Name: פיצול תת-תאי לבידוד רכיבים סינפטיים ממוח מורין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: למד פיצול תת-תאי לבידוד רכיבים סינפטיים ממוח עכברים. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מולקולרי מדויק של חלבונים סינפטיים ותפקודם במחלות נוירולוגיות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לפ' קולוסי על הכנת תמונת EM. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 NS064963, SSC; R01 NS110354, SSC; R01 NS083846, SSC; R21 NS094971, SSC; T32 NS007224, SMT; T32 NS041228, SMT), משרד ההגנה של ארצות הברית (W81XWH-17-1-0564, SSC; W81XWH-19-1-0264, VDJ), יישור מדע על פני רשת המחקר השיתופית של פרקינסון (ASAP) (SSC), ותוכנית קידום המטרות של קרן מייקל ג'יי פוקס (MJFF-020160, SSC & VDJ). יצרנו איורים גרפיים באמצעות BioRender.com.

למחברים אין מה לחשוף.

במחקרי היסוד שלהם, ויטאקר ועמיתיו השתמשו בארבעה קריטריונים מורפולוגיים כדי לזהות סינפטוזומים: (1) למבנים יש קרום פלזמה אטום; (2) המבנים מכילים SVs הדומים לאלה שבקצות העצבים ודליות באתרם בגודל ובמספר; (3) למבנים יש מיטוכונדריה קטנה אחת או יותר; ו-(4) הממברנה הקדם-סינפטית נדבקת לעתים קרובות למרכיב פוסט-סינפטי11,12,13. למרות ששני הקריטריונים הראשונים חלים בדרך כלל על כל שיטת בידוד, בפרוטוקולים האחרונים המתוארים במאמר זה, לא לכל הסינפטוזומים המתקבלים יהיו מיטוכונדריה ומסופים פוסט-סינפטיים מחוברים. כ-60% מהסינפטוזומים יהיו בעלי מיטוכונדריה, ורק עד 15% מעריכים כי הם מחוברים לטרמינלים פוסט-סינפטיים37. אם רכיבים פוסט-סינפטיים מעניינים במיוחד, ידוע כי השימוש במאגר הומוגניזציה איזוטוני דמוי קרבס וסינון לחץ להעשרה מניבים ריכוזים גבוהים של סינפטוזומים עם הדקים פוסט-סינפטיים (המכונים גם סינפטונורוזומים)22,38.
השיטה להקריב את החיה יכולה להשפיע על איכות הסינפטוזומים ותת-החלקיקים הסינפטיים. בעלי חיים בוגרים שהוקרבו בשיטת המתת חסד שאינה דורשת הרדמה יביאו לאיכות השבר הטובה ביותר. יתר על כן, יש לנתח את המוחות באופן טרי, לא להקפיא, ולהפוך אותם להומוגניים באמצעות יחס של 1:10 של חיץ הומוגניזציה (משקל/נפח) עבור השברים הסינפטיים בני הקיימא ביותר22. במוח יש אוכלוסייה הטרוגנית של סינפסות שניתן להבדיל ביניהן על ידי סוג הנוירוטרנסמיטורים שהן נושאות. היווצרות סינפטוזום בדרך כלל אינה מושפעת מסוג סינפסה או תוכן נוירוטרנסמיטר13. יוצא מן הכלל הוא סיבים טחבים במוח הקטן, אשר ידועים להיות משובשים בתנאים אופטימליים לקבלת סינפטוזומים משאר המוח39,40. לכן, הסרת המוח הקטן לפני הומוגניזציה המוח מומלץ אם ההדרה של אזור זה אינו משפיע על המטרה הניסויית. אם מעוניינים לבודד סינפטוזומים של אופי נוירוטרנסמיטר מסוים, אזורים במוח המועשרים עבור נוירונים המכילים את הנוירוטרנסמיטר של עניין יכול להיות מבודד תחילה. עם זאת, גישה זו תטיל מגבלות על תשואת השבר הסופי, בהתאם לגודל אזור העניין (גם גיל בעלי החיים הוא, אם כן, שיקול). ישנן שיטות אימונוכימיות לבידוד של סינפטוזומים ספציפיים לנוירוטרנסמיטר, אך הכדאיות והתשואה ייפגעו באופן משמעותי22. אם הערכת הכדאיות המטבולית של סינפטוזום חשובה, ניתן להשתמש במדידה של שחרור נוירוטרנסמיטר 41,42 או מבחנים אנזימטיים מסוימים43.
מזהמים נפוצים בתכשירי סינפטוזום כוללים מיקרוזומים, מיטוכונדריה חופשית, SVs וקרומים עצביים וגליאליים. ניתן להפחית את הזיהום על ידי הגדלת מספר השטיפות בשברים P1 ו- P222 והימנעות מדחייה מחדש של כדור המיטוכונדריה האדום בשלבים הבאים. בניסויים שבהם הכדאיות והזמן המטבוליים הם קריטיים, הפחתת מספר השטיפות ושימוש בשיפועים של Ficoll או Percoll על פני שיפועים של סוכרוז יעזרו44,45,46. שיטות אלה גם להפחית את הזיהום באופן משמעותי. הפרוטוקול המקורי של ויטאקר הניב SVs באיכות גבוהה. אופטימיזציה נוספת של Nagy et al.23, הכלולה בשיטה זו, מייצרת SVs עם הומוגניות וטוהר יוצאי דופן מבלי להתפשר באופן משמעותי על התשואה36. אם תת-סוגים ספציפיים של SV מעניינים, כגון גלוטמטרג'י (מכיל VGLUT-1) או GABAergic (המכיל VGAT-1) SVs, ניתן לבצע בידוד חיסוני באמצעות נוגדנים ספציפיים47,48. שיטות חלופיות זמינות גם לבידוד CCVs מסינפטוזומים, אשר, בשל צפיפות דיפרנציאלית, לא יכול להיות נוכח באותו ממשק כמו SVs שהושגו בשיטה זו20,49,50.
באופן כללי, ניתן לייעל עוד יותר את הפרוטוקול הנוכחי לבידוד רכיבים סינפטיים כדי להשיג שברים עם הומוגניות וכדאיות משופרות בהתבסס על האיכות והכמות של רקמת המוח המקורית ומטרות הניסוי. לפרטים נוספים על פתרון בעיות, יש לעיין בפרקי הספר מאת דאנקלי ורובינסון22 וגנזלה ואחרים 36.

