יצירת תאי הרג טבעיים מתאי גזע פוטנציאליים מורחבים אנושיים

אם כבר מדברים על משמעות, יצירת תאי NK ממקור הניתן להרחבה היא קריטית עבור יישומים כגון אימונותרפיה לסרטן. היתרון של טכנולוגיה זו הוא שניתן להשתמש בתאי גזע פוטנציאליים מורחבים בעלי יכולת התמיינות רחבה יותר במקום תאי IP רגילים. עבור התמיינות מוקדמת של hEPSCs, הסר את מדיום hEPSC שבו נשמרו התאים והוסף מיליליטר אחד של מדיום DFK.

יש לדגור במשך יומיים-שלושה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כדי לבדוק את היווצרותם של גופים עובריים, לאחר הסרת מדיום DFK ביליה, לשטוף את התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של PBS. מוסיפים 500 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין ודגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שלוש עד שבע דקות, בהתבסס על המורפולוגיה.

לאחר הסרת הטריפסין, ושני מיליליטר של מדיום DFK כדי לקצור את התאים. סובבו את התאים ב-300 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת supernatant, להוסיף מיליליטר אחד של מדיום DFK ומיקרוליטר אחד של Y-27632 ולהשעות מחדש את התאים על ידי הבהוב.

לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולדלל את תרחיף התא עם מדיום DFK ו Y-27632 כדי לקבל 4, 000 תאים לכל 25 מיקרוליטר של בינוני. הניחו 30 עד 40 טיפות של תרחיף תאים על מכסה צלחת פטרי בגודל 10 ס"מ ושפכו מעט PBS לצלחת התחתונה כדי למנוע אידוי של הטיפות. הופכים בעדינות את הפקק כדי לכסות את התבשיל ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים.

לאיסוף גופי העובר מהטיפה, באמצעות פיפטה של מיליליטר המכילה PBS, יש לשאוב מעט PBS לתוך הטיפה ולשאוף החוצה את התווך, כולל הגוף העוברי. לאחר מכן, העבירו את הגופים העובריים הללו לתוך צינור של 15 מיליליטר וסובבו אותם ב-100 גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת הסופרנטנט, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום A.מעבירים את גופי העובר שנאספו לצלחת לא דבקה של 24 בארות ומחשיבים אותו ליום אפס.

כדי לבצע דפוס מזודרם של הגוף העוברי, לדגור על הצלחת במשך שלושה ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. ביום השני, להחליף 500 מיקרוליטר של מדיום A משומש עם מדיום טרי A של אותו נפח. כדי לבצע מפרט hematoendothelial של הגוף העוברי, להסיר 700 מיקרוליטר של בינוני A מן הבאר ולהוסיף את אותו נפח של בינוני B.Culture במשך שבעה ימים, שינוי חצי מדיה כל יומיים.

כדי להעביר את הגופים העובריים בדוגמת ממשק אוויר/נוזל, הטו מעט את הצלחת כך שהגופים העובריים יצטברו בתחתית, ובעזרת פיפטה של מיליליטר הסירו כמה שיותר מדיום B. עכשיו להרים את גופי העובר עם פיפטה על ידי שאיפת המדיום הנותר ולהעביר אותם לבאר טרנס בצלחת 24 בארות, כדי לבצע הרחבת אב לימפה, להוסיף 500 מיקרוליטר של מדיום NK-1 לתא התחתון של באר טרנס, תרבית במשך 14 ימים, ולבצע שינוי בינוני כל יומיים. כדי לצפות את הצלחת, מדללים את חומר הציפוי ב-PBS, מוסיפים מיליליטר אחד של תמיסת ציפוי מדוללת לכל באר של צלחת בת 12 בארות, ומכסים את פתח הצלחת בסרט עטיפה.

דוגרים על הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. הוסיפו 200 מיקרוליטר של PBS לבאר הטרנס-באר ולאט לאט פיפטה מעלה ומטה בערך חמש עד שש פעמים כדי לקצור את התאים ששוחררו מהאורגנואידים. מעבירים את תרחיף התאים שנקטף לצינור של שני מיליליטר ומסובבים את התאים ב-500 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הסרת supernatant, להשעות מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום NK-1. מוציאים את כל תמיסת הציפוי מהבאר ושוטפים כל באר של צלחת בת 12 בארות במיליליטר אחד של PBS פעמיים. לאחר מכן, לפצל את התאים שנקטפו ביחס של 1:2 ולהעביר את תרחיף התא על צלחת מצופה 12 בארות.

הוסף מיליליטר אחד של מדיום NK-1 כך שלכל באר יש 1.5 מיליליטר של מדיום. לשינוי התווך, אפשרו לתאים לשקוע לתחתית למשך דקה עד שתיים. לאחר מכן, שאפו בזהירות החוצה 750 מיקרוליטר של מדיום וסובבו אותו כלפי מטה כפי שהודגם קודם לכן.

לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה המתקבלת ב 750 מיקרוליטר של מדיום NK-1 על ידי פיפטינג חמש עד שש פעמים והעבר אותו לבאר המקורית. במחקר הנוכחי נותחו המוצרים שמקורם ב-hEPSC בנקודת הקצה. כ -15% מהתאים שנותקו ממערכת התרבית התלת-ממדית משתי אצוות שהושרו בנקודות זמן שונות היו CD3-שלילי, CD56-חיובי, ו -16% מהתאים היו CD45-חיובי, CD-56-חיובי, אשר עולה בקנה אחד עם אחוז התאים CD3-שלילי, CD56-חיובי שנצפה בניסויים קודמים.

אחוז התאים החיוביים ל-CD3 ו-CD56 בתאים שנקצרו ממערכת התרבית הדו-ממדית נע בין 30% ל-6%המוצרים שמקורם ב-hEPSC במהלך תרבית היום ה-18 ממערכת דו-ממדית הראו ביטוי של CD56 חוץ רחמי ו-CD107a ב-12% מהתאים לאחר שעתיים של גירוי נוגדנים, וכ-28% מהתאים שנקטפו היו חיוביים ל-CD94, CD159a חיובי. מוצרי התמיינות חוץ גופית נבדקו עבור ציטוטוקסיות נגד תאי אריתרולוקמיה אנושיים K562. כאשר הם מתורבתים יחד עם מטרות הגידול במשך שלוש שעות, המוצרים המובחנים מציגים ציטוטוקסיות קלה בהשוואה לתאי קו תאים קבועים בלתי תלויים באינטרלוקין 2 NK92mi.

בעקבות שיטה זו, תאים כגון תאי T, תאי B ואריתרוציטים יכולים להיווצר.