת בעבודה זו, תוך שימוש בדרישת האלקטרונים ההופכית טטרזין-נורבורן Diels-Alder לחיבור המיקרו-ג'לים של HA-NB.
כדי לייצר פיגומי MAP, המשתמשים מייצרים תחילה את אבני הבניין של המיקרוג'ל באמצעות אמולסיות הפוכות במערכות אצווה או בתוך התקנים מיקרופלואידיים, כמו גם עם ריסוס אלקטרוהידרודינמי, ליתוגרפיה או פיצול מכני2. הייצור של מיקרוג'לים כדוריים HA-NB תואר היטב ודווח בעבר באמצעות תחליב אצווה2 וטכניקות יצירת טיפות מיקרופלואידיות 8,9,10,11. בעבודה זו, מיקרו-ג'לים כדוריים של HA-NB נוצרו על פלטפורמה מיקרופלואידית ממוקדת זרימה עבור גודל וצורה מבוקרים, כפי שתואר קודם לכן 8,9,10. לאחר הטיהור, המיקרוג'לים קיימים בתרחיף מימי ויש לרכז אותם כדי לגרום למצב תקוע. כאשר הם תקועים, מיקרו-ג'לים מפגינים תכונות של דילול גזירה, המאפשרות להם לתפקד כחומרים הניתנים להזרקה וממלאי חלל1. אחת השיטות להשראת מצב תקוע היא לייבש את המיקרוג'לים באמצעות ליופיליזציה, או ייבוש בהקפאה, ולאחר מכן לייבש מחדש את המוצר המיובש בנפחמבוקר 12. לחלופין, ניתן להסיר את עודפי החיץ מהמיקרוג'ל באמצעות צנטריפוגה מעל מסננת או עם הסרה ידנית של החיץ מכדור המיקרוג'ל על ידי שאיפה או באמצעות חומר סופג. עם זאת, שימוש בצנטריפוגה לייבוש המיקרוג'לים יכול ליצור טווח משתנה מאוד של שברי חלקיקים ושברים ריקים בעת יצירת פיגומים גרעיניים12. טכניקות לליופיליזציה של מיקרוג'לים תוארו באמצעות 70% IPA עבור מיקרו-ג'לים מפוליאתילן גליקול (PEG)13, שמנים פלואורים עבור מיקרו-ג'ל ג'לטין מתקרילויל (GelMa) 14, ו-70% אתנול עבור מיקרו-ג'לים מסוג HA12. פרוטוקול זה מדגיש שיטות לייבוש מיקרו-ג'ל HA כדורי בייבוש בהקפאה באמצעות 70% אתנול, מגיב מעבדה סטנדרטי, כדי לשמור על תכונות המיקרוג'ל המקוריות במהלך תהליך הייבוש. ניתן לשקול ולייבש את המיקרו-ג'לים של HA המיובשים בהקפאה ולייבש אותם מחדש באחוזי משקל המוגדרים על-ידי המשתמש כדי לשלוט בשברי החלקיקים הסופיים בפיגומי MAP12.
השלב האחרון ביצירת פיגומים MAP מסתמך על חישול המיקרוג'לים ליצירת פיגום נקבוביבתפזורת 1. על ידי שימוש ברכיבי מטריצה חוץ-תאית מקוריים ושימוש בסכמות חישול ביו-אורתוגונליות, פיגומי MAP משמשים כפלטפורמה תואמת ביולוגית הן לתרבית תאים במבחנה והן לתיקון רקמות in vivo 3. באמצעות גישות אלה, ניתן לייצר פיגומי MAP מאבני בניין HA-NB עם שברי חלקיקים המוגדרים על ידי המשתמש לצורך העסקתם ביישומי הנדסת רקמות12. הפרוטוקול הבא מתאר את הייצור המיקרופלואידי של מיקרו-ג'לים HA-NB ולאחר מכן ליופיליזציה והתייבשות לשליטה בשבר חלקיקים בפיגומי MAP. לבסוף, שלבים לחישול המיקרוג'לים מתוארים באמצעות כימיה ביו-אורתוגונלית לניסויים בתרביות תאים תלת-ממדיות במבחנה .