סינפסות הן היחידות החישוביות הבסיסיות של המוח שדרכן נוירונים מתקשרים ומפעילים פונקציות מגוונות ומורכבות להפליא. סינפסות הן, אם כן, היסוד לבריאות המוח1; תפקוד לקוי של המערכת הסינפטית מעורב כמקור או תוצאה של הפרעות רבות2. סינפסות נוצרות על ידי טרמינלים טרום ואחרי סינפטיים, הרחבות של שני נוירונים שונים המופרדים זה מזה ומופרדים על ידי שסע סינפטי שחוצה על ידי מולקולות הידבקות סינפטיות. המידע זורם מהתא הקדם-סינפטי והפוסט-סינפטי בצורה של שליחים כימיים הנקראים נוירוטרנסמיטורים1. התהליכים המולקולריים המעורבים בהעברה עצבית הם תחומי מחקר פעילים 3,4,5. הבנת התהליכים הפתוגניים בתוך הטרמינלים הסינפטיים ותגובת הסינפסות לפתולוגיה בתת-תאים עצביים אחרים הם צעדים חיוניים לטיפול בהפרעות במוח 1,2. מספר פיתוחים מתודולוגיים, המיושמים בעיקר על מודלים של מורין, קידמו את המרדף הזה6. הבידוד של שברים סינפטיים על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית הוא שיטה אחת כזו לשינוי פרדיגמה שאפשרה הערכה מפורטת של תהליכים סינפטיים בבריאות ובמחלות.
המוח האנושי הבוגר מורכב מ-80-90 מיליארד נוירונים 7,8. בקרב מיני מורין, מוח החולדה מכיל כ~200 מיליון נוירונים, בעוד שלעכברים יש ~70 מיליון 9,10. כל תא עצב יוצר אלפי קשרים סינפטיים ספציפיים עם רשת של נוירונים מקוטבים מאוד המשולבים עם תאי גליה וכלי דם צפופים. ברקמה כה מורכבת והטרוגנית, פעם לא היה עולה על הדעת לבודד ולחקור סינפסות כמערכת עצמאית. בשנות ה-60 של המאה ה-20, ויקטור ויטאקר, קתרין הב ואחרים אפשרו זאת על ידי בידוד מסופים סינפטיים שלמים באמצעות פיצול תת-תאי 11,12,13,14. בניסיון לבודד שלפוחיות סינפטיות (SVs), הם הומוגניים במוחם באמצעות כוח גזירה נוזלי בסוכרוז איזו-אוסמוטי (0.32 M) ואחריו אולטרה-צנטריפוגציה. הם השיגו מסופי עצבים או דליות מכווצים, סגורים בקרום פלזמה, שלמים, שאותם כינו חלקיקים קצות עצבים (NEPs)11,13. מכיוון שהמאפיינים המבניים והתפקודיים של הסינפסה נשמרו במבנים אלה, NEPs כונו מאוחר יותר "סינפטוזומים" עבור התאמה עם אברונים תת-תאיים אחרים13,15. ראוי לציין כי עבודתם של אדוארדו דה רוברטיס ועמיתיו, שטבעו את המונח "שלפוחית סינפטית", חפפה לזו של ויטאקר ועמיתיו ותרמה לאימות של בידוד ואפיון "סינפטוזום"16,17,18.
סינפטוזומים הם מבנים פעילים פיזיולוגית המכילים את כל התכונות התאיות והמולקולריות הדרושות לאחסון, שחרור וספיגה מחדש של מוליכים עצביים13,18. שימור המאפיינים הסינפטיים המרכזיים במבחנה והחופש מרכיבים שאינם סינפטיים תורמים גם הם לתועלת של שיטת בידוד זו. סינפטוזומים תרמו רבות להבנת התכונות הכימיות והפיזיולוגיות של העברה עצבית וכעת הם משמשים לחקר תהליכים מולקולריים סינפטיים והשינויים שלהם במחלות 19,20,21,22,23. סינפטוזומים הם גם חומר המקור הראשוני לבידוד רכיבים סינפטיים כגון SVs, שלפוחיות מצופות קלתרין (CCVs), ציטוזול סינפטי, קרום פלזמה סינפטי, מיטוכונדריה סינפטית, מולקולות הידבקות סינפטיות ומרכיבים מעניינים אחרים, אשר יכולים להקל על הבנת המנגנונים המולקולריים של תפקוד סינפטי 18,19,20,24,25,26, 27,28. רכיבים תת-סינפטיים אלה יכולים להתקבל על ידי התזה האוסמוטית של סינפטוזומים ואולטרה-צנטריפוגציה של צפיפות סוכרוז15,29. למרות ששיטת הפיצול התת-תאית המקורית של קבוצת המחקר של ויטאקר ידועה כיעילה בבידוד סינפטוזומים איכותיים ו-SVs 13,30, אופטימיזציות אחרונות משפרות את טוהר השברים התת-תאיים 22,23,31,32. מאמר זה מספק גרסה מפורטת ונגישה ביותר של פרוטוקול קלאסי לפיצול תת-תאי של רקמת מוח מורין לבידוד סינפטוזומים, SVs ורכיבים תת-סינפטיים אחרים.

