שיטת הומוגניזציה מהירה, פשוטה וסטנדרטית להכנת אמולסיות אנטיגן/אדג'ובנטיות לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית
December 9th, 2022
כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, מודל חייתי של טרשת נפוצה, עכברים מחוסנים בתחליב מים בשמן המכיל אוטואנטיגן ואדג'ובנט שלם של פרוינד. בעוד שקיימים מספר פרוטוקולים להכנת אמולסיות אלה, מוצג כאן פרוטוקול הומוגניזציה מהיר, פשוט וסטנדרטי להכנת אמולסיה.
אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית או EAE היא מודל חייתי המשמש לפיתוח טיפולים חדשים ומשופרים לחולי טרשת נפוצה. גרימת מחלות ב-EAE דורשת תחליב שמן ומים מושלם כדי להשיג תוצאות עקביות. שיטת הכנת האמולסיה המוצגת כאן נקייה מהשפעה אנושית, ובכך מגבילה את חוסר העקביות מניסוי אחד למשנהו.
למרות שהשיטה הותאמה ל-EAE, ניתן להשתמש בה גם למודלים אחרים של מחלות אוטואימוניות וגם לבדיקת חיסונים לסרטן. כדי להכין את slurry CFA ב 100 מיליגרם של שחפת M מיובש בהקפאה H37 RA וחמישה, 3.2 מילימטרים חרוזי פלדה לצינור שבעה מיליליטר. לנער את הצינור בהומוגנייזר במשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר.
הוסף חמישה מיליליטר של אדג'ובנט IFA לצינור ונער שוב במשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר. לאחר מכן מעבירים את החרוזים לצינור טרי עם פיפטה שמשאירה את החרוזים מאחור ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. כדי להכין תחליב CFA/פפטיד, הורד קובץ משלים אחד כדי לחשב את הכמות הדרושה עבור כל מגיב.
לאחר מכן הניחו את הצינור המכוסה בבורג ואת הריאגנטים לשימוש על קרח. לאחר מכן, הוסף את רכיבי האמולסיה. תחילה PBS, אחר כך הפפטיד, ה- CFA slurry.
ולבסוף, IFA. סגור את הצינור עם המכסה בחוזקה על ידי הידוק ושחרור אותו מספר פעמים. יש לנער את השפופרת במרץ במשך 5 עד 10 שניות ביד כדי לערבב מראש את הריאגנטים.
מניחים את הצינור בהומוגנייזר הרועד ומהדקים אותו באמצעות המוט. הגדר את המהירות להגדרה הגבוהה ביותר ואת הזמן ל- 60 שניות. לאחר סיום הריצה, הניחו את הצינור על הקרח במשך שלוש דקות וחזרו על הריצה פעם או פעמיים נוספות עם אותן הגדרות.
צנטריפוגה את הצינור ב 300 G מדקה אחת כדי להסיר אוויר לכוד לדחוס את האמולסיה. הסר את המכסה מהצינור. הכנס את הבוכנה לתוך הצינור, ודחף אותה למטה לאט עד שהיא מגיעה לחלק העליון של התחליב.
הסר את מארז ההצמדה בתחתית הצינור על ידי סיבובו. לאחר מכן, הסר את הבוכנה מכל מזרקי ההזרקה והוסף מחט למזרקי ההזרקה. לאחר מכן חברו את גב מזרק ההזרקה למנעול הייעודי בתחתית הצינור ונעלו אותו עם טוויסט קצר.
העבר את האמולסיה מהצינור למזרק ההזרקה על ידי דחיפת הבוכנה בעדינות. עצור כאשר תחליב מגיע 0.15 מיליליטר סיום של מזרק ההזרקה. הפרידו את מזרק ההזרקה מהצינור והכניסו את הבוכנה בזהירות תוך הקפדה על כך ששום אוויר לא ייכנס למזרק זה.
דוחפים את הבוכנה עד שהתחליב יוצא מהמחט וחוזרים על התהליך למשך שארית התחליב הקיים בצינור. כדי לנתח את גודל חלקיקי המים והשמן הוסיפו טיפה זעירה של האמולסיה למגלשה במיקרוסקופ, מרחו אותה באמצעות כיסוי ולאחר מכן דחפו חזק בתנועה מעגלית כדי לשטח את התחליב. בחנו את האמולסיה המרוחה תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם הגדלה של פי 400 והתמקדו בשדה עם חד-שכבתי של התחליב.
ודא שחלקיקים קטנים, אחידים, אפורים או לבנים נראים לעין. תחליבים שנוצרו בשיטת ההומוגניזציה הציגו חלקיקים אפורים או לבנים בצורת שעועית המייצגים טיפות זעירות של מים ותחליבי שמן. לעומת זאת, טיפות האמולסיה שיוצרו בשיטת המזרק היו גדולות ורחבות יותר.
