בדיקת אימונותרפיה לסרטן במודל עכבר אנושי הנושא גידולים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר את הדור של מערכת החיסון האנושית, או עכברי HIS למחקרים אימונו-אונקולוגיים פרה-קליניים. מודלים של סרטן עכברים מוגבלים במגוון שלהם ומתורגמים בצורה גרועה למרפאה. טכניקה זו משמשת כמודל פרה-קליני למחקרים אימונותרפיים על ידי הערכת הטיפול בגידולים אנושיים בעכבר עם מערכת חיסון אנושית.

מודל העכבר האנושי יכול לשמש לחקר היבטים רבים של אימונולוגיה אנושית, כולל תגובות לזיהומים רבים, או סרטן של מערכת החיסון האנושית. השגת מקור אמין וחזק של דם טבורי ושמירה על בריאותה של מושבת עכברים מדוכאי חיסון יכולה להיות מאתגרת. מומחיות בציטומטריית זרימה וניתוח אימונולוגי היא חיונית.

מי שתדגים את ההליך תהיה קריסטינה לארסן, אשת מקצוע בתחום שירותי המחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להשעות מחדש את גלולת התא החיובי CD34 שבודד מדם טבורי ב 300 מיקרוליטר של מאגר מפריד תאים מגנטי לכל אחד כפול 10 לתאים השמיני. הוסף 100 מיקרוליטר של מגיב חוסם FCR לכל אחד כפול 10 לתא השמיני, ואחריו 100 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים חיוביים CD34 לכל אחד כפול 10 לתאים השמיני, ודגור בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של מאגר מפריד תאים מגנטי לכל אחד כפול 10 לתא השמיני, והסתובב ב 360 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. חזור על שלב השטיפה והשהה מחדש את הגלולה ב 500 מיקרוליטר לכל 100 מיליון תאים של חיץ מפריד תאים מגנטי בצינור חרוטי 15 מיליליטר המסומן unfractionated. תייגו שתי שפופרות נוספות של 15 מיליליטר, CD34 שלילי וחיובי CD34 הניחו את שלושת הצינורות על מדף קירור.

הפרד את התאים באמצעות תוכנית הבחירה החיובית של שתי עמודות על מפריד תאים מגנטי אוטומטי בארון בטיחות ביולוגית. לאחר מכן, להרחבה והקפאה של תאי גזע אנושיים חיוביים ל- CD34, הכינו דם טבורי, או מדיום CB כמתואר בכתב היד, ועברו דרך מסנן 0.22 מיקרון. להשעות מחדש את התאים החיוביים CD34 ב 100, 000 למיליליטר של CB בינוני, ולדגור ב 37 מעלות צלזיוס.

ביום השלישי, הוסיפו נפח שווה של CB בינוני ללא ציטוקינים לצלוחית. ביום החמישי, קצור את התאים המורחבים CD34 חיוביים. פיפטה את תרחיף התא למעלה ולמטה, ולאסוף בצינור חרוטי 50 מיליליטר.

מוסיפים מספיק CB בינוני כדי לכסות את החלק התחתון של הצלוחית. באמצעות מגרד התא, לגרד את כל החלק התחתון של הצלוחית. לאסוף את כל המדיה לתוך אותו צינור 50 מיליליטר, וצנטריפוגה.

להשהות מחדש את התאים בשני מיליליטר של CB בינוני, וצנטריפוגה. שאפו את התווך עד הכדור, ותלו את הגלולה מחדש בתווך הקפאה. לאחר מכן, התחל הכנת תאים חיוביים CD34 שלוש שעות לאחר הקרנת גור.

חם 10 מיליליטר של מדיה CB בצינור 50 מיליליטר. אחזר בקבוקון אחד של תאים חיוביים ל- CD34 מורחבים וקפואים במבחנה לכל ארבעה עד שישה גורים להזרקה. הפשירו במהירות בטמפרטורה של 50 עד 55 מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לראות רק כמות קטנה של קרח, והוסיפו את התאים לתווך CB המחומם.

השתמש מיליליטר אחד של בינוני כדי לשטוף כל בקבוקון, ולסובב את התאים ב 360 גרם במשך 12 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את המדיום בזהירות. להשהות מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של מדיה CB ולספור את התאים.