<table><tbody><tr><td>1 מ"ל מזרק TB</td><td>BD</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות אפנדורף</td><td>ארה"ב סיינטיפיק</td><td>1415-2500</td><td></td></tr><tr><td>14 מ"ל, צינור פתוח דק דופן אולטרה ברור</td><td>בקמן קולטר</td><td>344060</td><td>תואם SW 40 Ti</td></tr><tr><td>23 מד דיוק גלישה מחט היפודרמית</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>26.3 מ"ל, בקבוק פוליקרבונט עם מכלול כובע</td><td>בקמן קולטר</td><td>355618</td><td>תואם ל-Ti70</td></tr><tr><td>3.5 מ"ל, צינור פוליפרופילן עבה קיר פתוח</td><td>בקמן קולטר</td><td>349623</td><td>תואם ל-TLA-100.3</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות פלקון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 יחידת מסנן צנטריפוגלי&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6279</td><td>1 מ"ג/מ"ל ב-diH2O</td></tr><tr><td>Avanti J-26 XP צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>B22984</td><td>< 26,000 סל"ד</td></tr><tr><td>ספסל HDPE Dewar בקבוק</td><td>תרמו מדעי</td><td>5028U19</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J עכברים</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628168</td><td>< 14,000 סל"ד</td></tr><tr><td>שלם, מיני, ללא EDTA מעכב פרוטאז טבליות קוקטייל</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>הוסף טבליה אחת לכל 50 מ"ל תמיסה</td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11273-20</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>עדינים כלי מדע עדינים</td><td>8r</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Col מערכת הומוגניזציה של רקמות</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-04369-15</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים Graefe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11650-10</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה תחתונים עגולים מפוליקרבונט במהירות גבוהה</td><td>ThermoFisher</td><td>3117-0500</td><td>תואם ל-JA20</td></tr><tr><td>איזופלואורן</td><td>הנרי שיין בריאות בעלי חיים</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>JA-20 רוטור</td><td>בקמן קולטר</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>לופפטין</td><td>אמריקן ביו</td><td>AB01108</td><td>1 מ"ג/מ"ל ב-diH2O</td></tr><tr><td>N-[2-הידרוקסיאתיל] פיפרזין-N'-[2-חומצה אתנסולפונית] (HEPES)</td><td>אמריקן ביו</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>אופטימה L-80 XP אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td>< 100,000 סל"ד</td></tr><tr><td>אופטימה TLX אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td> 120,000 סל"ד</td></tr><tr><td>פפסטין A</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>1 מ"ג/מ"ל ב-DMSO</td></tr><tr><td>פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)</td><td>American Bio</td><td>AB01620</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA ערכת בדיקת חלבון</td><td>Thermo Scientific</td><td>23335</td><td>לקביעת ריכוז החלבון</td></tr><tr><td>קצות</td><td></td><td></td><td></td>פיפטות</tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti רוטור דלי מתנדנד</td><td>בקמן קולטר</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>מטחנת רקמות עלי וטיט מצופה טפלון</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>3431D94</td><td></td></tr><tr><td>Ti70 רוטור</td><td>בקמן קולטר</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 רוטור</td><td>בקמן קולטר</td><td>349490</td><td></td></tr><tr><td>אקדח צינור</td><td>נקודה מדעית</td><td>DTR-02VS</td><td></td></tr></tbody></table>

