Name: בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: למדו לבודד ולגדל מקרופאגים ממח עצם עכברים ללא גירוי. פרוטוקול זה מספק תאים חיים ואמינים למחקר בתחומי האימונולוגיה והביולוגיה התאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), דרך Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) ו- Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular - REMETTEC (RED-00570-16), והמועצה הלאומית הברזילאית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq).

פרוטוקול זה בוצע בהתאם למועצה הלאומית לפיקוח על ניסויים בבעלי חיים (Concea) ובאישור ועדת האתיקה והשימוש בבעלי חיים (CEUA). עכברי C57BL/6 נרכשו מחברת Biotério Central של האוניברסיטה הפדרלית של מינאס ז'ראיס (UFMG), בלו הוריזונטה, ברזיל. יש להשתמש בציוד מגן אישי (PPE) כגון מעילי מעבדה, כפפות והגנה על העיניים בכל השלבים המתוארים בפרוטוקול זה.
1. הכנת פיברובלסט L-929 שושלת סופרנאטנט כמקור ל-M-CSF
<ol><li>הפשיר תאי שושלת פיברובלסטים L-929 (American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1) והתחל את תהליך התרבית באופן מיידי כדי לשמר את הכדאיות.</li>
	<li>בארון בטיחות ביולוגית של זרימה למינרית, באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר, מעבירים את תאי השושלת הפיברובלסטית L-929 מהבקבוקון לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 50 מ"ל.</li>
	<li>השתמש פיפטה סרולוגית כדי להוסיף 50 מ"ל של מלוחים סטריליים חוצצים פוספט (PBS), ללא סידן ומגנזיום.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 300 x גרם, 4 ° C למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט.</li>
	<li>יש להשהות מחדש את הגלולה ב-20 מ"ל של Dulbecco′s Medium-F12 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) (DMEM/F12-10) באמצעות פיפטה סרולוגית.</li>
	<li>העבר את התאים המרחפים מחדש לצלוחית תרבית תאים T75.</li>
	<li>יש לדגור באינקובטור של 37°C, 5% CO2 עד למפגש מלא. הערה: בעת מניפולציה של הצלוחית, היזהר להימנע מהרטבת הכיסוי בתמיסה, מכיוון שזה יכול להיות מקור לזיהום. כדי להשיג כמות נוחה של supernatant, יש צורך לשכפל את התאים לאחר שהם מכסים את פני השטח המלא של בקבוק תרבית התא. תאי L-929 מעוכבים על ידי מגע. תמיסת טריפסין/אתילאנדיאמין טטראצטית חמה (EDTA), DMEM/F12-10 ו-PBS סטרילי עד 37°C כדי להתחיל את הרחבת תרבית התא, כמתואר בשלבים הבאים.</li>
	<li>ברגע שמגיעים למפגש מלא, השליכו את הסופרנאטנט מבקבוק תרבית התא, בתוך ארון הבטיחות הביולוגית של הזרימה הלמינרית.</li>
	<li>לשטוף את בקבוק תרבית התא עם 20 מ"ל של PBS סטרילי באמצעות פיפטה סרולוגית ולהשליך את התמיסה.</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של טריפסין/EDTA (0.05% תמיסה) לבקבוק תרבית התאים המכיל את התאים המודבקים.</li>
	<li>מעבירים את בקבוק תרבית התאים מזרימה למינרית לאינקובטורCO2 של 37°C, 5% CO ודוגרים למשך 3 דקות.</li>
	<li>נערו את בקבוק תרבית התאים כדי לנתק את התאים מפני השטח של בקבוק התרבית והשתמשו במיקרוסקופ כדי לוודא שכל התאים נותקו.</li>
	<li>נטרל את פעולת הטריפסין/EDTA (תמיסת 0.05%) עם 10 מ"ל של מדיום DMEM/F12-10.</li>
	<li>מעבירים את התמיסה באמצעות פיפטה סרולוגית לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 50 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט.</li>
