Name: השתלה והערכה של מלנומה בכורואיד מורין באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: למד שתלת ומעקב אחר מלנומה בכורואיד עכברים באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית. שיטה זו מאפשרת הערכה מיידית של הצלחת ההזרקה ומעקב רציף אחר צמיחת הגידול בחיות חיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק 1304/20 מהקרן הלאומית למדע (ISF), ישראל, עבור אריה מרקוביץ. אנו מודים לשחר איש-שלום ולעדי יוסיפוביץ, מהמחלקה לפתולוגיה, המרכז הרפואי קפלן, רחובות, ישראל, על ניתוח היסטולוגיה.

הניסויים בפרוטוקול אושרו על ידי המועצה הלאומית הישראלית לניסויים בבעלי חיים ועומדים בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. נקבות עכברי C57BL/6, בגילאי 8-10 שבועות, שימשו במחקר הנוכחי ונחשפו למחזורי אור-חושך של 12/12 שעות. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).
1. תרבית תאים
<ol><li>תרבית תאי B16LS9 במדיום RPMI 1640, בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 מ"מ נתרן פירובט, 25 מ"מ HEPES, תערובת ויטמינים 1% חיונית, 200 U/מ"ל פניצילין ו-200 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין (ראו טבלת חומרים), באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.</li>
	<li>קצרו את התאים להזרקה במפגש של 70%-80%.</li>
</ol>2. הכנת בעלי חיים
<ol><li>הכינו תערובת הרדמה של קטמין (75 מ"ג/ק"ג משקל גוף) ומדטומידין (0.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף). מרדימים את העכברים על ידי הזרקת תערובת ההרדמה תוך צפקית בזריקה אחת.</li>
	<li>החל הרדמה אופתלמית מקומית oxybuprocaine (0.4%) על שתי העיניים.</li>
	<li>להרחיב את אישוני העכבר על ידי יישום מקומי tropicamide (0.5%).</li>
</ol>3. יצירת פריטומיה של הלחמית ומערכת סקלרלית לחלל תת-כורואידי
<ol><li>יש למרוח 1.4% הידרוקסיאתילצלולוז (ראו טבלת חומרים) כחומר סיכה על שתי העיניים כדי למנוע ייבוש. יש למרוח 0.5% טרופיקמיד על עין ימין.</li>
	<li>התבוננו בעין המופעלת של העכבר תחת מיקרוסקופ הפעלה (ראו טבלת חומרים). החזיקו את העפעפיים פתוחים בעזרת מלקחיים תוך עיניים סטריליות.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים תוך עיניים, החזיקו את לחמית הגפיים הסופרו-טמפורלית ומשכו לכיוון מנח אינפרא-אף22. אבטחו את המיקום הזה על-ידי החזקתו לאורך כל התהליך (איור 1A).</li>
	<li>בעזרת קצה מחט של 30 גרם, יש לבצע פריטומיה קטנה (1-2 מ"מ) של הלחמית באזור הגב-טמפורלי, כ-1-2 מ"מ אחורית ללימבוס. הערה: שימוש במחטים עדינות יותר יכול למנוע ניקוב יתר ולאפשר דיוק טוב יותר של מיקום הגידול.</li>
	<li>מוציאים את עודפי הקפסולה של טנון מפתח הצפק. הערה: הקפסולה של טנון היא שכבה של רקמת חיבור צפופה המקיפה את כדור הארץ של העין22.</li>
	<li>במיקום זה, הכנס את קצה המחט כדי לחדור דרך הסקלרה. בצעו כריתה כדי ליצור מערכת לתוך החלל התת-כורואידי עד שהצבע החום של הכורואיד יופיע דרך החומר הלבן החשוף של לובן העין (איור 1B).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64632/64632fig01.jpg"> איור 1: חיסון תאי גידול . (A) הלחמית הלימבלית הסופרו-טמפורלית מוחזקת באמצעות מלקחיים תוך עיניים ונמשכת לכיוון מנח אינפרא-אף. (B) קצה של מחט 30 גרם מוכנס כדי לחדור דרך הסקלרה, וכריתה נעשית כדי ליצור מסילה לתוך החלל התת-כורואידי. (C) מזרק עמוס תאים ומורכב במחט 32 G מוכנס למסילה, והתאים מוזרקים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64632/64632fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
4. חיסון תאי מלנומה
<ol><li>השהה מחדש 70,000 תאי B16LS9 ב-2 μL של PBS. סכום זה מוערך לפי עין.</li>
	<li>טען את התאים לתוך מזרק המילטון סטרילי מזכוכית 10 μL (ראה טבלת חומרים) המורכב עם מחט קהה 32 G מסובבת בזווית של 45 מעלות.</li>
	<li>הכנס את מחט המזרק הטעונה כ -2 מ"מ לתוך הרצועה שנוצרה בשלב 3.</li>
	<li>להזריק 2 μL של השעיית התא.</li>
	<li>החזיקו את המחט במקומה לאחר ההזרקה למשך 2-3 שניות עד שכל הנוזלים התפנו.</li>
	<li>הסירו את המחט על-ידי משיכת המחט החוצה בעדינות ובאיטיות כדי למנוע דליפה מהמסילה (איור 1C). הערות: התאמת מהירות וכוח ההזרקה יכולה להשפיע על דפוס התפתחות הגידול. מוצע כי פרמטרים אלה יכוילו על ידי אנשים המתנסים כדי לזהות את הכוח והמהירות הנכונים המופעלים. בסך הכל נקבעו 70,000 תאים בניסויים מקדימים. עם זאת, מכיוון שייתכנו שינויים בסוגי תרביות תאים או באצוות או בין זני עכברים, יש צורך בכיול של מספר זה.</li>
</ol>5. הערכת מיקום ההזרקה
<ol><li>יש להתבונן בעין המוזרקת על ידי סריקות OCT מיד לאחר חיסון תאי מלנומה כדי לזהות את המראה של היפרדות רשתית (RD), נזק לרשתית ו / או תאים בזגוגית23. הערות: יש למרוח מחדש טרופיקמיד, אוקסיבופרוקאין ואתילצלולוז לפי הצורך.</li>
	<li>בהתבסס על סריקות OCT משלב 5.1, סווג את דפוסי RD21 לפי: (1) אתר RD-one מקומי של RD; (2) דליפה לתוך חומר התא צופה הזגוגית בזגוגית; (3) אתרים מרובים RD מורחבים של RD.</li>
	<li>לחזות את לוקליזציה הגידול בהתבסס על: (1) גידולים כורואידים מקומיים צפויים RD; (2) דליפה לתוך גידולי הזגוגית הצפויים בזגוגית; (3) גידולים משתנים ומפוזרים מורחבים הצפויים על ידי RD (איור 2). הערה: רק עכברים עם RD מקומי (כ -50%) צפויים לפתח גידולים המוגבלים לכורואיד.</li>
</ol>6. חיזוי גודל הגידול בהתבסס על גובה RD
<ol><li>למדוד את הגובה של RD מקומי בסריקות OCT באמצעות תוכנת סגמנטציה/ניתוח OCT (ראה טבלת חומרים) ולסווג לפי הקבוצות הבאות: קטן = &lt;300 מיקרומטר; בינוני = 300-400 מיקרומטר; גדול = &gt;400 מיקרומטר.</li>
