שיטת הומוגניזציה מהירה, פשוטה וסטנדרטית להכנת אמולסיות אנטיגן/אדג'ובנטיות לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית
9 בדצמבר 2022
כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, מודל חייתי של טרשת נפוצה, עכברים מחוסנים בתחליב מים בשמן המכיל אוטואנטיגן ואדג'ובנט שלם של פרוינד. בעוד שקיימים מספר פרוטוקולים להכנת אמולסיות אלה, מוצג כאן פרוטוקול הומוגניזציה מהיר, פשוט וסטנדרטי להכנת אמולסיה.
אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית או EAE היא מודל חייתי המשמש לפיתוח טיפולים חדשים ומשופרים לחולי טרשת נפוצה. גרימת מחלות ב-EAE דורשת תחליב שמן ומים מושלם כדי להשיג תוצאות עקביות. שיטת הכנת האמולסיה המוצגת כאן נקייה מהשפעה אנושית, ובכך מגבילה את חוסר העקביות מניסוי אחד למשנהו.
למרות שהשיטה הותאמה ל-EAE, ניתן להשתמש בה גם למודלים אחרים של מחלות אוטואימוניות וגם לבדיקת חיסונים לסרטן. כדי להכין את slurry CFA ב 100 מיליגרם של שחפת M מיובש בהקפאה H37 RA וחמישה, 3.2 מילימטרים חרוזי פלדה לצינור שבעה מיליליטר. לנער את הצינור בהומוגנייזר במשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר.
הוסף חמישה מיליליטר של אדג'ובנט IFA לצינור ונער שוב במשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר. לאחר מכן מעבירים את החרוזים לצינור טרי עם פיפטה שמשאירה את החרוזים מאחור ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. כדי להכין תחליב CFA/פפטיד, הורד קובץ משלים אחד כדי לחשב את הכמות הדרושה עבור כל מגיב.
לאחר מכן הניחו את הצינור המכוסה בבורג ואת הריאגנטים לשימוש על קרח. לאחר מכן, הוסף את רכיבי האמולסיה. תחילה PBS, אחר כך הפפטיד, ה- CFA slurry.
ולבסוף, IFA. סגור את הצינור עם המכסה בחוזקה על ידי הידוק ושחרור אותו מספר פעמים. יש לנער את השפופרת במרץ במשך 5 עד 10 שניות ביד כדי לערבב מראש את הריאגנטים.
מניחים את הצינור בהומוגנייזר הרועד ומהדקים אותו באמצעות המוט. הגדר את המהירות להגדרה הגבוהה ביותר ואת הזמן ל- 60 שניות. לאחר סיום הריצה, הניחו את הצינור על הקרח במשך שלוש דקות וחזרו על הריצה פעם או פעמיים נוספות עם אותן הגדרות.
צנטריפוגה את הצינור ב 300 G מדקה אחת כדי להסיר אוויר לכוד לדחוס את האמולסיה. הסר את המכסה מהצינור. הכנס את הבוכנה לתוך הצינור, ודחף אותה למטה לאט עד שהיא מגיעה לחלק העליון של התחליב.
הסר את מארז ההצמדה בתחתית הצינור על ידי סיבובו. לאחר מכן, הסר את הבוכנה מכל מזרקי ההזרקה והוסף מחט למזרקי ההזרקה. לאחר מכן חברו את גב מזרק ההזרקה למנעול הייעודי בתחתית הצינור ונעלו אותו עם טוויסט קצר.
העבר את האמולסיה מהצינור למזרק ההזרקה על ידי דחיפת הבוכנה בעדינות. עצור כאשר תחליב מגיע 0.15 מיליליטר סיום של מזרק ההזרקה. הפרידו את מזרק ההזרקה מהצינור והכניסו את הבוכנה בזהירות תוך הקפדה על כך ששום אוויר לא ייכנס למזרק זה.