	<li>להשהות את הגלולה ב 10 מ"ל של DMEM / F12-10 בינוני.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של תרחיף התא לבקבוק תרבית תאים T175 (תרבית 1:10).</li>
	<li>חזור על ההליך כדי להשיג עשר צלוחיות תרבית תאים T175.</li>
	<li>הוסף 50 מ"ל של DMEM/F12-10 לכל בקבוק תרבית תאים.</li>
	<li>יש לדגור באינקובטור של 37°C, 5% CO2 עד למפגש מלא. הערה: שלבים אלה מבטיחים 500 מ"ל של תא L-929 supernatant. ביום 5, לאחר שהתאים כיסו את משטח הבקבוק של תרבית תאי T175, הסופרנאטנט יועשר עבור M-CSF ויש לאסוף אותו14.</li>
	<li>הסר את בקבוק תרבית התאים מהאינקובטור ביום 5 לאחר עיכוב מגע.</li>
	<li>מעבירים את המדיום לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 50 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה ב-3,200 x גרם, ב-4°C למשך 10 דקות.</li>
	<li>אוספים את הסופרנאטנט המועשר ב-M-CSF ומעבירים את התמיסה לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 50 מ"ל. יש לאחסן במקפיא בטמפרטורה של -20°C. הערה: צנטריפוגה חשובה ביותר לסילוק תאים ופסולת מהסופרנאטנטים.</li>
	<li>סופרנאטנט L-929 הוא מקור נוח וזול לגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) ובדרך כלל מכיל 5 עד 10 ננוגרם/מ"ל של M-CSF8. סופרנאטנטים אלה מכילים גם כמויות זעירות של ציטוקינים אחרים וגורמי גדילה, אך אין להם השפעה עמוקה על הפיזיולוגיה של המקרופאגים15. עם זאת, ניתן לרכוש M-CSF מטוהר ולהשתמש בו כחלופה לסופרנאטנטים L-929 בריכוזים של 1 עד 2 ננוגרם/מ"ל8.</li>
</ol>2. הסרת עצם הירך והטיביה
<ol><li>המשך עם המתת חסד של עכבר זכר מסוג C57BL-6 בן 8 שבועות על ידי פריקת צוואר הרחם לאחר חנק פחמן דו חמצני, בהתאם להחלטה נורמטיבית מספר 18 של המועצה הלאומית לניסויים בבעלי חיים (Concea) ובאישור ועדת האתיקה והשימוש בבעלי חיים (CEUA).</li>
	<li>השרו את העכבר בתמיסת אתנול 70% והשתמשו במספריים סטריליים כדי לבצע חתך של 1 ס"מ לאורך הבטן.</li>
	<li>יש להסיר את העור עד לחשיפה מלאה של שריר הרגליים האחוריות.</li>
	<li>הסר את הרגליים האחוריות בגובה הירך, נזהר לא לשבור את עצם הירך ואת השוקה.</li>
	<li>שים את הרגליים האחוריות בצינור צנטריפוגה חרוטי עם תמיסת אתנול 70%. הערה: השתמש תמיד בעכברים ללא פתוגנים. הקפד לאסוף את שתי הרגליים כדי להשיג מספר גדול יותר של תאים. שלב 2 מבוצע בסביבה לא סטרילית (benchtop). לכן, חשוב להסיר את עצם הירך ואת השוקה בזהירות כך שהם יישארו שלמים כדי למנוע זיהום חיידקי. השלבים הנותרים של הליך זה מתבצעים בארון בטיחות ביולוגית זרימה למינרית. זמן החשיפה של הרגליים לתמיסת אתנול 70% צריך להיות מוגבל ל -10 דקות. אם הזמן ארוך יותר, אבות מח עצם יכולים להיות מושפעים.</li>
</ol>3. להשיג אבות מח עצם מן לומן של השוקה ואת עצם הירך
<ol><li>הסר את הרגליים מתמיסת אתנול 70% והעבר אותן ל- PBS סטרילי.</li>
	<li>שימוש במלקחיים ומגבוני חיטוי להסרת כל השרירים והפאשיה. העצם צריכה להיות נקייה לאחר שלב זה.</li>
	<li>השתמש בלהב אזמל כירורגי סטרילי כדי לחתוך את אפיפיזה העצם בשני הקצוות כדי לחשוף את מח העצם.</li>
	<li>מלאו מזרק 20 מ"ל ב-10 מ"ל PBS סטרילי בתוספת תמיסת 2% פניצילין/סטרפטומיצין וחברו מחט 26 גרם.</li>
	<li>החזיקו את העצם באמצעות מלקחיים אנטומיים ביד אחת, והשתמשו ביד השנייה כדי להחדיר את המחט לחלל העצם. היזהר לא למחוץ את העצם עם המלקחיים.</li>