<table><tbody><tr><td>1 מ"ל מזרק Luer-Lok סטרילי, לשימוש חד פעמי, פוליקרבונט</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מזרק Luer-Lok סטרילי, לשימוש חד פעמי, פוליקרבונט</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 maleimide</td><td>Invitrogen</td><td>A10254</td><td>לסינתזה של טטרזין עם תווית פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>לצביעה של דגימות תרבית תאים</td></tr><tr><td>רדיד אלומיניום</td><td>VWR</td><td>89107-726</td><td></td></tr><tr><td>אגרוף ביופסיה עם בוכנה, 1.0 מ"מ</td><td>Integra Miltex</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>אגרוף ביופסיה, 4 מ"מ</td><td>מחט קהה Integra Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr>, <tr><td>23 G 0.5 אינץ', לא סטרילי, מכסה</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>B23-50</td><td></td></tr><tr><td>מסנן ואקום בקבוק, 0.22 &mu; m</td><td>קורנינג</td><td>CLS430521</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>VWR</td><td>1B1110</td><td>עבור מאגר כביסה מיקרוג'ל</td></tr><tr><td>מכלולי בוכנה נימית לפיפטות עם תזוזה חיובית, 1000 &mu; L מקסימום נפח</td><td>Rainin</td><td>17008609</td><td></td></tr><tr><td>מכלולי בוכנה נימית לפיפטות עם תזוזה חיובית, 25 &mu; L מקסימום נפח</td><td>Rainin</td><td>17008605</td><td></td></tr><tr><td>מכלולי בוכנה נימית לפיפטות עם תזוזה חיובית, 250 &mu; L מקסימום נפח</td><td>Rainin</td><td>17008608</td><td></td></tr><tr><td>Countess תא ספירת תאים שקופיות</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL מונה תאים אוטומטי</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה, 15 מ"ל</td><td>CELLTREAT</td><td>667015B</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה, 50 מ"ל</td><td>CELLTREAT</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם, דרגת ACS, בקבוק זכוכית</td><td>Stellar Scientific</td><td>CP-C7304</td><td>לסינתזה של אקדח פלזמה קורונה טטרזין עם תווית פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>, מחולל תדר גבוה BD-10A</td><td>ETP</td><td>11011</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני CryoTube, פוליפרופילן, חוט פנימי עם מכסה בורג</td><td>Nunc</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>D1 תאים מזנכימליים של עכבר</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>קו תאים לדוגמה לתרבית בג'לים MAP</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>לצביעה של דגימות תרבית תאים</td></tr><tr><td>תחמוצת דאוטריום, 99.9% אטום D</td><td>151882 סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td>לספקטרוסקופיה של NMR</td></tr><tr><td>צינורות דיאליזה, קרום תאית מחודש, חיתוך משקל מולקולרי של 12-14 kDa</td><td>Spectra/Por</td><td>132703</td><td>לטיהור HA-NB ו-HA-Tet</td></tr><tr><td>אתר דיאתיל</td><td>VWR</td><td>BDH1121-4LPC</td><td>לסינתזה של טטרזין עם תווית פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>דימתילפורממיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>277056</td><td>לסינתזה של טטרזין</td></tr><tr><td>4-(4,6-דימתוקסי-1,3,5-טריאזין-2-יל)-4-מתילמורפוליניום כלוריד (DMTMM)&nbsp;</td><td>TCI-Chemicals</td><td>D2919</td><td>לשינוי HA</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0861</td><td>מקשר דיתול לא מתכלה (תחליף לפפטיד הניתן לניתוק MMP)</td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), גלוקוז גבוה, עם 4500 מ"ג/ליטר גלוקוז, L-גלוטמין, נתרן פירובט ונתרן ביקרבונט, נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td>עבור D1 תרבית תאים</td></tr><tr><td>EMS Paraformaldehyde, גרגירי</td><td>VWR</td><td>100504-162</td><td>להכנת 4% PFA</td></tr><tr><td>אתנול מוחלט (200 הוכחה)</td> <td>KOPTEC</td><td>89234-850</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>לתרבית תאים D1</td></tr><tr><td>צלחת חימום</td><td>Kopf מכשירים</td><td>HP-4M</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer עם כיסוי</td><td>זכוכית Daigger מדעי</td><td></td><td></td>EF16034F</tr><tr><td>2-[4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-1-יל] חומצה אתנסולפונית (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>נתרן היאלורונאט, משקל מולקולרי ממוצע של 79 kDa, מיוצר בחיידק Streptococcus zooepidemicus, באיכות פרמצבטית, זיהום מיקרוביאלי ועוד; 100 יחידות יוצרות מושבה/גרם, אנדוטוקסינים חיידקיים ועוד; 0.050 IU/mg</td><td>Contipro</td><td>N/A</td><td>79 kDa משקל מולקולרי ממוצע שימש לסינתזה של HA-Tet, אך ניתן להתאים שיטות אלה למשקלים מולקולריים אחרים.