	<li>להעריך את הנפח אליו צפויים להגיע הגידולים תוך 5 ימים מההזרקה על פי הקריטריונים הבאים: גובה RD קטן נצפה בדרך כלל בגידולים קטנים (נפח הגידול נע בין 0.0059 מ"מ 3 ל 0.07 מ"מ 3 עם נפח ממוצע של 0.027 ± 0.005 מ"מ3). גובה RD בינוני נמצא בגידולים קטנים ובינוניים כאחד (נפח הגידול נע בין 0.015 מ"מ 3 ל 0.15 מ"מ 3 עם נפח ממוצע של 0.056 ± 0.016 מ"מ3). גובה RD גדול קשור למגוון רחב של נפחי גידול עד 0.36 מ"מ3. הערה: טווח גדלי הגידול הצפויים התקבל מהתוצאות הקודמות וחולק לשלוש קבוצות של גידולים קטנים, בינוניים וגדולים.</li>
</ol>7. הליכים לאחר הניתוח
<ol><li>יש למרוח אופלוקסצין אופתלמי 0.3% באופן מקומי.</li>
	<li>הפוך את ההרדמה על ידי הזרקת atipamezole hydrochloride (3 מ"ג / ק"ג) תת עורית.</li>
	<li>להזריק תת עורית buprenorphine (0.05 מ"ג / ק"ג משקל גוף) פעמיים ביום במשך 3 ימים כדי להפחית את הכאב והסבל של בעלי חיים.</li>
	<li>לאחר 5 ימים לאחר הזרקת תאי מלנומה, להעריך את גודל הגידול על ידי ביצוע השלבים הבאים.<ol><li>הרדימו את העכברים כמתואר בשלב 2.1. החל tropicamide (0.5%).</li>
		<li>לבחון את העיניים על ידי סריקות OCT אורכיות וסגיטליות ולהשתמש בתוכנת סגמנטציה/ניתוח OCT למדידת נפח הגידול ולוקליזציה.</li>
		<li>חשב את נפח הגידול באמצעות הנוסחה24: V = a*b*c*6/π (a, b ו- c = אורך, רוחב וגובה, בהתאמה).</li>
		<li>יש לבחון את גודל הגידול כל 2-3 ימים כמתואר בשלבים 7.4.1-7.4.3. הערה: יש למטב את ההליך אם אתה משתמש בזני עכבר שונים או בקווי תאים שונים.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Jager, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uveal+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Uveal melanoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 6 (1), 1-25 (2020).</li>
<li>Bustamante, P., Piquet, L., Landreville, S., Burnier, J. V. Uveal melanoma pathobiology: Metastasis to the liver. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+P+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22">Seminars in Cancer Biology</a>. 71, Academic Press. 65-85 (2021).</li>
<li>Damato, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+treatment+of+choroidal+melanoma+in+relation+to+the+prevention+of+metastatic+death-A+personal+view%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular treatment of choroidal melanoma in relation to the prevention of metastatic death-A personal view.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 66, 187-199 (2018).</li>
<li>Jouhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+fatal+choroidal+melanoma+study.+A+survey+by+the+European+Ophthalmic+Oncology+Group%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The small fatal choroidal melanoma study. A survey by the European Ophthalmic Oncology Group.</a> American Journal of Ophthalmology. 202, 100-108 (2019).</li>
<li>Cao, J., Jager, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+eye+models+for+uveal+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Oncology+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Animal eye models for uveal melanoma.</a> Ocular Oncology and Pathology. 1 (3), 141-150 (2015).</li>
<li>Uner, O. E., Gandrakota, N., Azarcon, C. P., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+uveal+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Eye+Science%22%5BJournal%5D)">Animal models of uveal melanoma.</a> Annals of Eye Science. 7, 21-30 (2022).</li>
<li>Yang, H., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+alpha+2b+decreases+hepatic+micrometastasis+in+a+murine+model+of+ocular+melanoma+by+activation+of+intrinsic+hepatic+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Interferon alpha 2b decreases hepatic micrometastasis in a murine model of ocular melanoma by activation of intrinsic hepatic natural killer cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2056-2064 (2004).</li>
<li>Yang, H., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunologic+and+anti-angiogenic+therapy+reduces+hepatic+micrometastases+in+a+murine+ocular+melanoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Combined immunologic and anti-angiogenic therapy reduces hepatic micrometastases in a murine ocular melanoma model.</a> Current Eye Research. 31 (6), 557-562 (2006).</li>
<li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Invasion+%26+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion & Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li>
<li>Diaz, C. E., Rusciano, D., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B16LS9+melanoma+cells+spread+to+the+liver+from+the+murine+ocular+posterior+compartment+%28PC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">B16LS9 melanoma cells spread to the liver from the murine ocular posterior compartment (PC).</a> Current Eye Research. 18 (2), 125-129 (1999).</li>