	<li>שטפו את החלק הפנימי של העצם עם PBS ואספו את מח העצם בצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי. לאחר שלב זה, חלל העצם צריך להיראות לבן.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים שנאספו במשך 10 דקות ב 300 x גרם ב 4 ° C.</li>
	<li>השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של DMEM/F12-10.</li>
	<li>הומוגניזציה ולהוסיף עוד 9 מ"ל של מדיום DMEM/F12-10 כדי להביא את התאים עד סך של 10 מ"ל.</li>
</ol>4. תרבות מקרופאגים
<ol><li>הוסף 1 מ"ל של אבות התא לכל אחד מכלי פטרי פלסטיק עגולים בגודל 100 מ"מ x 20 מ"מ (סה"כ 10 כלים), ופיזר את התאים על פני הצלחות עם פיפטה כדי לקבל פיזור אחיד. אין להשתמש במנות שטופלו בתרבית רקמות.</li>
	<li>הוסף 9 מ"ל של DMEM/F12-10 בתוספת 20% של תא L-929 supernatant לכל מנה.</li>
	<li>דגירה באינקובטור 37°C, 5% CO2 .</li>
	<li>ביוםהשלישי , יש להוסיף 10 מ"ל של מדיום DMEM/F12-10 בתוספת 20% מהסופרנאטנט של תאי L-929 לכל מנה. בדרך זו, לצלחות התרבית יש כעת סך של 20 מ"ל של מדיום תרבית, מספיק לצמיחת התאים עד סוף הבשלתם. הערות: אין להשתמש במנות שטופלו בתרבית רקמה מכיוון שמקרופאגים, כתאי דבק טבעיים המסומנים באינטראקציות חזקות עם משטחים, לא יתנתקו בקלות מהתבשיל מאוחר יותר. בדרך כלל, ניתן לזרוע אבות תאים מעכבר אחד (שתי עצמות הירך) ב-10 צלחות תרבית. אבות התא יהפכו למקרופאגים, בהם ניתן להשתמש מיום הדגירה 7 עד 10. אישור ההתבגרות מזוהה על ידי שינויים במורפולוגיה של המקרופאגים. מקרופאגים בוגרים דבקים ומראים מורפולוגיה הטרוגנית, המוסברת על ידי פליטת פסאודופודיה לכיוונים שונים. דוגמאות לתאים בוגרים אלה מוצגות בתוצאות המייצגות.</li>
</ol>5. קצירת מקרופאגים
<ol><li>השליכו את הסופרנאטנטים מכל מנות התרבות.</li>
	<li>לשטוף כל צלחת תרבית עם 10 מ"ל של חם (37 ° C) סטרילי Mg2+ ו Ca2+ PBS חינם.</li>
	<li>השליכו את התמיסה מכל מנה.</li>
	<li>תמיסת דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים מחממים מראש ל-37°C ומוסיפים 3 מ"ל לכל מנה. יש לדגור במשך 10 דקות באינקובטור של 37°C, 5% CO2 . השתמשו במיקרוסקופ הפוך כדי לדמיין אם המקרופאגים מתנתקים מכלי התרבית. הערה: השימוש בצלחות פלסטיק שאינן מטופלות בתרבית רקמה אמור לאפשר דיסוציאציה קלה של תאים ולהימנע מהצורך לגרד את התאים מהצלחת.</li>
	<li>שטפו את הכלים באמצעות פיפטה סרולוגית עם תמיסת הדיסוציאציה התאית הלא אנזימטית שוב ושוב, תוך ביצוע תנועות מעגליות כדי לאשר שכל המקרופאגים מנותקים מהמנה.</li>
	<li>אוספים את התמיסה של כל מנות התרבות יחד לצינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מ"ל.</li>
	<li>הוסיפו 10 מ"ל של PBS סטרילי שחומם מראש לצלחות התרבית הריקות והמשיכו כמו בשלב 5.4. הליך זה הוא חזרה על שלב 5.4 ומתכוון להבטיח שכל המקרופאגים נאספים.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 300 x גרם, 4 ° C למשך 10 דקות.</li>
	<li>השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה עם 1 מ"ל DMEM/F12-10. הומוגניזציה לאט ובזהירות למעלה ולמטה באמצעות פיפטה כדי למנוע נזק לתאים.</li>
	<li>הכינו aliquot של 10 μL של תמיסת מקרופאגים מדוללים עם 10 μL של Trypan Blue כדי לספור את התאים באמצעות המוציטומטר. הערה: ביום 7, כל מנה תפיק בערך 2 x 106 מקרופאגים. משמעות הדבר היא כי עכבר אחד יכול לייצר בערך 2 x 107 מקרופאגים ראשוניים כאשר נקצר בעשר צלחות. מכיוון ש-M-CSF מניע רק את הבשלת המקרופאגים, ההליך מבטיח אוכלוסיית תאים שהיא למעשה רק מקרופאגים וללא לויקוציטים מזהמים אחרים16.</li>
</ol>