פיצול תת-תאי לבידוד רכיבים סינפטיים ממוח מורין

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

מסופים סינפטיים הם האתרים העיקריים של תקשורת עצבית. תפקוד לקוי של סינפטי הוא סימן היכר של הפרעות נוירופסיכיאטריות ונוירולוגיות רבות. אפיון תת-התאים הסינפטיים על ידי בידוד ביוכימי הוא, אם כן, שיטה רבת עוצמה להבהרת הבסיסים המולקולריים של תהליכים סינפטיים, הן בבריאות והן במחלות. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של הדקים סינפטיים ותת-תאים סינפטיים ממוחות עכברים על ידי פיצול תת-תאי. ראשית, מבנים סופניים סינפטיים, המכונים סינפטוזומים, מבודדים בעקבות הומוגניזציה של רקמת המוח. סינפטוזומים הם תאים עצביים טרום ואחרי סינפטיים עם ממברנות מכווצות ואטומות. מבנים אלה שומרים על מצב פעיל מטבולית והם בעלי ערך לחקר המבנה והתפקוד הסינפטי. לאחר מכן, הסינפטוזומים נתונים לתזה היפוטונית ול-ultracentrifugation כדי לקבל תת-תאים סינפטיים מועשרים עבור שלפוחית סינפטית, ציטוזול סינפטי וממברנת פלזמה סינפטית. טוהר השברים מאושר על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים וניתוח העשרה ביוכימית עבור חלבונים ספציפיים לתאים תת-סינפטיים. השיטה המוצגת היא כלי פשוט ובעל ערך לחקר המאפיינים המבניים והתפקודיים של הסינפסה והאטיולוגיה המולקולרית של הפרעות מוחיות שונות.