שוב, צנטריפוגות את התאים, שאפו את המדיום, והשעו מחדש את הגלולה ב -100 מיקרוליטר של PBS סטרילי לכל n ועוד גור אחד להזריק, וכתוצאה מכך 250, 000 עד 450, 000 תאים חיוביים CD34 לכל עכבר. לבידוד PBMC מדם עכברים, יש לערבב את הפרין הדם על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה, ולאט לאט לכסות על גבי 500 מיקרוליטר של שיפוע צפיפות של 1.077 גרם למיליליטר תוך זהירות שלא להפריע לממשק. צנטריפוגה את הצינור ב 1, 220 גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ללא הפסקות.

מוציאים כמה שיותר תאים מהציפוי הבאפי עם פיפטה של 200 מיקרוליטר, ומוסיפים לצינור החדש של 1.5 מיליליטר המכיל 750 מיקרוליטר של מדיום הקציר. צנטריפוגה ב 360 גרם במשך 11 דקות. שואפים את המדיום ל-50 מיקרוליטר, ומשעימים מחדש את הגלולה ב-750 מיקרוליטר של מדיום הקציר.

רכוש את הנתונים עבור 100 מיקרוליטר של כל דגימה על ציטומטר זרימה. לאחר מכן ייבא את קובץ fcs לתוכנה לעריכת נתוני זרימה והחל שער מצולע על תרשים FSC-A לעומת SSC-A. שנה את הצירים ל- FSC-A לעומת FSC-H, ושער התאים באלכסון ליניארי, למעט הכפילות הבולטות מהקו.

בחר תאים אלה ושנה את הצירים ל- hCD45 לעומת mCD45. החל שער מצולע על האוכלוסייה HC45 חיובי, ולהחיל את השם אדם. החל שער מצולע על האוכלוסייה החיובית mCD45, והחל את עכבר השם.

צור סטטיסטיקת ספירה עבור אוכלוסיות בני אדם ועכברים. לאחר מכן, בחר את האוכלוסייה האנושית ושנה את הצירים ל- CD19 לעומת CD3. החל שער מצולע על התאים החיוביים ל- CD19, ותן להם שם לתאי B.

החל שער מצולע על האוכלוסייה החיובית ל- CD3, וקרא לו תאי T. לאחר מכן להחיל שער מצולע על האוכלוסייה השלילית הכפולה, ולקרוא לו non-TB. בחר את אוכלוסיית תאי T ושנה את הצירים ל- CD4 לעומת CD3.

החל שער מצולע על האוכלוסייה החיובית ל- CD4, וקרא לו CD4 חיובי. החל שער מצולע על האוכלוסייה השלילית CD4, וקרא לו CD8. בחר את האוכלוסייה שאינה שחפת, ושנה את הצירים ל- CD56 לעומת מיאלואיד.

החל שער מצולע על כלל האוכלוסייה החיובית ל- CD56, וקרא לו תאי NK. לאחר מכן להחיל שער מצולע על האוכלוסייה CD56 שלילי ומיאלואיד חיובי, ולקרוא לו מיאלואיד. צור טבלה עבור הנתונים הסטטיסטיים של אחוזים וספירה של כל האוכלוסיות, וייצא אותה לגיליון אלקטרוני.

חשב אחוז hCD45 כימריזם באמצעות הנוסחה שצוינה. לאחר גידול תאי גידול בעכבר ומתן טיפולים תרופתיים, לקצור את הרקמות. הניחו את העכבר על לוח נתיחה מוקצף עם פינים כדי להחזיק אותם במקומם והידיים והרגליים מורחבות ב-45 מעלות.

בצע חתך באמצע פלג הגוף העליון המתחיל ליד האגן ונמשך עד הסנטר. משוך את העור לקצה, והחזק אותו במקומו עם סיכות. לחלץ את בלוטות הלימפה באמצעות מלקחיים עדינים בסדר בית השחי, צוואר הרחם, mesenteric, מפשעתי, ו hiatal.

הניחו את בלוטות הלימפה בצד אחד של מגלשת הזכוכית החלבית בצלחת פטרי בשמונה מיליליטר של מדיום הקציר. מחזיקים את המגלשות בזוויות ניצבות עם הקצוות החלביים פנימה, לוחצים בעדינות על הרקמות עד לשחרור התוכן הסלולרי. שטפו את המגלשה מספר פעמים על ידי הפרדה ביניהן וביחד כדי לשחרר את מספר התאים המרבי.

אספו את התאים עם פיפטה מזכוכית בקוטר חמישה אינץ', וסננו אותם דרך פיפטה מחוברת כותנה בגודל תשעה אינץ' לצינור חרוטי מסומן של 15 מיליליטר. לאחר מכן, לחלץ את הגידול מן האגף הפתוח על ידי החזקת הגידול עם מלקחיים תוך חיתוך איטי בשולי הגידול עם מספריים דיסקציה. לשקול את הגידול ולהסיר 1/4 מהגידול לצורך עיבוד RNA ואימונוהיסטוכימיה.