<ol><li>Gomez Perdiguero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li>
<li>van Furth, R., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+kinetics+of+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The origin and kinetics of mononuclear phagocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 128 (3), 415-435 (1968).</li>
<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454 (7203), 428-435 (2008).</li>
<li>Shapouri-Moghaddam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity%2C+polarization%2C+and+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6425-6440 (2018).</li>
<li>Davies, J. Q., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of murine macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 290, 91-103 (2005).</li>
<li>Jin, X., Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+macrophage+colony-stimulating+factor+differentiated+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culture of macrophage colony-stimulating factor differentiated human monocyte-derived macrophages.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54244(2016).</li>
<li>Gonçalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-16 (2015).</li>
<li>Varol, C., Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+development+and+tissue+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages: development and tissue specialization.</a> Annual Review of Immunology. 33, 643-675 (2015).</li>
<li>Andrés, V., Pello, O. M., Silvestre-Roig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+proliferation+and+apoptosis+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Macrophage proliferation and apoptosis in atherosclerosis.</a> Current Opinion in Lipidology. 23 (5), 429-438 (2012).</li>
<li>Pineda-Torra, I., Gage, M., de Juan, A., Pello, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+polarization+of+murine+bone+marrow-derived+and+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and polarization of murine bone marrow-derived and peritoneal macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 101-109 (2015).</li>
<li>Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+functional+characterization+of+three+activated+macrophage+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations.</a> Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1298-1307 (2006).</li>
<li>Hamczyk, M. R., Villa-Bellosta, R., Andrés, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+macrophage+phagocytosis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro macrophage phagocytosis assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 235-246 (2015).</li>
<li>Hosoe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tumoricidal+macrophages+from+bone+marrow+cells+of+normal+mice+or+mice+bearing+a+colony-stimulating-factor-producing+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Induction of tumoricidal macrophages from bone marrow cells of normal mice or mice bearing a colony-stimulating-factor-producing tumor.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 28 (2), 116-122 (1989).</li>
<li>Rice, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rM-CSF+efficiently+replaces+L929+in+generating+mouse+and+rat+bone+marrow-derived+macrophages+for+in+vitro+functional+studies+of+immunity+to+intracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">rM-CSF efficiently replaces L929 in generating mouse and rat bone marrow-derived macrophages for in vitro functional studies of immunity to intracellular bacteria.</a> Journal of Immunological Methods. 477, 112693(2020).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+bone+marrow+cells+into+macrophages+under+the+influence+of+mouse+L929+cell+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+macrophages+%28BMM%29%3A+isolation+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived macrophages (BMM): isolation and applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (12), (2008).</li>
<li>Austin, P. E., Mcculloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li>
<li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1).</a> Encyclopedia of Immunology. 116 (1983), 1650-1654 (1998).</li>
<li>Bou Ghosn, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+physically%2C+functionally%2C+and+developmentally+distinct+peritoneal+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (6), 2568-2573 (2010).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