השיטה המוצגת מביאה ל-11 שברים תת-תאיים במוח שיכולים להיות נתונים לטיהור נוסף ולצורות שונות של ניתוח במורד הזרם35,36. שיטת תקן הזהב להערכת האיכות של סינפטוזומים, SVs23 ורכיבים אחרים היא מיקרוסקופיית אלקטרונים (EM) (איור 7). ניתן גם לבצע אימונובלוטינג כמותי עבור חלבונים שנמצאים בשברים תת-תאיים ספציפיים כדי להעריך סמנים של טוהר שברים (איור 8). לדוגמה, ניתוח אימונובלוט של שברים חושף את ההעשרה של N-cadherin (CDH2, שם UniProt) בשבר קרום הפלזמה הסינפטי (SPM), α-סינוקלאין (SYUA) בציטוזול הסינפטי (LS2), סינפטופיזין (SYPH) בשבר השלפוחית הסינפטית (LP2), וחלבון בסיסי של המיאלין (MBP) בשבר המיאלין (MF) בהשוואה לרמות חלבון בהומוגנט הראשוני של המוח השלם (סה"כ) (איור 8 ). לאחר שנקבע טוהר השבר (לדוגמה, שים לב להיעדר CDH2 בשבר LS2 או לעלייה הגדולה פי כמה ב- SYPH בשבר LP2), ניתן להשתמש באימונובלוטינג כמותי כדי לקבוע את לוקליזציה של חלבונים בעלי עניין או הבדלי שאילתה בהתפלגות החלבונים בין גנוטיפים או טיפולים. הבנת הלוקליזציה התת-תאית של חלבונים סינפטיים יכולה לאפשר ניתוח של פונקציות חלבון שלא תוארו קודם לכן. יתר על כן, שיטה זו עשויה להבהיר פגמים בסחר בבני אדם או תפקוד לקוי של המערכת במצבי מחלה, במיוחד בשילוב עם מבחנים פונקציונליים. לדוגמה, הצוות שלנו השתמש בשיטה זו כדי לזהות מאגר של חלבון פלמיטואיל פעיל אנזימטית thioesterase 1 המועשר בציטוזולסינפטי 19.
<img alt="ניתוח אולטרה-מבנה של תאים; מיקרוגרפיה אלקטרונית של אברונים, מחקר ביולוגיה של התא, מחקר מבני." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> איור 7: מיקרוסקופיית אלקטרונים (EM) של סינפטוזומים. (A) תמונת EM מייצגת של סינפטוזום המכיל שלפוחיות סינפטיות (חץ). (B) תמונת EM מייצגת של סינפטוזום עם רכיבים קדם-(חץ) ופוסט-סינפטיים (חץ כפול). (C) תמונת EM מייצגת של סינפטוזום המכיל שלפוחיות סינפטיות ומיטוכונדריה (חץ) (פסי קנה מידה = 100 ננומטר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="פיצול חלבון; ניתוח CDH2, MBP; כתם ג'ל ותרשים עמודות; העשרת סמן; השוואת נתונים." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig08.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> איור 8: ניתוח אימונובלוט של שברים תת-תאיים. (A) סמנים של טוהר שברים תת-תאיים (מסומנים במינוח UniProt) ממוקמים כראוי בהשוואה להומוגנט של המוח כולו (סה"כ): N-cadherin (CDH2) בשבר קרום הפלזמה הסינפטי (SPM), סינפטופיזין 1 (SYPH) וסינפטוג'אנין 1 (SYNJ1) בשבר המועשר בשלפוחית הסינפטית (LP2), α-סינוקלאין (SYUA) בציטוזול הסינפטי (LS2), וחלבון בסיסי של המיאלין (MBP) בשבר המיאלין (MF). (B) ניתוח כימות אימונובלוט חושף את ההעשרה (שינוי קיפול מסך הכל) של סמני טוהר שברים. הנתונים מיוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± בסולם log10. הקו המקווקו מציין שינוי של פי 1.5 (y = 0.176) (n = 3 ניסויים משוכפלים עם 8 עכברים מסוג בר; גיל = חודשיים; n = 4-5 כתמים עבור SYPH, SYUA, MBP, עם n = 3 ערכים מתווכים שפורסמו בעבר על ידי Gorenberg et al.19; n = 5 עבור SYNJ1; n = 1 עבור CDH2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

פרוטוקול זה מציג שיטה חזקה ומפורטת להשגת סינפטוזומים טהורים ביותר, שלפוחיות סינפטיות ושברים סינפטיים אחרים ממוח העכבר. שיטה זו מאפשרת הערכה של תהליכים סינפטיים, כולל ניתוח ביוכימי של לוקליזציה ותפקוד חלבונים ברזולוציה מדורית.

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological ...