<li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Invasion+%26+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion & Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li>
<li>Ashur-Fabian, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrac+delayed+the+onset+of+ocular+melanoma+in+an+orthotopic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Tetrac delayed the onset of ocular melanoma in an orthotopic mouse model.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 632335(2019).</li>
<li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+regulating+c-met+overexpression+in+liver-metastatic+B16-LS9+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms regulating c-met overexpression in liver-metastatic B16-LS9 melanoma cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 81 (3), 477-487 (2001).</li>
<li>Harning, R., Szalay, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+metastasis+of+in+vivo+and+in+vitro+derived+syngeneic+murine+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Ocular metastasis of in vivo and in vitro derived syngeneic murine melanoma.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1599-1604 (1987).</li>
<li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li>
<li>Notting, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+bioluminescent+imaging+of+human+uveal+melanoma+in+a+new+mouse+model+of+local+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Whole-body bioluminescent imaging of human uveal melanoma in a new mouse model of local tumor growth and metastasis.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (5), 1581-1587 (2005).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+xenograft+murine+human+uveal+melanoma+model+develops+hepatic+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">In-vivo xenograft murine human uveal melanoma model develops hepatic micrometastases.</a> Melanoma Research. 18 (2), 95-103 (2008).</li>
<li>Murthy, R. K., Haji, S., Sambhav, K., Grover, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Journal%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of spectral domain optical coherence tomography in retinal diseases.</a> Biomedical Journal. 39 (2), 107-120 (2016).</li>
<li>Drexler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-resolution+ophthalmic+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography.</a> Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).</li>
<li>Ochakovski, G. A., Fischer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+of+mouse+models+with+OCT%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phenotyping of mouse models with OCT.</a> Methods in Molecular Biology. 1834, 285-291 (2019).</li>
<li>Zaks, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+imaging+for+assessing+tumor+growth+in+mouse+models+of+ocular+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In-vivo imaging for assessing tumor growth in mouse models of ocular melanoma.</a> Experimental Eye Research. 204, 108431(2021).</li>
<li>Brar, V. S. American Academy of Ophthalmology 2022-2023 BCSC. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrar%2C+VS+%22Fundamentals+and+principles+of+ophthalmology%22">Fundamentals and principles of ophthalmology</a>. , (2022).</li>
<li>Duker, J. S., Waheed, N. K., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuker%2C+JS+%22Handbook+of+Retinal+OCT%3A+Optical+Coherence+Tomography%2C+2nd+Edition%22">Handbook of Retinal OCT: Optical Coherence Tomography, 2nd Edition</a>. , Elsevier Health Sciences. (2021).</li>
<li>Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+subcutaneous+tumor+size+in+athymic+%28nude%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemotherapy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).</li>
<li>Richards, J. R., Yoo, J. H., Shin, D., Odelberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+uveal+melanoma%3A+Strengths%2C+weaknesses%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of uveal melanoma: Strengths, weaknesses, and future directions.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (2), 264(2020).</li>
<li>Chen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+molecular+imaging-escorted+adipose+photodynamic-browning+synergy+for+fighting+obesity+with+virus-like+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic molecular imaging-escorted adipose photodynamic-browning synergy for fighting obesity with virus-like complexes.</a> Nature Nanotechnology. 16 (4), 455-465 (2021).</li>
<li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+visualization+of+early+cancer+hepatic+micrometastasis+and+intraoperative+image-guided+surgery+by+photoacoustic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free visualization of early cancer hepatic micrometastasis and intraoperative image-guided surgery by photoacoustic imaging.</a> Journal of Nuclear Medicine. 61 (7), 1079-1085 (2020).</li>
</ol>