יצירת אוכלוסייה של מקרופאגים שמקורם במח עצם היא צעד בסיסי במודלים ניסיוניים רבים של ביולוגיה של התא, במיוחד כאשר חשוב להשיג אוכלוסייה הומוגנית של תאים ראשוניים. כאמור, אבות התא יכולים להפוך למקרופאגים רק בנוכחות M-CSF. סופרנאטנטים של תאי L-929 יכולים לשמש כמקור העיקרי של M-CSF. מלבד העלות, אין בעיה להשתמש רקומביננטי M-CSF עצמו 8,17. ישנן עדויות לכך שמקרופאגים רקומביננטיים מסוג M-CSF מפגינים אחידות טובה יותר בתרבית; עם זאת, שימוש בסופרנאטנט r-M-CSF או L-929 אינו ע...

מונוציטים ומקרופאגים הם פאגוציטים חד-גרעיניים שניתן להפיק מאבות במוח העצם. מחקרים אחרונים דיווחו כי מקורם של מקרופאגים גם באבות אריתרו-מיאלואידים שמקורם בשק חלמון1. ללא קשר לגזירה שלהם, לויקוציטים אלה יש פונקציות השפעה חשובות בהומאוסטזיס ודלקת 2,3. מונוציטים הם תאים מדם היקפי שיכולים להתמיין עוד יותר למקרופאגים ברקמה 2,4, ואילו מקרופאגים הם תאים הטרוגניים המציגים פנוטיפים ותפקודים המווסתים על ידי חשיפה מקומית של גורמי גדילה וציטוקינים5. מאחר שהמקרופאגים מראים מגוון תפקודי כזה, הם נחקרו במודלים רבים של מחלות. כך הפכה תרבית המקרופאגים לכלי חשוב להבנת הפיזיולוגיה שלהם ותפקידם במחלות שונות. מח העצם הוא מקור חשוב לתאי אב, כולל אבות מקרופאגים, שניתן לבודד ולהכפיל, מה שמגדיל באופן אקספוננציאלי את מספר המקרופאגים המתקבלים. בנוסף, מקרופאגים שמקורם במח עצם חשובים במיוחד כדי למנוע את ההשפעות הנוצרות על ידי מיקרו-סביבה של רקמות, שכן מקרופאגים משנים את הפנוטיפ שלהם בתגובה לגירויים שונים ברקמות 6,7. אבות מח עצם הופכים למקרופאגים עם חשיפה לגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF)8. לא ניתן להבדיל בין מקרופאגים שמקורם במח עצם לבין מקרופאגים שמקורם במונוציטים על ידי סמנים ביוכימיים ברקמות. תאים אלה מייצגים אוכלוסייה הומוגנית מאוד של תאים ראשוניים, שבמובנים רבים אחרים דומים למקרופאגים פריטוניאליים 6,9.
בגלל מערך התפקודים התאיים ההטרוגניים שלהם, מקרופאגים נחקרו זה מכבר ביסודיות על ידי חוקרים. תאים אלה יכולים לשמש במודלים ניסיוניים שונים, כולל מחלות זיהומיות ודלקתיות, כפי שהם מופיעים בתהליכים אלה10,11. הם יכולים גם להיות שימושיים לחקר קיטוב המקרופאגים בתגובה לגירויים מיקרו-סביבתיים שונים12,13. לפיכך, פרוטוקול פשוט ואמין מסופק כאן לצורך קבלת מספר גבוה של מקרופאגים ראשוניים ממח עצם עכבר.