</td></tr><tr><td>חבילת התוכנה IMARIS Essentials</td><td>Oxford Instruments</td><td>N/A</td><td>תוכנת ניתוח תמונה מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>משאבת עירוי, מזרק כפול</td><td>Chemyx</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מעבדה עם תמיכה מהדק מעבדה</td><td>Geyer</td><td>212100</td><td></td></tr><tr><td>חנקן נוזלי</td><td>Airgas</td><td>NI 180LT22</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום פניל (2,4,6-טרימתילבנזויל) פוספינאט</td><td>TCI-Chemicals</td><td>L0290</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td>N/A</td><td>Labconco FreeZone 6 plus הופסק, אך ניתן להשתמש במייבשי הקפאה אחרים בדרגת מעבדה לפרוטוקול זה.</td></tr><tr><td>מתילטטרזין-PEG4-maleimide</td><td>Kerafast</td><td>FCC210</td><td>לסינתזה של טטרזין עם תווית פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>2-(4-מורפולינו) אתאן חומצה סולפונית (MES)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>לשינוי</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי HA Micro, 24 x 60 מ"מ מס' 1</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר מיקרופלואידית SU8 פרוסה ראשית</td><td>FlowJem</td><td></td><td>עיצוב מותאם אישית שנעשה בבית ב חדר נקי או במיקור</td></tr><tr><td>חוץ שמן מינרלי, כבד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>פפטיד קרוסלינקר דיתול הניתן לקליבר MMP (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)</td> <td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5-Norbornene-2-methylamine</td><td>TCI-Chemicals</td><td>95-10-3</td><td>לסינתזה HA-NB</td></tr><tr><td>סרט אריזה</td><td>סקוטש</td><td>3M 1426</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PEG(thiol)2</td><td>JenKem Technology USA</td><td>A4001-1</td><td>לסינתזה של טטרזין</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין עם תווית פלואורסצנטית, 10,000 יחידות/מ"ל</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>15140122</td><td>לתרבית תאים D1</td></tr><tr><td>צלחת פטרי, פוליסטירן, חד פעמי, קוטר x H=150 x 15 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>פלורוניק F-127</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P2443</td><td>לשטיפת HMP</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>RainX טיפול בזכוכית דוחה מים</td><td>Grainger</td><td>465D20</td><td>פתרון טיפול הידרופובי סינתטי לטיפול במכשירים מיקרופלואידיים</td></tr><tr><td>RGD פפטיד (Ac-RGDSPGERCG-NH2)</td> <td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>גומיות</td><td>סיכות</td><td>112417</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Chem-Impex</td><td>30070</td><td>לדיאליזה</td></tr><tr><td>טווח 80 לסינתזה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1338-43-8</td><td></td></tr><tr><td>סילגארד 184 סיליקון אלסטומר</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית מדע</td><td>4019862</td><td>אלסטומר פולידימתילסילוקסן (PDMS) לייצור מכשירים מיקרופלואידיים והתקני תרבית רקמות</td></tr><tr><td>מסנן מזרק, Whatman Uniflo, 0.2 &mu; m PES, קוטר 13 מ"מ</td><td>Cytvia</td><td>09-928-066</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיגיטלי Tetraview LCD</td><td>Celestron</td><td>44347</td><td></td></tr><tr><td>מלח טטרזין-אמין HCl</td><td>Chem-Impex</td><td>35098</td><td>לסינתזה של HA-Tet</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471283</td><td>לסינתזה של טטרזין עם תווית פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Millipore Sigma</td><td>51805-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>97063-864</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה כחולה טריפאן, 0.4%</td> <td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין EDTA (0.25%), פנול אדום</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>25-200-056</td><td>להרמת תאים דבקים לזרע בג'ל MAP</td></tr><tr><td>Tygon ND-100-80 צינורות רפואיים שאינם DEHP, מד מחט = 23, עובי דופן = 0.020 אינץ', קוטר פנימי = 0.020, חיצוני קוטר = 0.060 בבקר</td> מערכת ריפוי <td>UV של תומאס סיינטיפיק</td><td>1204G82</td><td></td></tr><tr><td>, LX500 LED&nbsp;</td><td>OmniCure</td><td>010-00369R</td><td></td></tr><tr><td>ראש ריפוי UV, ספוט LED UV</td><td>OmniCure</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>UV מד אור, ניתן למעקב</td><td>VWR</td><td>61161-386</td><td></td></tr><tr><td>מייבש ואקום</td><td>Bel-Art</td><td>08-594-15C</td><td></td></tr><tr><td>X-Acto Z סדרת סכין שירות מדויקת</td><td>Elmer's</td><td>XZ3601W</td><td></td></tr></tbody></table>