מרקוביץ א.ל.: סטבה ביוטק (P), ידע ויצמן (P), EyeYon Medical (C, P), מור איסום (P). (ג) = יועץ; (P) = פטנט. לכל שאר המחברים אין אינטרסים מתחרים.

מלנומה של ענבל היא מחלה הרסנית שעבורה יש צורך רב בגישות טיפוליות חדשניות. עם זאת, המחקר על מלנומה ענביה וטיפולים פוטנציאליים מוגבל על ידי האתגרים הטכניים של מלנומה uveal מודלים בעלי חיים 1,25. גידולים עיניים, הנגרמים על ידי הזרקה תוך עינית של תאים סרטניים, משתנים מאוד הן בלוקליזציה והן בגודל, ככל הנראה בשל הממדים הקטנים של עין העכבר. שונות כזו מהווה מכשול להערכה מקיפה של התקדמות הגידול. הגישה הניסויית המתוארת כאן מאפשרת להעריך לוקליזציה של גידול תוך עיני וגודל חז...

מלנומה של Uveal (UM) היא הממאירות הראשונית התוך עינית השכיחה ביותר במבוגרים. כ-90% מהמלנומות של העין מקורן במלנוציטים באזור הכורואידי של דרכי הענבל1. UM הוא גורם עיקרי לתחלואה ותמותה, שכן ההערכה היא כי קרוב ל -50% מהחולים מפתחים מחלה גרורתית, כאשר הכבד הוא האתר העיקרי של גרורות2. טיפול מוקדם בנגעים ראשוניים עשוי להפחית את הסיכוי לגרורות, אך אין טיפול יעיל המונע היווצרות גרורות3.
הטיפול המקובל במלנומה של הענבל כולל הקרנות, הקשורות לאובדן ראייה עקב נוירופתיה אופטית, רטינופתיה, תסמונת העין היבשה וקטרקט. כריתה כירורגית מתעכבת בדרך כלל עד לזיהוי ואפיון צמיחת הנגע. עם זאת, עיכוב כזה עלול לאפשר התפתחות מחלה גרורתית4. במקרים מסוימים, נדרשת אינוקלציה חסרת תוחלת. כמובן שהליך רדיקלי זה פוגע בראייה וגורם להידרדרות אסתטית דרמטית.
מאמצים רבים הוקדשו לפיתוח מודלים ניסיוניים לחקר מלנומה של הענבה. מודלים פרה-קליניים של בעלי חיים המאפשרים הערכה מדויקת של ממאירות זו הם המפתח לחקר אסטרטגיות אבחון וטיפול חדשניות למלנומה של הענבה. מודלים ניסיוניים של מלנומה עינית בבעלי חיים מבוססים בעיקר על חיסון תאי גידול בעכברים, חולדות וארנבות 5,6. מודלים של עכברים הם חסכוניים ונמצאים בשימוש נרחב במחקרי מלנומה בשל קצב ההתרבות המהיר שלהם ודמיון גנומי גבוה לבני אדם. קו תאי המלנומה העורית B16 משמש בדרך כלל לחיסון עכברי C57BL6 ולגרימת גידולים סינגניים. כאשר משתמשים במודל זה כדי לגרום למלנומה של העגלה, עיניים נושאות גידול בדרך כלל צריכות לעבור אינקולציה 7-14 יום לאחר החיסון. יתר על כן, B16 הוא מודל פולשני מאוד. האופי החיסוני של העין תומך בגרורות, וגרורות עשויות