מניחים את 3/4 הגידול הנותרים לתוך צלחת של שישה סנטימטרים, וטוחנים אותו לחתיכות מילימטר אחד באמצעות להב אזמל. מעבירים את חתיכות הגידול לתוך צינור דיסוציאציה. לאחר מכן שטפו את הכלי עם מדיום TIL לא שלם, והוסיפו אותו לצינור.

מוסיפים להכנת collagenase, ומנתקים את הרקמה באמצעות דיסוציאציה מכנית ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שעה. מעבירים את המתלה מעל מסנן 100 מיקרון לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר ושוטפים את המסנן עם 10 מיליליטר של מדיה מלאה TIL. צנטריפוגה והשעיה מחדש של הגלולה באמצעי קציר מספיק עם DNase, כך שתרחיף התאים יכול לעבור בקלות דרך קצה פיפטה P1000 ולהקליט את עוצמת הקול לניתוח במורד הזרם.

ב- PDX CRC 307P, הטיפול המשולב האט את צמיחת הגידול, כפי שנקבע על ידי נפחי צמיחת הגידול לאורך זמן, משקלי הגידול וקצב הצמיחה הספציפי. PDX CRC 307M שנבדק בקבוצה אחרת של עכברים הושפע פחות מאותו טיפול משולב בעכברי BRGS שלו. בהתבסס על כימריזם חיובי ל- hCD45 אנושי ותאי T אנושיים חיוביים ל- hCD3 בדם לפני השתלת הגידול, שני הפרמטרים גדלו במערכת החיסון ההיקפית וב- TIL בשילוב עם עכברים נושאי CRC 307P מטופלים, אך לא במודל CRC 307M.

חקירת תאי T אנושיים גילתה יותר תאי T פעילים בגידולי CRC 307P, אך לא את הלימפה מעכברים שטופלו בשילוב. כמו כן, היו יותר תאי T חיוביים לזיכרון CD8 ופחות תאי T חיוביים ל-TIM-3 בשילוב שטופלו בגידולי CRC 307P. לעומת זאת, הבדל זה לא צוין בדגם CRC 307M.

יתר על כן, לא נצפו שינויים בתדרים של אוכלוסיות תאי T ציטוטוקסיים בקרב העכברים המשולבים שטופלו, אם כי תאי T ציטוטוקסיים גבוהים יותר נצפו בעכברים שלא טופלו. הטיפול המשולב לא השפיע על התדירויות של Tregs באיברי הלימפה CRC 307P, או בגידולים, אם כי נתוני CRC 307M הראו מגמה של ירידה ב-Tregs. שינויים הקשורים למערכת החיסון בתאי הגידול הועלו באמצעות ציטומטריית זרימה.

ביטוי מוגבר של MHC Class I ו- Class II נצפה על תאי הגידול CRC 307P שנכרתו מעכברי BRGS משולבים שטופלו ב- HIS BRGS. במודל CRC 307M, אותו טיפול תרופתי גרם לביטוי HLA Class II על תאי הגידול. באופן דומה, הטיפול המשולב הביא לביטוי מוגבר של PD-L1 על תאי הגידול CRC 307P חיוביים ל-EpCAM.

לבסוף, נבדקו קורלציות של תגובות חיסוניות עם צמיחת הגידול. תאי T חיוביים ל- CD4 הראו מתאם מובהק עם צמיחת גידול קטנה יותר, וליתר דיוק תאי T מופעלים חיוביים HLA-DR בשילוב שטופלו בעכברי HIS . טכניקה סטרילית תוך בידוד התאים החיוביים CD34, כמו העכברים הם חיסוניים מאוד.

הכימריזם המתקבל משתנה בתוך ובין תורמי דם טבורי, ולתאי T יש את השונות הגדולה ביותר. שילובי אימונותרפיה בלתי מוגבלים יכולים להתבצע, כמו גם מחקרים מכניסטיים ומינון תרופות, למשל, מחיקה של תאי T CD8 כדי לאשר את תפקידם. חשוב לציין, ניתן גם לחקור רעילות הקשורה לסמים.

היא סיפקה מודל פרה-קליני רלוונטי ונגיש יותר לבדיקת אימונותרפיה אנושית לתרגום לקליניקה. מספר ניסויים קליניים נמצאים כעת בעיצומם בהתבסס על נתונים אלה.