שליטה בשבר חלקיקים בפיגומי חלקיקים מחושלים מיקרו-נקבוביים עבור תרבית תאים תלת-ממדית

Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture

מיקרו-ג'לים הם אבני הבניין של פיגומי חלקיקים חישוליים מיקרו-נקבוביים (MAP), המשמשים הן לתרבית תאים במבחנה והן לתיקון רקמות in vivo . בפיגומים גרעיניים אלה, הנקבוביות המולדת הנוצרת על ידי החלל הריק בין המיקרו-ג'לים מאפשרת חדירה ונדידה של תאים. שליטה בשבר הריק ובשבר החלקיקים היא קריטית לתכנון פיגומי MAP, שכן נקבוביות היא רמז ביו-אקטיבי לתאים. מיקרוג'לים כדוריים יכולים להיווצר על מכשיר מיקרופלואידי לגודל וצורה מבוקרים ולאחר מכן מיובשים בהקפאה בשיטות המונעות שבירה של רשת הפולימרים. עם התייבשות, המיקרו-ג'לים הליופיליים מובילים לשברי חלקיקים מבוקרים בפיגומי MAP. היישום של שיטות אלה עבור ליופיליזציה של מיקרוג'ל הוביל למחקרים הניתנים לשחזור המראים את ההשפעה של שבר חלקיקים על דיפוזיה של מקרומולקולות והתפשטות תאים. הפרוטוקול הבא יכסה ייצור, ליופיליזציה והתייבשות של מיקרוג'לים לשליטה בשבר חלקיקים בפיגומי MAP, כמו גם חישול המיקרוג'לים באמצעות הצלבה ביו-אורתוגונלית עבור תרבית תאים תלת-ממדית במבחנה.