בדרך כלל להתגלות 3-4 שבועות לאחר חיסון תאי הגידול. תת-תרבויות של קו B16 המקורי מציגות תכונות גרורתיות מובהקות6. לדוגמה, לקו המלנומה של קווינס יש שיעור גרורתי גבוה 7,8. לקו התאים B16LS9 יש מורפולוגיה של תאים דנדריטיים והוא נגזר מגרורות בכבד של עכברי C57BL/6 שהוזרקו לקו המלנומה העורית של ההורים B16F19. כאשר הוזרקו לתא האחורי של העין, תאים אלה הוכחו כיוצרים גידולים תוך עיניים, אשר דומים היסטולוגית למלנומה של הענבל האנושי ויוצרים גרורות ספציפיות לכבד ב- C57BL/6, אך לא Balb/C, עכברים10,11,12. מבחינה גנטית, התאים מאופיינים בביטוי גבוה יותר של הפרוטו-אונקוגן c-met, הפועל כקולטן תאי לגורם גדילה של הפטוציטים13. לעומת זאת, B16F10, המעברהעשירי של B16 ההורי, שולח גרורות בעיקר לריאות כאשר הוא מחוסן תוך עינית14. גם B16F10 וגם B16LS9 הם פיגמנט12.
מספר אתגרים מרכזיים מגבילים את ההצלחה של מודלים של מלנומה של מורין uveal. ראשית, ריפלוקס של תאי הגידול עלול להוביל למלנומה חוץ-עינית או תת-לחמית. שנית, צמיחת הגידול לאחר חיסון תוך עיני של תאי מלנומה היא לעתים קרובות משתנה מאוד, ומציבה קשיים בהערכת הטיפול והתקדמותו. קושי מרכזי נוסף הוא היכולת המוגבלת לעקוב אחר צמיחת הגידול in vivo. בעוד הדמיה ביולומינסנטית, כגון של גידולים המבטאים לוציפראז, משמשת בדרך כלל למעקב אחר צמיחת הגידול העיני15,16, היא אינה יכולה לספק מידע על המיקום התוך עיני של הגידול. לכן, הערכה של הגידול מבוצעת בדרך כלל לאחר enucleation של העין10,17. זה מגביל מאוד את היכולת לאפיין את התקדמות הגידול ואת התגובה לטיפולים באופן נרחב. מכשול מרכזי נוסף בחקר מלנומה של הענבל הוא הקושי בניטור נגעים בעכברים עם פיגמנטציה. גישות חדשות, המתגברות על קשיים אלה, נדרשות כדי לקדם את המחקר של מלנומה ענבית במודלים של בעלי חיים.
טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) מספקת יכולות ייחודיות לתמונה עמוק לתוך חלקי העין השונים ברזולוציה גבוהה, שאין דומה לה במתודולוגיות אחרות, כולל אולטרסאונד18,19. הדמיית OCT שימשה במודלים של בעלי חיים לחקר מחלות עיניים שונות20. לאחרונה, הדמיית OCT הודגמה כאמצעי לא פולשני להערכת צמיחת גידול תוך עיני21. הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את השתלת תאי המלנומה בכורואיד המוריני ואת השימוש ב-OCT לחיזוי לוקליזציה וגודל הגידול התוך-עיני בזמן חיסון התא.