סינפסות הן היחידות החישוביות הבסיסיות של המוח. השיטה המוצגת היא כלי פשוט ובעל ערך לחקר הסינפסות והתהליכים המולקולריים שלהן וגם להבנת האופן שבו הן עשויות להשתנות בהפרעות מוחיות שונות. טכניקה זו כוללת שבירה של מבנים סינפטוזומים מבודדים מהמוח.זה מאפשר לחוקר ללכוד אפקטים שעשויים להיות ממודרים בסינפסה. ניתן לנתח גם את רמות ההתפלגות והפעילות של חלבונים ספציפיים ברזולוציה תת-סינפטית. הליך זה לוקח בערך 11 שעות עבור חוקר בודד להשלים אם הכל הולך בצורה חלקה.אדם שמעולם לא ביצע טכניקה זו עשוי להתקשות עם אורך הליך זה כפי שהוא באופן טבעי ייקח קצת יותר זמן עבור מישהו שאינו מכיר את השלבים. בגלל אורכו של יום ניסוי זה, אנו ממליצים בחום לבצע את הנתיחות עם שותף שיכול לעזור לך להקל על איסוף רקמות מהיר כדי להבטיח שלא יהיו דגימות על הקרח למשך זמן רב יותר מהנדרש. אנו ממליצים גם להכין מאגרים וחומרים עליונים ביום שלפני הפעלת ניסוי זה, כך שהכל יהיה בהישג יד בעת הצורך.זה נכון במיוחד עבור צינורות האיסוף. אליקוטים מרובים של סך של 11 שברים תת-תאיים ייאספו עד סוף הליך זה. אז העובדה שהצינורות האלה מסומנים בבירור מראש תהפוך את היום שלך להרבה יותר קל.כדי להתחיל, הכנס מספריים עדינים מתחת לעור בחתך העריפה לעומק גולגולתי פרי ובצע חתך סגיטלי אמצעי עד לתפר התוך-שרידי כדי להחזיר את הקרקפת מהגולגולת. בעבודה מהאזור העורפי לכיוון כל היבט טמפורלי, חותכים את החיתולית והשריר כדי לחשוף את פני השטח החיצוניים של הגולגולת מעבר לכל בשר אקוסטי חיצוני. הדקו את הקרקפת ואת ההיבט הרוסטרלי של הגולגולת ביד הלא דומיננטית וביד השנייה, החדירו מספריים עדינים שני מילימטרים לתוך הצד הקאודאלי של הפורמן מגנום שבו חוט השדרה נראה יוצא.בצע חתך בקו האמצע עד שהמספריים מגיעים לפני השטח הפנימיים של העצם התוך-קודקודית. שנה את זווית המספריים כך שהלהבים יפעלו במקביל למשטח הגבי של הגולגולת. ממשיכים לקדם את החתך המידסגיטלי דרך העצמות הקודקודיות והפרונטליות תוך שימוש בתפרים הסגיטליים והאינטרפרונטליים כמדריך ומסיימים את החתך ממש מעבר לתפר הבין-סנסלי.לאחר מכן, בצע חתך מאונך של שלושה מילימטרים לעצם האף, רוסטרלי לתפר הבין-נקבי, על ידי הנחת המספריים בניצב לגולגולת כאשר כל להב ממוקם בתפר קדם-מקסילרי באף והפיכת חתך אחד אחיד. תוך שמירה על ההיבט הרוסטרלי, השתמש בצד אחד של זוג מלקחיים בעלי מרקם כדי להרים בעדינות את הגולגולת מהמוח ולאחר מכן להרים אותה לרוחב ולגחון. חזרו על הפעולה לאורך קו האמצע לפי הצורך, ולאחר מכן בחצי הכדור השני עד שכל פני השטח של המוח נחשפים.באמצעות מלקחיים מעוקלים או מרית עדינה מרימים בעדינות את הצד הרוסטרלי של המוח. חותכים את עצבי הראייה והגולגולת כדי להשלים את הכריתה מהגולגולת. הומוגניות המוח באמצעות זכוכית מורדת הומוגנייזר המונח על אמבט קרח ב 12 למעלה למטה עובר ב 500 סל"ד.השהה לזמן קצר בכל מכת מטה כדי להבטיח הומוגניזציה יסודית של הרקמה. מעבירים את המוח הכולל לצינור צנטריפוגה תחתון עגול במהירות גבוהה של 14 מיליליטר ומסובבים אותו ב-800 G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להשיג את הסופר-נטנט המכונה S1.העבר S1 לצינור צנטריפוגה חדש, השליך את הכדור. קח שניים חמישה מיקרוליטר אליקוטים של S1 עבור בדיקת חומצה bicinchoninic ושני 100 microliter aliquots של S1 עבור הכתם המערבי.סובב S1 ב 9, 000 G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל את supernatant סומלי סינפטי, או S2, ואת גלולה סינפטוזום גס או P2. קח שניים, 10 מיקרוליטר aliquots של S2 עבור בדיקת חומצה bicinchonic ושני 500 microliter aliquots של S2 עבור כתם המערבי. השליכו את הסופר-נאטנט לאחר קבלת האליקוטים. לאחר צנטריפוגה ב 9, 000 G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשיג את S2's supernatant ו שטף סינפטוזום, P2'להשליך את supernatant ו resuse P2'in שלושה מיליליטר של חיץ A.הימנע החייאת החלק האדום כהה בתחתית הכדור, אשר מכיל בעיקר מיטוכונדריה.קח שני 20 מיקרוליטר aliquots של P2'עבור בדיקת חומצה bicinchonic ושני 100 microliter aliquots של P2'עבור הכתם המערבי. עבור התזה היפוטונית של סינפטוזום שטף להוסיף תשעה כרכים של חיץ צונן B כדי להשעות מחדש P2's הומוגניות את הסינפטוזום בכוס למטה הומוגנייזר. מעבירים את הדגימות לצינורות צנטריפוגה חרוטיים בקוטר 50 מיליליטר ומסובבים אותן על אקדח צינור בחדר קר של ארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.