דוחפים את הבוכנה עד שהתחליב יוצא מהמחט וחוזרים על התהליך למשך שארית התחליב הקיים בצינור. כדי לנתח את גודל חלקיקי המים והשמן הוסיפו טיפה זעירה של האמולסיה למגלשה במיקרוסקופ, מרחו אותה באמצעות כיסוי ולאחר מכן דחפו חזק בתנועה מעגלית כדי לשטח את התחליב. בחנו את האמולסיה המרוחה תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם הגדלה של פי 400 והתמקדו בשדה עם חד-שכבתי של התחליב.
ודא שחלקיקים קטנים, אחידים, אפורים או לבנים נראים לעין. תחליבים שנוצרו בשיטת ההומוגניזציה הציגו חלקיקים אפורים או לבנים בצורת שעועית המייצגים טיפות זעירות של מים ותחליבי שמן. לעומת זאת, טיפות האמולסיה שיוצרו בשיטת המזרק היו גדולות ורחבות יותר.
בשיטת המערבולת נצפו חלקיקים אפורים או שחורים גדולים המתאימים לבועות אוויר שנלכדו בתחליב. שינויים בפיזור גודל החלקיקים לאורך זמן שנמדדו באמצעות מנתח גודל חלקיקי שבירה בלייזר עבור תחליבי מים ושמן לא הראו כל שינוי בגודל החלקיקים במשך תקופה של שישה שבועות. התחליבים הטריים בני 3 שבועות ו-15 שבועות גרמו כולם למחלות EAE דומות בכל בעלי החיים שנוסו במהלך הניסוי.
עכברים פיתחו דפוס מחלה דומה בכל הניסויים שגילו כי שיטת ההומוגניזציה המוצגת כאן ייצרה אמולסיות שגרמו ל-EAE באופן עקבי וניתן לשחזור. לפני הכנת האמולסיה לניסוי, הורד קובץ משלים מספר אחת כדי לחשב את הכמות של כל רכיב הדרושה כדי למזער את הפסולת. השיטה המוצגת כאן יכולה לשמש לסטנדרטיזציה של הכנת תחליב לא רק למחקר פרה-קליני, אלא גם בעתיד להכנת חיסונים לסרטן במרפאה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה סטנדרטית להכנת אמולסיית מים-בשמן להשראת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסויית (EAE), מודל חיות לטרשת נפוצה. מטרת השיטה היא להפחית את השונות בתוצאות על ידי מזעור ההשפעה האנושית במהלך הכנת האמולסיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- מחקר מחלות אוטואימוניות
רקע
- אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסויית (EAE) משמשת למחקר של טרשת נפוצה.
- הכנה עקבית שלתחליב היא קריטית להשגת תוצאות ניסוייות מהימנות.
- שיטות קיימות עשויות להשתנות משמעותית, דבר המשפיע על השחזוריות.
- מחקר זה מציג פרוטוקול הומוגניזציה מהיר ופשוט.
מטרת המחקר
- להצגת שיטה סטנדרטית להכנת אמולסיה.
- להפחתת השונות בהשראת EAE.
- לספק פרוטוקול שניתן ליישום במודלים אחרים של מחלות אוטואימוניות ובבדיקת חיסונים לסרטן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של תרחיף CFA באמצעות *M tuberculosis* H37 RA מיובש בהקפאה.
- שימוש בחרוזי פלדה ובהומוגניזטור להכנת אמולסיה.
- אופטימיזציה של זמן ומהירות הנעורה להשגת עקביות.
- יישום השיטה על EAE ומודלים אחרים.
תוצאים עיקריים
- השיטה הניבה אמולסיה יציבה המתאימה להשראת EAE.
- הפחתת ההשפעה האנושית הובילה לתוצאות ניסיוניות עקביות יותר.
- הוכשבה ישימות למודלים אחרים של מחלות אוטו-אימוניות.
- צוין שימוש פוטנציאלי בבדיקת חיסונים לסרטן.
מסקנות
- שיטת הכנת האמולסיה הסטנדרטית משפרת את השחזוריות במחקרי EAE.
- ניתן להתאים גישה זו ליישומים מחקריים שונים.
