שחזור ציטוארכיטקטורה ותפקוד של רקמות אפיתל אנושיות על שבב-איבר פתוח

שיטות תרבית דיפוזיות מסורתיות לעתים קרובות נכשלות לשחזר את הסביבה המורכבת של איברים חיים, מה שמוביל לאובדן סמנים ותפקודים ספציפיים לרקמות. פיתחנו שבב פתוח המשלב תרבית דיפוזית ועקרון מיקרופלואיד כדי לחקות מקרוב את המיקרו-סביבה של רקמות אפיתל. על ידי הכללת רמזים ביוכימיים וביומכניים הנמצאים באופן טבעי באיברים חיים אך לעתים קרובות מוזנחים על ידי מודלים מסורתיים במבחנה, השבב הפתוח מייצג חלופה טובה יותר בין מערכות סגורות.

מי שתדגים את ההליך תהיה עדיה פנצ'ל היום, תלמידת מחקר במעבדה שלי. כדי להתחיל, להביא את הריאגנטים הדרושים מתחת לארון בטיחות ביולוגית על קרח. תרבית תאים מזנכימליים ספציפיים לרקמה כדי להשיג מפגש של 80% עד 90% ולאחר מכן לנתק את התאים באמצעות טריפסין או שיטות אחרות בהתאם להמלצות היצרן.

מטילים את התאים ב-250 גרם למשך חמש דקות ב-24 מעלות צלזיוס. להשהות מחדש את גלולת התא ב 225 מיקרוליטר כל אחד של קר כקרח 10X EMEM ומאגר שחזור. מערבבים את התאים על ידי pipetting ולהוסיף 1, 800 מיקרוליטר של קולגן קר כקרח 1 פתרון.

לאחר מכן, ערבבו את תמיסת הפרה-ג'ל על קרח על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש עד שש פעמים. נטרלו את תמיסת הפרה-ג'ל עם 18 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסידי רגיל אחד, ערבבו בעדינות על ידי פיפטינג ולאחר מכן פיפטה 150 מיקרוליטר של הידרוג'ל עמוס תאים לתוך התא המרכזי של השבב הפתוח תוך הימנעות מבועות. קבצו את הצ'יפס לצלחות פטרי נפרדות, כולל מכסה צינור צנטריפוגה מלא בשני מיליליטרים של מים סטריליים בזיקוק כפול בכל צלחת פטרי, ודגרו על צלחות הפטרי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

כדי לבצע מיקרו-תבניות משטח של הידרוג'ל סטרומה, פיפטה 20 מיקרוליטר של תמיסת הפרה-ג'ל המנוטרלת קולגן 1 על פני השטח המעוצבים של חותמת סטרילית מודפסת בתלת-ממד ולהכניס את החותמת בתוך התא הפתוח בזמן שההידרוג'ל הסטרומה עדיין בצורה נוזלית. יש להסיר שאריות הידרוג'ל שעלולות להישפך מראש התא הפתוח באמצעות אספירטור. קבצו את כל השבבים לצלחות פטרי נפרדות עם מכסה צינור חרוטי מלא במים כפי שהודגם קודם לכן.

ולדגור על כל צלחות הפטרי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 90 דקות. בסוף הדגירה, החזירו את השבבים מתחת לארון הבטיחות הביולוגית והסירו בעדינות את החותמות באמצעות פינצטה מדויקת כדי להפחית את הסיכון לפגיעה בהידרוג'ל. ברגע שהתאים בתרבית מגיעים למפגש של 80% עד 90%, נתקו את התאים באמצעות הליכי אנזים מפרקי חלבון לפי המלצת ספק התאים.

לאחר הדיסוציאציה, משחררים את התאים בצנטריפוגה ומשעימים מחדש את תאי האפיתל לצפיפות מקטע התא המתאימה כמתואר בכתב היד. כדי לזרוע את תא האפיתל, העבירו את השבבים מהאינקובטור לארון הבטיחות הביולוגית ושטפו את משטח הסטרומה שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של תרבית תאי אפיתל טריים כדי להסיר עודפים של תמיסת ציפוי. לאחר שואפת מדיום השטיפה, זרעו את משטח ההידרוג'ל עם 50 מיקרוליטר של תרחיף תאי האפיתל באמצעות צפיפות תאים מתאימה, ולאחר מכן העבירו את השבבים בחזרה לאינקובטור למשך שעתיים.

כדי להסיר פסולת תאית, שטפו בעדינות את משטח ההידרוג'ל עם מדיום תרבית התא פעמיים, רעננו את המדיום על ידי אוטוקלאבינג במיכלים אטומים הניתנים להרכבה, וחברו את השבבים למשאבה הפריסטלטית. השהה את המשאבה הפריסטלטית, נתק בזהירות את השבבים מהמשאבה וחלץ את מוביל בית השבב. לאחר העברת השבבים מהאינקובטור לארון הבטיחות הביולוגית, הסר את נפח המדיום שנותר למאגר העליון.