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את הכנתם של פיגומי חלקיקים מחושלים מיקרו-נקבוביים (MAP) עם סכמת הצלבה ביו-אורתוגונלית, כמו גם שברי חלקיקים מבוקרים לתרבית תאים תלת-ממדית. ראשית, HA שונה עם קבוצות תליוני norbornene כדי לשמש הן ביצירת מיקרוג'ל והן בקישור ליצירת פיגומי MAP. באמצעות שיטות אלה, כ-31% מהיחידות החוזרות של HA שונו בהצלחה באמצעות ידית פונקציונלית של נורבורן (איור 1A). התקנים מיקרופלואידיים עם אזור ממוקד זרימה (איור 1B) הראו שהם מייצרים מיקרו-ג'לים של HA-NB בק...

מזעור השונות בשבר החלקיקים בתוך פיגומים גרעיניים מקל על ניסויים הניתנים לשחזור. עבודה זו מתארת שיטות ליצירת פיגומים גרעיניים עם שברי חלקיקים מבוקרים עבור יישומים של הנדסת רקמות במבחנה .

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo ...

חומרים גרעיניים, כגון פיגומי MAP, הם חומרים נקבוביים הניתנים להזרקה העשויים מחלקיקי הידרוג'ל בגודל מיקרו מקושרים. שליטה בשבר החלקיקים היא קריטית לתכונות החומר ולתגובות התאיות. שברי חלקיקים משתנים בפיגומי MAP יוצרים מגוון של תכונות פיגומים ותגובות תאים, אך טכניקה זו מאפשרת למשתמשים להגדיר את שבר החלקיקים הסופי בפיגומי MAP שהם יוצרים.ניתן להשתמש בפיגומי MAP כדי לקדם תיקון והתחדשות של פצעים מורכבים, כמו גם כדי לספק תרופות. שבר חלקיקים, למשל, משפיע על קצב ומידת החדירה וההתחדשות של התאים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על פני כל הסוגים של הידרוג'לים גרעיניים.כעת, כאשר אנו יכולים ליצור פיגומי MAP עם שברי חלקיקים הנשלטים על-ידי המשתמש, אנו יכולים לחקור מחדש את הפעילות הביולוגית של חומרים אלה ולחקור תגובות תאים ייחודיות, כגון כליאה. הגדרת דור המיקרוג'ל המיקרופלואידי דורשת זמן וסבלנות כשאתה לומד את הטכניקות. עדיף שיהיו מספר מכשירים מוכנים ומוכנים למקרה שתיתקל בבעיות בהתקנה.התחל עם ייצור מיקרופלואידי של חומצה היאלורונית, או HA, ונורבורן, או NB, מיקרו-ג'לים. לפני ייבוש המיקרוג'לים, שקלו שפופרת עם מכסה הברגה בטוח לקריו. לאחר מכן, במכסה מנוע סטרילי, העבירו את המיקרוג'לים השטופים והמטוהרים לצינור מכסה הברגה בטוח לקריו באמצעות פיפטה תזוזה חיובית.הוסיפו 70% אתנול למיקרוג'לים המטוהרים וערבבו היטב. צנטר

controlling-particle-fraction-microporous-annealed-particle-scaffolds

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מציגים שני תהליכים עבור microfabrication של שבבי פולימרי נקבובי לעיבוד תלת ממדי התא. הראשון הוא הבלטות חם בשילוב עם תהליך אדי ריתוך ממס. השני משתמש בתהליך microthermoforming פיתחה לאחרונה בשילוב עם טכנולוגיית מעקב יון המוביל פישוט משמעותי של ייצור.

Microfabrication של שבב בגודל פיגומים לעיבוד תלת ממדי נייד

ניתן לשלב nanosensors סול ביולוגית pH מגיב לפולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA) פיגומי electrospun. פיגומי דיווח עצמיים המיוצרים יכולים לשמש לניטור באתר של תנאי microenvironmental תוך תאי culturing על הפיגום. זה מועיל כמבנה התאי 3D יכול להיות במעקב בזמן אמת מבלי להפריע לניסוי.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

מאמר זה מתאר מגוון של מערכים לזריעת תאי גזע מזנכימליים אנושיים על חומרים, במקרה זה חוטים אלקטרו-ספוניים, שאינם מכסים את הבסיס של לוחות באר תרבית סטנדרטיים על מנת למקסם ולכמת את מספר התאים שמתחברים בתחילה בהשוואה לצפיפות הזריעה הידועה.