<table><tbody><tr><td>מזרק 20 סמ"ק</td><td>DESCARPACK</td><td>SI100S4G</td><td>מזרק סטרילי</td></tr><tr><td>26 גרם מחטים</td><td>BD</td><td>497AQDKT7</td><td>מחטים סטריליות</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל</td><td>SARSTEDT</td><td>62547254</td><td>צינורות חרוטיים מפלסטיק המתאימים לצנטריפוגה</td></tr><tr><td>תמיסת אתנול 70%</td><td>EMFAL</td><td>490</td><td>תמיסת אתנול לעיקור</td></tr><tr><td>דיסקציה אנטומית מלקחיים</td><td>3B SCIENTIFIC</td><td>W1670</td><td>תחזוקה בכוס סטרילית המכילה 70% תמיסת אתנול</td></tr><tr><td>C57Bl/6 עכבר מסוג בר</td><td>נרכש מ-Biot&eacute; ריו סנטרל באוניברסיטה הפדרלית של מינאס ז'ראיס</td><td>לא ישים</td><td>עכברים חייבים להיות נטולי פתוגנים ספציפיים, בגיל בין 6 ל-10 שבועות. יש לאכלס עכברים לפחות שבוע קודם לכן כדי להתאושש מלחץ ההובלה</td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים T175</td><td>GREINER</td><td>C7481-50EA</td><td>T-175, צוואר משומר, שטח פנים 75 ס"מ, עם מכסה מסנן, ללא DNase, ללא RNase</td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים T75</td><td>GREINER</td><td>C7231-120EA</td><td>T-75 בקבוק, צוואר משומר, שטח פנים 75 ס"מ, עם מכסה מסנן, ללא DNase, חיטוי או</td></tr><tr><td>מגבונים לתינוקות</td> ללא נאס?<td>CLOROX</td><td>לא ישים</td><td>זה עוזר לנקות את העצם</td></tr><tr><td>מים מזוקקים</td><td>GIBCO</td><td>15230</td><td>מים מזוקקים סטריליים</td></tr><tr><td>DMEM/F12-10</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>הוסף 10 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) ו-1 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) ל-DMEM/F12 (q.s.p. 100 מ"ל)DMEM</td></tr><tr><td>/F12-10 + סופרנטנט של תאי L-929</td><td>לא ישים לא ישים</td> לא <td>ישים</td><td>יש להוסיף 20% מתרבית תאי L929 על DMEM/F-12-10</td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Modified Eagle &prime; s בינוני - F12 (DMEM/F12)</td> <td>GIBCO</td><td>12500096</td><td>DMEM: F-12 בינוני מכיל 2.5 מ"מ L-גלוטמין, 15 מ"מ HEPES, 0.5 מ"מ נתרן פירובט ו-1200 מ"ג/ליטר נתרן ביקרבונט. יש להשעות את האבקה ל-1 ליטר מים מזוקקים ולהוסיף 3,7 גרם נתרן ביקרבונט. התאם את ה-pH ל-7,2 וסנן עם 0,22 &M. אחסון ב-2 - 8 &deg; מקפיא C</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מוסמך, מושבת בחום, ארצות הברית (FBS)</td><td>העשרת GIBCO</td><td>10082147</td><td>עבור DMEM-F12</td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z359629</td><td>משמש לספירת מקרופאגים בתאי מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>L-929</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>ATCC # CCL-1</td><td>L-929 הוא שושלת של תאי פיברובלסטים של עכברים המשמשים כמקור לגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF)</td></tr><tr><td>ליקוי חמה של Nikon TI&nbsp;</td><td>ניקון&nbsp;</td><td>לא ישים</td><td>Nikon TI Eclipse הוא מיקרוסקופ פלואורסצנטי וניגוד פאזה</td></tr><tr><td>תמיסת דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים</td><td>CELLSTRIPER (CORNING)</td><td>25-056-CI</td><td>תמיסת דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים מסירה מקרופאגים מהצלחת מבלי לפגוע בהם</td></tr><tr><td>כלי תרבית עגולים לא מטופלים 100 ופעמים; 20&ndash; מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>CLS430591</td><td>אין להשתמש בצלחות פטרי שטופלו בתרבית רקמות או בכל צלחת שטופלה בתרבית רקמות</td></tr><tr><td>P3199 פניצילין G מלח אשלגן</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>113-98-4</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>פניצילין ותמיסת</td><td></td><td></td> סטרפטומיצין (P/S) <td>השתמש ב-0,26 גרם פניצילין ו-0,40 גרם סטרפטומיצין. מערבבים עם 40 מ"ל PBS סטרילי. בתוך ארון זרימה למינרי אופקי, השתמש ב-0,22 &micro; M מסננים ומאחסנים כמויות של 1.0 מ"ל בצינורות מיקרופוגה של 1.5 מ"ל במקפיא (-20&deg; ג)</td></tr> <tr><td>פוספט חוצץ מלח ללא סידן ומגנזיום (PBS)</td><td>MEDIATECH</td><td>21-040-CM</td><td>סטרילי</td></tr><tr><td>S7975 סטרפטומיצין סולפט, 650-850U/mg</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>3810-74-0</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות של 10 מ"ל או 25 מ"ל</td><td>SARSTEDT</td><td>861254001</td><td>פיפטות סרולוגיות משמשות בנפחים גבוהים מ-1 מ"ל</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>144-55-8</td><td>תיקון pH עבור תוכנת DMEM-F12</td></tr><tr><td>Nis Elements Viewer</td><td>NIKON</td><td>לא ישים</td><td>NIS-Elements Viewer היא תוכנית עצמאית חינמית לצפייה בקבצי תמונה ומערכי נתונים</td></tr><tr><td>PBS סטרילי ו-2% מתמיסת P/S</td><td>LABORCRIN</td><td>590338</td><td>הוסף 1 מ"ל של P/S ב-40 מ"ל של PBS</td></tr><tr><td>סטרילי מספריים ישרים לקשתית</td><td>KATENA</td><td>לא ישים</td><td>שמור בכוס סטרילית המכילה 70% תמיסת אתנול</td></tr><tr><td>סופרנטנט של תאי L-929</td><td>לא ישים</td><td></td><td>L-929 הוא שושלת של תאי פיברובלסטים של עכברים המשמשים כמקור לגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF). L-929 supernatant הושג מהפרוטוקול</td></tr><tr><td>להב אזמל כירורגי מס' 24 נירוסטה</td><td>SWANN-MORTON</td><td>311</td><td>משמש לחשיפת אפיפיזה מעצמות</td></tr><tr><td>תמיסת טריפאן כחולה, 0.4%</td> <td>GIBCO</td><td>15250061</td><td>תמיסת טריפן כחולה, 0.4%, משמשת באופן שגרתי ככתם תאים להערכת כדאיות התאים באמצעות בדיקת אי הכללת צבע</td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין/EDTA 0,05%</td> <td>GIBCO</td><td>25300-062</td><td>משמש לניתוק תאים מבקבוק תרבית</td></tr><tr><td>מים להזרקה (WFI) לתרבית תאים</td><td>GIBCO</td><td>A12873</td><td>מים סטריליים ונטולי אנדוטוקסינים</td></tr></tbody></table>

בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

למקרופאגים יש תפקידים משפיעים חשובים בהומאוסטזיס ובדלקת. תאים אלה נמצאים בכל רקמה בגוף ויש להם יכולת חשובה לשנות את הפרופיל שלהם בהתאם לגירויים הקיימים במיקרו-סביבה. ציטוקינים יכולים להשפיע עמוקות על הפיזיולוגיה של המקרופאגים, במיוחד IFN-γ ואינטרלוקין 4, ולייצר סוגי M1 ו-M2 בהתאמה. בגלל הרבגוניות של תאים אלה, ייצור אוכלוסייה של מקרופאגים שמקורם במח עצם יכול להיות צעד בסיסי במודלים ניסיוניים רבים של ביולוגיה של התא. מטרת פרוטוקול זה היא לסייע לחוקרים בבידוד ובתרבית של מקרופאגים שמקורם באבות מח עצם. אבות מח עצם מעכברי C57BL/6 נטולי פתוגן הופכים למקרופאגים עם חשיפה לגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) אשר, בפרוטוקול זה, מתקבל מהסופרנאטנט של שושלת הפיברובלסטים L-929. לאחר הדגירה, מקרופאגים בוגרים זמינים לשימוש מהיוםה-7 עד היוםה-10 . בעל חיים בודד יכול להיות המקור של בערך 2 x 107 מקרופאגים. לכן, זהו פרוטוקול אידיאלי להשגת כמויות גדולות של מקרופאגים ראשוניים באמצעות שיטות בסיסיות של תרבית תאים.

מקרופאגים הם תאים גדולים ודבקים בעלי מאפיינים פיזיולוגיים מיוחדים. הם מראים מגוון של מצגות מורפולוגיות בתרבית בגלל היכולת להיצמד לזכוכית ולפלסטיק, והמורפולוגיה המתפשטת האופיינית שלהם קשורה לפליטה של שלוחות ציטופלזמיות (איור 1). ברגע שאבות מח העצם נחשפים ל-M-CSF מסופרנאטנט תאי L-929 ומתחילים את הטרנספורמציה למקרופאגים בוגרים, הם נדבקים לצלחת פטרי.
איור 2 מראה את הקינטיקה של הטרנספורמציה של אבות מח עצם למקרופאגים בוגרים. ביום 3 מופיעים ...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים.

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

פרוטוקול זה נועד להשיג כמויות גבוהות של מקרופאגים לא מגורה שמקורם במח עצם ומעולם לא נחשפו לגורמי רקמה או ציטוקינים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא מספר התאים שנרכשו מחיה אחת. עם ההליך הנכון, בערך 2 פעמים 10 בחזקת 7 מקרופאגים ניתן להשיג.שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים מתחומים שונים החוקרים מקרופאגים כגון ביולוגיה של התא, פתולוגיה, אימונולוגיה ופרזיטולוגיה, מכיוון שתאים תמיד רגישים לזיהום, זהירות בכל השלבים הסטריליים ושימוש בארון בטיחות ביולוגית של זרימה למינרית נחוצים כדי לשמור על כדאיות התא. מי שתדגים את ההליך תהיה איזבלה אפארסידה דה סוזה. סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו.כדי להתחיל את ההליך על עכבר זכר מסוג פרא C57BL/6 בן שמונה שבועות שעבר המתת חסד נכונה, השרו את העכבר בתמיסת אתנול 70%. בעזרת מספריים סטריליים, לבצע חתך של סנטימטר אחד לאורך הבטן ולהסיר את העור עד שריר הרגליים האחוריות נחשף במלואו. לאחר מכן הסר בזהירות את הרגליים האחוריות בגובה הירך מבלי לשבור את עצם הירך והשוקה.הכניסו את הרגליים האחוריות השלמות לצינור צנטריפוגה חרוטי המכיל תמיסת אתנול 70%. בתוך ארון בטיחות ביולוגית של זרימה למינרית, העבירו את הרגליים המבודדות מאתנול 70% ל-PBS סטרילי. בעזרת מלקחיים ומגבוני חיטוי, נקו את העצמות על ידי הסרת כל השרירים המחוברים והפאשיה.לאחר מכן, השתמש בלהב אזמל כירורגי סטרילי כדי לחתוך את א

isolation-and-culture-of-bone-marrow-derived-macrophages-from-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקרופאגים לשחק תפקיד מרכזי הומאוסטזיס והפתולוגיה ברקמות רבות. הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטות ומכלה...