- מחקרים עתידיים עשויים להפיק תועלת מפרוטוקול זה לשיפור תוצאות הניסוי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הכנה סטנדרטית של אמולסיית אנטיגן/אדג'ובנט היא קריטית להשראה ניתנת לשחזור של אנצפלומיליטיס אוטואימונית ניסויית (EAE), מודל פרה-קליני מרכזי לגילוי תרופות לטרשת נפוצה. שיטה זו, המבוססת על הומוגניזציה, ממזערת את השונות בין המבצעים, ובכך תומכת בתיקוף יעד חסון ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. איכות אמינה של האמולסיה משפיעה ישירות על רמת הביטחון בניבוי ועל תעדוף תיקי הפיתוח בתוכניות למחלות אוטואימוניות ואימונותרפיה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר השראה עקבית של EAE לצורך תיקוף תפקודי של מטרות במדעי הנוירו-אימונולוגיה.
- מפחית עמימות מכניסטית על ידי סטנדרטיזציה של אספקת האנטיגן והפעלה חיסונית.
- תומך בביטחון חיזוי במודלים פרה-קליניים הרלוונטיים למחלה.
- מקל על תעדוף תיק הפרויקטים (portfolio triage) על ידי הבטחת תוצאות ביולוגיות הניתנות לשחזור.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין אמולסיות שעברו תיקוף עבור תהליכי חיסון המשכיים.
- משפר את השחזרות של הבדיקה ואת הסטנדרטיזציה בין מחקרים.
- מאפשר הערכה כמותית של גודל חלקיקי האמולסיה ויציבותה.
- תומך בפרוטוקולים ניתנים להרחבה ולהעברה עבור מחקרים רב-מרכזיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את השראת מודל ה-EAE עם נקודות קצה תרגומיות הרלוונטיות למחלה.
- מבטיחה רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף הפרה-קליני על ידי מזעור השונות בין סדרות.
- מפחיתה סיכונים בהחלטות על קידום המחקר באמצעות אספקת מודלים של מחלה חסונים וניתנים לשחזור.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטת הומוגניזציה זו משתלבת בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לפיתוח מודלים פרה-קליניים, ותומכת בתהליכי עבודה החל מבדיקת היפותזות ועד לזיהוי מועמדים מובילים.
- ביולוגיה של גילוי: מתקנן את הובלת האנטיגן/אדג'ובנט למחקרים של הפעלת מערכת החיסון מונחי-השערה.
- סריקה: מספקת אמולסיות הניתנות לשחזור להערכה אמינה של תרכובות או חומרים ביולוגיים במודלים של EAE.
- אנליטיקה: מאפשרת ניתוח כמותי של גודל חלקיקים וניטור יציבות לצורכי בקרת איכות.
- מחקר תרגומי: שומר על נאמנות מודל המחלה עבור מחקרי סממנים ביולוגיים ויעילות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול בר-הרחבה שאינו תלוי במפעיל וניתן להתאמה למודלים אחרים של מחלות אוטואימוניות ואימונותרפיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית את אי-הוודאות המכניסטית במחקרי מודלים של מחלות אוטואימוניות.
- ערך תפעולי: מספק הכנה סטנדרטית, ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה של אמולסיות בין צוותים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מזעור השונות הניסויית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של נכסי אימונולוגיה ונוירו-דלקת.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות טכנית בתפעול הומוגניזטור ובהערכת איכות האמולסיה.
- נדרשת גישה להומוגניזטורים עם ניעור, מיקרוסקופיה בניגודיות פאזה (Phase Contrast) ואנליזטורים לגודל חלקיקים לצורכי בקרת איכות (QC).
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של חישובי ריאגנטים ופרוטוקולי טיפול.
- ניתן להתאימה לאנטיגנים ואדג'ובנטים שונים עבור מודלים שונים של מחלות אוטואימוניות או אימונותרפיה.
- מגבלות מעשיות כוללות השקעה ראשונית בציוד והקפדה על הפרוטוקול לצורך שחזור התוצאות.