אופטימיזציה של קובץ מצורף של תאי גזע mesenchymal האדם על פולי (ε-caprolactone) חוטים electrospun

ההתקדמות בטכנולוגיות ביו-חומרים מאפשרת פיתוח מבנים תלת מימדיים מרובי תאים. פיתחנו פרוטוקולי אלקטרו-ספינינג לייצור שלושה פיגומים בודדים לתרבית התאים המבניים העיקריים של דרכי הנשימה כדי לספק מודל תלת מימדי במבחנה של דופן הסימפונות של דרכי הנשימה.

התאמת תהליך Electrospinning לספק שלוש סביבות ייחודיות לTri-שכבתי<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של חומת Airway

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל מערכות 3D-תרבות בהרכבת פיגומים פפטיד כדי לקדם את הבידול של dedifferentiated chondrocytes במפרק האנושי לתוך רקמות הסחוס דמוי עצמי.

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

אנו מציגים הליך לשליטה אשכול תא ראשוני הצורה מטריצה חוץ-תאית תלת-ממד כדי לקבל צורה דפוס הדיר. מכשיר מעוקב המכיל שני hydrogels שונים הוא מועסק כדי להשיג הדמיה רב כיוונית עבור צורה דפוס רקמות.

שליטה אשכול הראשונית תא 3D היברידית ג'ל קוביה התקן עבור תצורות דפוס הדיר

מוטות מיקרוג'ל עם קבוצות תגובתיות משלימות מיוצרים באמצעות מיקרופלואידיקה עם היכולת להתחבר בתמיסה מימית. המיקרוג'לים האניזומטריים נתקעים ומתחברים למבנים יציבים עם נקבוביות גדולות יותר בהשוואה למערכות מבוססות כדוריות. מיקרו-ג'לים שעברו שינוי עם GRGDS-PC יוצרים מבנים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים שיכולים לשמש לתרבית תאים.

פיגומים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים משולבים ממוטות מיקרוג'ל

פרוטוקול זה מתאר סדרה של שיטות לסינתזה של אבני הבניין של המיקרוג'ל עבור פיגומים של חלקיקים חישוליים מיקרו-נקבוביים, אשר יכולים לשמש למגוון יישומי רפואה רגנרטיבית.

סינתזה מיקרופלואידית של אבני בניין מיקרוג'ל עבור פיגום חלקיקים מחושלים מיקרו-נקבוביים

זה מפרט עבודה והכנת 3D הפיברין פיגומים culturing ומבדל בתאי גזע plutipotent. פיגומים אלה ניתן להשתמש כדי לסנן את ההשפעות של חומרים ביולוגיים שונים על התנהגות בתאי גזע גם שונה כדי לכלול מערכות אספקת סמים.

הכנת 3D הפיברין פיגומים יישומים סלולריים גזע תרבות

velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים (μPIV) משמש כדי לחזות תמונות לזווג של חלקיקי מיקרו נזרעו בזורם דם אשר חוצה קורלציה לתת פרופיל מהירות מדויקת. שיעור גזירה, מהירות המרבית, צורת פרופיל מהירות, וקצב זרימה, כל אחד מהם יש יישומים קליניים, ניתן לגזור ממדידות אלה.

Velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים למדידות בפרופיל מהירות של מיקרו זורם דם

חקור שיטות לשליטה בשבר חלקיקים בפיגומי MAP מיקרו-נקבוביים לתרבית תאים תלת-ממדית. טכניקות אלו מאפשרות לשלוט בחוזקה בתכונות החומר ובתגובות התאים ליישומי הנדסת רקמות.

שליטה בשבר חלקיקים בפיגומי חלקיקים מחושלים מיקרו-נקבוביים עבור תרבית תאים תלת-ממדית

גלה סרטונים נוספים