<table><tbody><tr><td>10 &mu; מזרק זכוכית L (המילטון ושות', בונדוז, שוויץ)</td>מחטי <td>המילטון</td><td>721711</td><td></td></tr><tr><td>30 גרם</td><td>BD Microbalance</td><td>2025-01</td><td></td></tr><tr><td>תאי Atipamezole hydrochloride</td><td>Orion Phrma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B16LS9</td><td>מבית Hans Grossniklaus ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בופרנורפין&nbsp;</td><td>ריכטר פארמה</td><td>102047</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 עכברים נקבות</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תערובת ויטמינים חיוניים</td><td>satorius</td><td>01-025-1A</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>רניום</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>satorius</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקסיאתיל צלולוז 1.4% טיפות עיניים</td><td>פישר פרמצבטיקה</td><td>390862</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת פילוח OCT InSight&nbsp;</td><td>פיניקס מיקרון, בע"מ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קטמין</td><td>ברמר פארמה GMBH (מדימרקט)</td><td>17889</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סטוריוס</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine&nbsp;</td><td>zoetis (vetmarket)</td><td>102532</td><td></td></tr><tr><td>אופלוקסצין 0.3% טיפות עיניים</td><td>אלרגן</td><td>E92170</td><td></td></tr><tr><td>טומוגרפיה קוהרנטית אופטית&nbsp;</td><td>פיניקס מיקרון, בע"מ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אוקסיבופרוקאין 0.4%</td> <td>פישר פרמצבטיקה</td><td>393050</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטרצין</td><td>סטוריוס</td><td>03-033-1B</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)&nbsp;</td><td>satorius</td><td>02-023-1a</td><td></td></tr><tr><td>RPMI מדיה תאית</td><td>satorius</td><td>01-104-1A</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>satorius</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ כירורגי</td><td>Zeiss</td><td>OPMI-6 CFC</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamide 0.5%</td> <td>Fisher Pharmaceutical</td><td>390723</td><td></td></tr></tbody></table>

השתלה והערכה של מלנומה בכורואיד מורין באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

הקמת מודלים ניסיוניים למלנומה כורואידית מאתגרת מבחינת היכולת לגרום לגידולים במיקום הנכון. בנוסף, קשיים בתצפית על מלנומה כורואידית אחורית in vivo מגבילים את מיקום הגידול ואת הערכת הצמיחה בזמן אמת. הגישה המתוארת כאן מייעלת טכניקות לביסוס מלנומה כורואידית בעכברים באמצעות הליך הזרקת תאים תת-כורואידי B16LS9 רב-שלבי. כדי לאפשר דיוק בהזרקה לממדים הקטנים של העכבר uvea, ההליך המלא מבוצע תחת מיקרוסקופ. ראשית, פריטומיה הלחמית נוצרת באזור הגבי-טמפורלי של העין. לאחר מכן, נוצרת מערכת לתוך החלל התת-כורואידי על ידי החדרת מחט דרך הסקלרה החשופה. זה ואחריו החדרת מחט קהה לתוך דרכי והזרקת תאי מלנומה לתוך choroid. מיד לאחר ההזרקה, נעשה שימוש בהדמיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית לא פולשנית (OCT) כדי לקבוע את מיקום הגידול והתקדמותו. היפרדות הרשתית מוערכת כמנבא של אתר הגידול וגודלו. השיטה המוצגת מאפשרת השראת שחזור של מלנומה מקומית כורואידית בעכברים והדמיה חיה של הערכת צמיחת גידול. ככזה, הוא מספק כלי רב ערך לחקר גידולים תוך עיניים.

העיניים נבדקו באמצעות OCT מיד לאחר הזרקת תאי B16LS9. היפרדות רשתית מקומית נצפתה לאחר ההזרקה. העכברים הציגו שלוש תבניות של RD: מוקד (איור 2, פאנל עליון), דליפה לזגוגית (איור 2, פאנל אמצעי) ו-RD מורחב (איור 2, פאנל תחתון). RD מורחב נגרם ככל הנראה על ידי נזק מההזרקה. נמצא קשר בין דפוס RD מיד לאחר ההזרקה לבין לוקליזציה של הגידולים 5-7 ימים לאחר ההזרקה. כפי שהודגם באיור 2, RD מוקדי היה קשור לצמיחת ת...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההשתלה וההערכה של מלנומה בכורואיד מורין תוך שימוש בטומוגרפיה קוהרנטית אופטית.