דלדול המשאבים ואת הכינון מחדש של מקרופאגים בעכברים

בסרטון זה אנו מדגימים את הבידוד והתרבית של תאי סטרומה ממח עצם מהעצמות הארוכות של עכברים. ניתן להשתמש ב- BMSCs הדבקים המבודדים לניתוח נוסף.

בידוד ותרבית של תאי סטרומה ממח עצם משוקה עכברית

בסרטון זה אנו מדגימים את ההפעלה של מקרופאגים שמקורם במח עצם בתגובה לליפופוליסכריד חיידקי ואימונוגלובולין תוך ורידי.

הפעלת מקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר בתגובה לנוגדנים

המאמר מתאר את הסתגלות קלה...

חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

המקרופאגים כבר מזמן מוכרים כמרכיב קריטי של תגובות חיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. הפיצוץ האחרון של ידע הנוגע להיבטים אבולוציוניים, גנטיים, והביוכימי של האינטראקציה בין מקרופגים וחיידקים חידש את תשומת לב מדעית למקרופאגים. מאמר זה מתאר שיטה להבדיל מקרופאגים ממח העצם של עכבר.

מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

כאן אנו מציגים פרוטוקול המייצר כמויות גדולות של מונוציטים עכבריים ממח עצם הטרוגני ליישומים תרגומיים. בהשוואה לאחרות, שיטה חדשה זו מסייעת להפחית את מספר בעלי החיים המוקרבים ומורידה עלויות על ידי הימנעות משיטות יקרות כגון הפרדת תאים מגנטיים בשיפוע גבוה (MACS).

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

תכנות מחדש מטבולי הוא מאפיין ותנאי מוקדם לקיטוב מקרופאגים M1 ו-M2. כתב יד זה מתאר מבחן למדידת פרמטרים בסיסיים של גליקוליזה ותפקוד מיטוכונדריאלי במקרופאגים שמקורם במח עצם של עכבר. ניתן ליישם כלי זה כדי לחקור כיצד גורמים מסוימים משפיעים על חילוף החומרים והפנוטיפ של המקרופאגים.

אפיון חילוף חומרים של מקוטב M1 והמקרופאגים נגזר מח עצם M2 באמצעות ניתוח תאי שטף בזמן אמת

פרוטוקול זה הוקם כדי תרבית טטרהידרוביופטרין (BH4) - ותחמוצת החנקן סינתאז (iNOS) - חסרים מקרופאגים ראשוניים של מורין כדי לחקור ביולוגיה של NO-redox. המחקר מתמקד בהפחתת זיהום פוטנציאלי של BH4 וממצאים אחרים שנמצאו בשיטות בידוד ותרבית מסורתיות אשר עשויות לבלבל את תוצאות הניסויים ואת הפרשנות של התוצאות.

בידוד ותרבית במבחנה של מקרופאגים שמקורם במח עצם לחקר הביולוגיה של NO-Redox

אנו מציגים פרוטוקול דו-שלבי לבידוד מיטוכונדריה באיכות גבוהה התואם לגילוי וכימות חלבונים בקנה מידה של פרוטאום. הפרוטוקול שלנו אינו דורש הנדסה גנטית ולכן מתאים לחקר מיטוכונדריה מכל תא ורקמות ראשוניים.

בידוד דו-שלבי ללא תגים של מיטוכונדריה לשיפור גילוי וכימות חלבונים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא אנזימטית ופשוטה לבידוד תאי מח עצם של עכבר יילודים בני 7-9 ימים ויצירת מקרופאגים ממוינים באמצעות סופרנאטנט של תאי L929 כמקור לגורם מגרה מושבת גרנולוציטים (M-CSF). המקרופאגים שמקורם במח עצם נותחו עוד יותר עבור אנטיגנים פני השטח F4/80, CD206, CD11b וכשירות תפקודית.

עכבר יילודים בידוד מח עצם והכנת מקרופאגים שמקורם במח עצם

למדו לבודד ולגדל מקרופאגים ממח עצם עכברים ללא גירוי. פרוטוקול זה מספק תאים חיים ואמינים למחקר בתחומי האימונולוגיה והביולוגיה התאית.

בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

גלה סרטונים נוספים