לאחר מכן, שאפו בעדינות את כל המדיום מהתעלה המיקרופלואידית העליונה ומהדקים את הצינור המיקרופלואידי הקצר המחובר לפתחים העליונים באמצעות תפסי קלסרים כדי להפחית את אידוי המדיה ותחזוקה של ממשק אוויר-נוזל, או ALI. הניחו את השבב הפתוח על מוביל הדיור בחזרה לאינקובטור. חבר מחדש את השבבים למשאבה הפריסטלטית וחדש את הזרימה על ידי הפעלת המשאבה הפריסטלטית.

יש לשטוף את תא כלי הדם בתרבית תאי אנדותל ולאחר מכן לזרוע 25 מיקרוליטר של השעיית תאי אנדותל. הפוך את השבבים כדי לאפשר לתאי אנדותל להיצמד לפני השטח העליונים של התא המיקרופלואידי. קבצו את הצ'יפס לצלחות פטרי.

החזירו אותם לאינקובטור כפי שהודגם קודם לכן ותנו לתאי האנדותל להתחבר למשך שעה. בתום הדגירה מעבירים את השבבים מהאינקובטור לארון הבטיחות הביולוגית ושוטפים פעמיים את תעלת כלי הדם במדיום תרבית תאי אנדותל כדי להסיר פסולת תאית. הניחו את השבבים שטוחים כדי להקל על הידבקות תאי האנדותל למשטח התחתון של תעלת כלי הדם.

מלאו את מאגר התווך הווסקולרי במדיום תרבית תאי כלי הדם המנוטרל מהגז מתחת לארון הבטיחות הביולוגית. החזירו את השבבים למנשא בית השבבים וחברו מחדש את השבבים למאגרים הבינוניים בקצה אחד ולמשאבה הפריסטלטית בקצה השני. בדוק את החיבורים המיקרופלואידים כדי לוודא שכל השבבים מחוברים כראוי ואין טיפות נראות לעין של טפטוף בינוני.

לאחר מכן, חדש את זרימת הנוזלים על ידי הפעלת המשאבה הפריסטלטית. משטח הג'ל micropatterned עם ובלי תאים הוא דמיין. ניתוח היסטולוגי גילה אפידרמיס מרובד רב-שכבתי בוגר מובחן על שבב.

התמונה העליונה של שבב העור הראתה נוכחות של פיברובלסטים בתוך שכבת העור. PECAM-1, VE-cadherin ו-von Willebrand הראו התמיינות של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים שעברו תרבית משותפת בשבב העור הפתוח. MUC5AC, אלפא ובטא טובולין, חלבון תאי כלורו 16, p63 וצביעה פלואורסצנטית ZO-1 הראו אפיתל בוגר של דרכי הנשימה.

ריסונים פועמים ואפיתל בוגר מרובד פסאודו-מרובד נצפו על שבב דרכי אוויר פתוח. צביעה פלואורסצנטית מסוג I, Type II ו- E-cadherin הראתה נוכחות של פנאומוציטים בוגרים על שבב. מיקרוסקופ אלקטרונים חשף נוכחות של microvilli ו lysosomal vesicles, עדות לפנוטיפ נאדיות בוגר.

הניתוח ההיסטולוגי הראה נוכחות של תאי קשקש שטוחים התואמים את הפנוטיפ מסוג I, ותאים דמויי אבן קובואידית הקוהרנטית עם הפנוטיפ מסוג II, ופיברובלסטים בתוך שכבת העור. נוכחותם של אנטרוציטים והגביע הבוגר אושרה על ידי מוצין 2 ומכתים E-cadherin. הפיברובלסטים בתוך שכבת העור אישרו את נוכחותו של אפיתל עמודתי פשוט.

כל ריאגנטים חייבים להיות קרים ואת פני השטח של הג'ל צריך להיות שטוף כראוי כדי לקבל משטח אחיד. חשוב להסיר תאים ופסולת שאינם נדבקים כדי לקבל הידבקות תאים אחידה ודופן חד-שכבתית ווסקולרית קומפקטית ומצחינה. גישה דומה יכולה לשמש ליצירת סוגים אחרים של מודלים של איברי אפיתל, כגון המעי והריאה, כדי להעריך כיצד תרופות ספציפיות או גורמים סביבתיים עשויים להשפיע על הומאוסטזיס של רקמות אנושיות, עם דגש מיוחד על תפקוד מחסום אפיתל וכלי דם.

עם גישה קלה לשלב היעילות של תא הסטרומה, המחקר יכול כעת ליצור דפוסי פנים ספציפיים ולשחזר ארכיטקטורת רקמות פונקציונלית, כגון cryptviveoli, אשר קשה להשיג עם מכשירים אחרים.