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

ביסוס גידולים כחלק האחורי של העין הוא מאתגר. שיטה זו מאפשרת השראת גידולי מלנומה כורואידית הניתנים לשחזור בעכברים, והדמיה חיה של צמיחת הגידול לצורך הערכה. פרוטוקול זה משתמש בהדמיה חיה OCT כדי להעריך את מיקום הגידולים כבר בזמן חיסון תאי הגידול, ולעקוב אחר צמיחת הגידול בבעלי חיים חיים.מלנומה של Uveal היא מחלה הרסנית עם שיעור גרורות קרוב ל-50%. פיתוח מודלים ניסיוניים הוא המפתח לקידום מחקר המכוון לאפשרויות טיפוליות חדשות. היתרון של שיטה זו הוא שההערכה המיידית של הצלחת ההזרקה מאפשרת להגיע לקבוצות מחקר עם גידולים הומוגניים ולעקוב אחריהם ברציפות באמצעות הדמיה חיה.כדי לבחון את התקדמות הגידול. הזרקה לעיניו של העכבר הקטן דורשת תרגול. היכולת לדמיין את התאים המוזרקים מאפשרת לך להעריך את ההצלחה שלך באופן מיידי ולחזור עם עכברים נוספים לפי הצורך.מי שידגים את ההליך יהיה ד"ר דימיטרי גאבר מהמעבדה לחקר העיניים במרכז הרפואי קפלן. כדי להתחיל, להחיל 0.4% הרדמה אופתלמית אקטואלית, Oxybuprocaine על שתי העיניים של העכבר מורדם. לאחר מכן יש למרוח באופן מקומי 0.5% טרופיקמיד על שתי העיניים להרחבת האישונים, ולאחר מכן 1.4% תאית הידרוקסיאתיל כחומר סיכה למניעת ייבוש העיניים.התבונן בעין אחת של העכבר תחת מיקרוסקופ הפעלה. החזיקו את העפעפיים פתוחים בעזרת מלקחיים תוך עיניים סטריליות. לאחר מכן החזיקו את לחמית הלימבו הרקתית העליונה ומשכו לכיוון תנוחת אף אינפרא.אבטח תנוחה זו על ידי החזקת הלימבו-לחמית לאורך כל ההליך. באמצעות קצה מחט של 30 מד ליצור פריטומיה קטנה של הלחמית באזור הרקתי הגבי כמילימטר עד שני מילימטרים אחוריים ללימבוס. הסר את קפסולת הגידים העודפים מפתח הצפק.הכנס את קצה המחט כדי לחדור את לובן העין וליצור מסילה לתוך החלל הסובכורואידי עד שהצבע החום של הכורואיד מופיע דרך החומר הלבן החשוף של הסקלרה. העמיסו את התאים לתוך מזרק המילטון סטרילי מזכוכית 10 מיקרוליטר המורכב עם מחט קהה 32 מד מעוותת בזווית של 45 מעלות. הכנס את המחט של המזרק הטעון כשני מילימטרים לתוך מערכת שנוצרה, והזריק שני מיקרוליטר של השעיית התא.החזיקו את המחט במקומה לאחר ההזרקה למשך שתיים עד שלוש שניות עד שכל הנוזלים התפנו. הסר את המחט על ידי שליפתה החוצה בעדינות כדי למנוע דליפה מדרכי הנשימה. מיד לאחר חיסון תאי המלנומה, התבוננו בעין המוזרקת של החיה על ידי סריקות OCT.בהתבסס על הסריקות, סווגו את ניתוק הרשתית או דפוסי RD לפי שלוש קטגוריות RD מקומי, דליפה לתוך הזגוגית, או RD מורחב. פתח תוכנת ניתוח פילוח OCT כדי לחזות את גודל הגידול בהתבסס על גובה RD. מדוד את הגובה של RD מקומי בסריקות OCT וסווג אותן לשלוש קבוצות. בשלב שלאחר הניתוח, להחיל 0.3% של Ofloxacin באופן מקומי.החיזוי מבוסס OCT של צמיחת הגידול לאחר הזרקת תאים subchoroidal מתואר באיור זה. העכברים הציגו שלושה דפוסים של RD, מוקד, דליפה לזגוגית ו- RD מורחב. נמצא קשר בין דפוס RD מיד לאחר ההזרקה, לבין לוקליזציה של הגידולים חמישה ימים לאחר ההזרקה. RD מוקד היה קשור לצמיחת תאי הגידול שהייתה מוגבלת לכורואיד.עם זאת, תצפית על תאים בזגוגית לאחר הזרקה בבעלי חיים המציגים RD מוקדי הצביעה על צמיחת הגידול בחלל הזגוגית ובכורואיד. כאשר נצפתה RD מורחב לאחר ההזרקה, הגידולים התפזרו לאורך הכורואיד והזגוגית לאחר חמישה ימים. ניתן לחלק את טווח גדלי הגידול המושרה במודל זה לקטנים, בינוניים וגדולים.מוצגות כאן תמונות מייצגות של מדידת OCT של גובה RD לאחר הזרקה, ותמונת הפונדוס המתאימה, סריקת OCT אופקית של גובה הגידול ורוחבו ביום החמישי לאחר ההזרקה, ותמונת הפונדוס המתאימה לו, ואזור העין המוכתם H&E המתאים המדגים מדידות גידול דומות. מדידות נפח הגידול של עכברים שהציגו RD קטן, בינוני או גדול מיד לאחר הזרקת התא מוצגות כאן. התאמת כוח ההזרקה יכולה להשפיע על גודל הגידול ומיקומו.חשוב לכייל זאת ולהעריך את הדפוס של היפרדות רשתית מושרית על ידי OCT לאחר ההזרקה. הדמיה חיה של גידולים כורואידיים היא כלי ניסיוני חשוב המאפשר לבחון את ההשפעה של גורמים שונים או טיפולים פוטנציאליים על התקדמות הגידול.

implantation-evaluation-melanoma-murine-choroid-via-optical-coherence

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מדגים טכניקת הדמיה in vivo לזיהוי וכימות דלקת עיניים במודל עכברי של אובאיטיס פוסט-זיהומית. הטכניקה, המכונה טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT), מייצרת תמונות חתך ברזולוציה גבוהה של העין להערכת התקדמות המחלה.

הדמיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית להערכת אובאיטיס במודל עכבר

מקור: Jagodzinska, J., et. al., טומוגרפיה קוהרנטית אופטית: הדמיית תאי גנגליון רשתית של עכבר ב-Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  בסרטון זה, אנו מדגימים את השימוש בטומוגרפיה קוהרנטית אופטית בתחום ספקטרלי (SD-OCT) כדי לדמות שכבות רשתית ולהעריך שינויים מבניים במודל עכבר מהונדס גנטית עם נוירופתיה אופטית.

הדמיה in vivo של רשתית העכבר באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית

הקמנו מודל גליובלסטומה orthotopic קליפת המוח בעכברים לשני הפוטונים במיקרוסקופ intravital שמשחזר אילוצי biophysical בדרך כלל במשחק במהלך הצמיחה של הגידול. חלון זכוכית כרוני החלפת הגולגולת מעל לגידול מאפשר המעקב של התקדמות הגידול לאורך זמן על ידי שני פוטונים במיקרוסקופ.

Glioblastoma עכבר דגם orthotopic שמירה על אילוצי המוח של רקמת ריאה, פיסיים ומתאים לשני פוטונים במיקרוסקופ Intravital

אנו מתארים פלטפורמת הדמיה לא פולשנית של בעלי חיים המאפשרת זיהוי, כימות וניטור של צמיחה והישנות של סרטן השחלות. מודל קסנוגרפט תוך-צפקי זה מחקה את הפרופיל הקליני של חולות עם סרטן השחלות.

דגם Murine הדמיה בלתי פולשנית לזיהוי ומעקב סרטן השחלות הישנות

כתב יד זה מתאר פרוטוקול עבור ויוו ההדמיה של הרשתית עכבר עם טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי ברזולוציה גבוהה (SD-אוקטובר). הוא מתמקד תאי גנגליון (מהרשות לשיקום האסיר) באזור peripapillary, עם מספר סריקה וכימות הגישות שתוארו.

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית: הדמיה העכבר גנגליון תאים In Vivo

כאן, אנו מציגים את התועלת של האורך ויוו הדמיה מעקב אחר שינויים מורפולוגיים של לייזר המושרה neovascularization כורוידאלית בעכברים.

אין ויוו הדמיה עם מודאלים מרובים וניתוח של עכבר לייזר המושרה חיבור כורוידאלית דגם

הפרוצדורה הבאה מתארת שיטה לשליטה מרחבית וטמפורלית של ייזום גידול מלנוציטוטי בעור מוראני, באמצעות דגם עכבר מהונדס גנטית. פרוטוקול זה מתאר מאקרוסקופי כמו גם חניכה מיקרוסקופיים עורית מלנומה.

שליטה מרחבית וטמפורלית של מלנומה מורין ייזום מוטציה תאי גזע מלנוציט

כאן אנו מתארים טכניקת הדמיה in vivo באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית כדי להקל על האבחון והמדידה הכמותית של רטינופתיה בעכברים.

יישום טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית למודל עכבר של רטינופתיה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים ליישור תמונות טומוגרפיה של טומוגרפיה קוהרנטית אופטית באור נראה (vis-OCTF) עם תמונות קונפוקליות ex vivo של אותה רשתית עכבר לצורך אימות המורפולוגיה של צרור האקסון של תאי גנגליון הרשתית שנצפו בתמונות in vivo .

יישור של טומוגרפיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של אור נראה עם תמונות קונפוקליות של אותה רשתית עכבר

אנו מתארים שיטה באמצעות הקרנה היקפית ממוקדת כדי לגרום התנהגות כמו-עייפה בעכברים. מינון ההקרנה לא הקטלני שנבחר מוביל לירידה של שבוע בפעילות ריצת גלגל מרצון.

במודל עכבר של עייפות הנגרם על ידי הקרנה ההיקפית

למד שתלת ומעקב אחר מלנומה בכורואיד עכברים באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית. שיטה זו מאפשרת הערכה מיידית של הצלחת ההזרקה ומעקב רציף אחר צמיחת הגידול בחיות חיות.

השתלה והערכה של מלנומה בכורואיד מורין באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית

גלה סרטונים נוספים