צנטריפוגה P2'at 25, 000 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל את lysis supernatant או LS1, ואת כדור ליזיס המכיל ממברנות סינפטוזומליות, או LP1. קח שניים, 50 מיקרוליטר אליקוטים של LS1 עבור בדיקת חומצה bicinchoninic ושני 400 microliter aliquots של LS1 עבור הכתם המערבי. העבר את LS1 לתוך צינור צנטריפוגה מכוסה עבור צנטריפוגה אולטרה.צנטריפוגה LS1 ברוטור אולטרה צנטריפוגה בזווית קבועה ב 100, 000 G במשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל ציטוזול סינפטי supernatant, או LS2, וכדור שלפוחית סינפטית, או LP2. יש להשעות את LP2 ב-500 מיקרוליטרים של חיץ A ולהשתמש במחט של 23 מדים ובמזרק של מיליליטר אחד עם טריטורציה עדינה. קח שניים, 10 מיקרוליטר aliquots של LP2 עבור בדיקת חומצה bicinchoninic ושניים, 250 microliter aliquots של LP2 עבור הכתם המערבי.מעבירים כ-30 מיליליטר של LS2 ליחידות סינון צנטריפוגליות עם ניתוק של 10 מילי-דלטון ומרכזים את ה-LS2 לכ-0.5 מיליליטר על ידי סיבוב ב-5, 000 גרם למשך עד שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. קח שניים, 10 מיקרוליטר aliquots של LS2 מרוכז עבור הבדיקה bicinchoninic, ושניים, 250 microliter aliquots של LS2 מרוכז עבור הכתם המערבי. יש להשעות את ה-LP1 במיליליטר אחד של חיץ B, ולקחת שניים, 10 מיקרוליטר אליקוטים של LP1 לבדיקת החומצה הביצ'ונית, ו-50 מיקרוליטר אליקוטים של LP1 עבור הכתם המערבי.התאם את ה-LP1 הנותר לנפח סופי של 7.5 מיליליטר, וריכוז סוכרוז סופי של 1.1 טוחנת עם חיץ B וחיץ C.לאחר מכן העבר 7.5 מיליליטר של LP1 החייאה לתוך צינור אולטרה צנטריפוגה של 14 מיליליטר. שכב בזהירות את LP1 עם 3.75 מיליליטר של חיץ D וסמן את החלק העליון של התמיסה עם עט. לאחר מכן שכבה עם כ 1.25 מיליליטר של חיץ A.ובאופן דומה לסמן את החלק העליון של התמיסה עם עט.אזנו את הצינורות להיפר-צנטריפוגה לפי משקל, לא לפי נפח, עם תוספת טיפה של חיץ A ל-10 מיליגרם. צנטריפוגה ב 48, 000 G במשך 2.5 שעות בארבע מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד אולטרה צנטריפוגה ולקבל תמונות של שיפועים שלמים כדי לתעד את הייחודיות של כל ממשק סוכרוז ואת ההצלחה של פיצול. הסר בזהירות את השכבה השטחית של סוכרוז 320 מילימולאר ושחזר את חלק המיאלין בממשק 320 מילימולר, 855 מילימולאר סוכרוז בנפח 800 מיקרוליטר.צניחה מדופן הצינורות בצורה מעגלית כדי להבטיח את איסוף החלק השלם. לאחר מכן לשחזר את שבר SPM ב 855 מילימולאר, 1.1 מילימולר סוקרוז ממשק בנפח 1000 מיקרוליטר. שאפו בזהירות את הסוכרוז הנותר ושחזרו את הכדור המיטוכונדריאלי על ידי החייאת 200 מיקרוליטרים של חיץ B.דללו את חלק ה- SPM עם שני נפחים של חיץ B, ולאחר מכן צנטריפוגה ברוטור זווית קבועה בצינור צנטריפוגה של 3.5 מיליליטר.יש להשליך את ה-supernatant ולהשהות מחדש את גלולת ה-SPM במאגר A לקבלת נפח סופי של 250 מיקרוליטרים. קח שניים, חמישה מיקרוליטרים aliquots של SPM עבור בדיקת חומצה bicinchoninic ולחלק את SPM הנותרים לשניים עבור כתם מערבי. תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים של סינפטוזום מוצגות באיור זה.סינפטוזום המכיל שלפוחיות סינפטיות הן מרכיבים קדם-סינפטיים והן רכיבים פוסט-סינפטיים ושלפוחיות סינפטיות במיטוכונדריה מוצגים כאן. ניתוח אימונובלוט של שברים תת-תאיים בוצע כדי להעריך סמנים של טוהר שברים. בהשוואה להומוגנט המוח השלם הראשוני, הניתוח גילה את ההעשרה של n-cadherin בחלק קרום הפלזמה הסינפטית, אלפא סינוקלאין בציטוזול הסינפטי, סינפטופיזין בשבר השלפוחית הסינפטית, וחלבון בסיסי מיאלין בשבר המיאלין.לאחר קביעת טוהר השברים, ניתן להשתמש באימונובלוטינג כמותי כדי לקבוע את לוקליזציה של חלבונים בעלי עניין, או לשאול הבדלים בהתפלגות החלבונים בין גנוטיפים או טיפולים. בעת ניסיון הליך זה, הקפד להשתמש בכלי זכוכית ללא חומרי ניקוי, כך שניתן יהיה לאסוף סינפטוזום שלם. כמו כן, היזהר בעת הכנת שיפועים של סוכרוז כדי להבטיח שתקבל ממשקים ברורים.זה יאפשר לך לבודד בהצלחה את שבר קרום פלזמה סינפטי. ניתן לבצע אנליזות מבניות ותפקודיות שונות כדי לסייע לאיכות של שברים סינפטיים כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים, אימונובלוטציה, פרוטאומיקה ושיטות מולקולריות אחרות. שחרור נוירוטרנסמיטר או בדיקות אנזימטיות יכולים להתבצע גם כדי לסייע לכדאיות המטבולית של סינפטוזום.הבידוד של מבנים סינפטוזומים היה טכניקה לשינוי פרדיגמה לניתוח תפקוד והרכב הסינפסה. כפי שאנו רואים תפקוד סינפטי מוקדם בניוון עצבי, דיסקציה זהירה של שינויים מולקולריים ברמת הסינפסה תעזור לנו לחקור את המנגנונים המולקולריים של הפרעות אלה.

subcellular-fractionation-for-isolation-synaptic-components-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה להכין פעיל translationally, synaptoneurosomes שלם (SNS) של קליפת המוח עכבר מתואר. השיטה משתמשת שיפוע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות המאפשרת הכנה מהירה של פעיל SNS.

הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

בסרטון זה אנו מבצעים בידוד של תאים חד-גרעיניים ממוחו של עכבר באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. תרחיף התא החד-גרעיני המבודד יכול לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם.

בידוד תאים חד-גרעיניים ממוח עכבר: טכניקת צנטריפוגה של שיפוע צפיפות לבידוד תאים חד-גרעיניים שוכני מוח

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי עצב המסומנים באופן פלואורסצנטי ממוח עכבר.

בידוד תאי עצב המסומנים באופן פלואורסצנטי ממוח מורין

מאמר זה מפרט את ההעשרה של חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז רציף. ההכנה הבאה של חלבוני צפיפות פוסט סינפטי מתואר גם. הכנות חלבון מתאימות למערבי סופג או ניתוח 2D DIGE.

הכנת Synaptic פלזמה ממברנה וחלבוני צפיפות Postsynaptic באמצעות שיפוע סוכרוז רציף

זיהוי מולקולות ומסלולים השולטים בגמישות הסינפטית ובזיכרון הוא עדיין אתגר מרכזי במדעי המוח. כאן, מתואר תהליך עבודה המתייחס לכימות היחסי של חלבונים סינפטיים המעורבים כביכול בארגון מחדש מולקולרי של סינפסות במהלך למידה וגיבוש זיכרון בפרדיגמת למידה שמיעתית.

גבוהה פרופיל Proteome Synaptic החלטה כמותי של אזורים במוח העכבר לאחר למידה אפליה שמיעתית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים.

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

חשמל התקף (ECS) הוא מודל חיה ניסיוני של נזעי חשמל עבור דיכאון חמור. ECS מעוררת באופן גלובלי פעילות ההיפוקמפוס, המוביל synaptogenesis פלסטיות סינפטית. כאן, אנו מתארים שיטות עבור ה-ECS אינדוקציה בחולדות, fractionation subcellular של hippocampi שלהם כדי לבחון שינויים התקף-induced חלבונים סינפטיים.

חשמל התקפים חולדות ו Fractionation של Hippocampi שלהם כדי לבחון תפיסה-induced שינויים בחלבונים Postsynaptic צפיפות

כאן, אנו מתארים גישה כמותית לקביעת ההתפלגות של חלבון סינפטית יחסית חלבון סמן באמצעות צביעת immunofluorescence ', ' מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח מבוססת מחשב.

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

פרוטוקול דיסוציאציה של תאים עצביים זה מיועד לדגימות עם כמות נמוכה של חומר התחלתי ומניב תרחיף חד-תאי בר-קיימא ביותר לניתוח במורד הזרם, עם שלבי קיבוע וצביעה אופציונליים.

דיסוציאציה מכנית ואנזימטית משולבת של רקמת היפוקמפל במוח העכבר

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות שינויים גלובליים בהיסטון באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח. העבודה מכילה גם את פרוטוקול בידוד תאי המיקרוגליה ששימש לאיסוף נתונים.

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר

למד פיצול תת-תאי לבידוד רכיבים סינפטיים ממוח עכברים. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מולקולרי מדויק של חלבונים סינפטיים ותפקודם במחלות נוירולוגיות שונות.

פיצול תת-תאי לבידוד רכיבים סינפטיים ממוח מורין

גלה סרטונים נוספים