בשיטת המערבולת נצפו חלקיקים אפורים או שחורים גדולים המתאימים לבועות אוויר שנלכדו בתחליב. שינויים בפיזור גודל החלקיקים לאורך זמן שנמדדו באמצעות מנתח גודל חלקיקי שבירה בלייזר עבור תחליבי מים ושמן לא הראו כל שינוי בגודל החלקיקים במשך תקופה של שישה שבועות. התחליבים הטריים בני 3 שבועות ו-15 שבועות גרמו כולם למחלות EAE דומות בכל בעלי החיים שנוסו במהלך הניסוי.
עכברים פיתחו דפוס מחלה דומה בכל הניסויים שגילו כי שיטת ההומוגניזציה המוצגת כאן ייצרה אמולסיות שגרמו ל-EAE באופן עקבי וניתן לשחזור. לפני הכנת האמולסיה לניסוי, הורד קובץ משלים מספר אחת כדי לחשב את הכמות של כל רכיב הדרושה כדי למזער את הפסולת. השיטה המוצגת כאן יכולה לשמש לסטנדרטיזציה של הכנת תחליב לא רק למחקר פרה-קליני, אלא גם בעתיד להכנת חיסונים לסרטן במרפאה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג שיטה סטנדרטית להכנת תחליב מים-ב-שמן להשראת דלקת אוטואימונית ניסויית (EAE), מודל חיות לטווח טווח ריבוי. השיטה נועדה להפחית את השונות בתוצאות על ידי צמצום ההשפעה האנושית במהלך הכנת התחליב.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- אימונולוגיה
- מחקר מחלות אוטואימוניות
רקע
- דלקת אוטואימונית ניסויית (EAE) משמשת לחקר טווח טווח ריבוי.
- הכנת תחליב עקבית היא חיונית לתוצאות ניסוייות אמינות.
- שיטות עכשוויות עשויות להשתנות באופן משמעותי, ולהשפיע על הניתנות לשחזור.
- מחקר זה מציג פרוטוקול הומוגניזציה מהיר ופשוט.
מטרת המחקר
- להציג שיטה סטנדרטית להכנת תחליב.
- להפחית את השונות בהשראת EAE.
- לספק פרוטוקול שיכול לחול על מודלים אוטואימוניים אחרים ובדיקת חיסונים נגד סרטן.
שיטות ששימשו
- הכנת תרחיף CFA באמצעות M tuberculosis H37 RA מיובש בהקפאה.
- שימוש בחרוזי פלדה ובהומוגניזר להכנת התחליב.
- אופטימיזציה של זמן ומהירות הניעור לקבלת עקביות.
- יישום השיטה על EAE ומודלים אחרים.
תוצאות עיקריות
- השיטה הפיקה תחליב יציב המתאים להשראת EAE.
- הפחתת ההשפעה האנושית הביאה לתוצאות ניסוייות עקביות יותר.
- הוכחה ליישומיות על מודלי מחלות אוטואימוניות אחרים.
- ציינו שימוש פוטנציאלי בבדיקת חיסונים נגד סרטן.
מסקנות
- שיטת הכנת התחליב הסטנדרטית משפרת את הניתנות לשחזור במחקרי EAE.
- גישה זו יכולה להתאים ליישומים מחקריים שונים.
- מחקרים עתידיים עשויים להפיק תועלת מהפרוטוקול הזה כדי לשפר את תוצאות הניסויים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Standardized antigen/adjuvant emulsion preparation is critical for reproducible induction of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a key preclinical model for multiple sclerosis drug discovery. This homogenization-based method minimizes operator variability, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Reliable emulsion quality directly impacts predictive confidence and portfolio triage for autoimmune and immunotherapy programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent EAE induction for functional target validation in neuroimmunology.
- Reduces mechanistic ambiguity by standardizing antigen delivery and immune activation.
- Supports predictive confidence in disease-relevant preclinical models.
- Facilitates portfolio triage by ensuring reproducible biological outcomes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated emulsions for downstream immunization workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization across studies.
- Enables quantitative assessment of emulsion particle size and stability.
- Supports scalable and transferable protocols for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EAE model induction with disease-relevant translational endpoints.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by minimizing batch-to-batch variability.
- De-risks advancement decisions by providing robust, reproducible disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This homogenization method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification.
- Discovery Biology: Standardizes antigen/adjuvant delivery for hypothesis-driven immune activation studies.
- Screening: Provides reproducible emulsions for reliable compound or biologic evaluation in EAE models.
- Analytics: Enables quantitative particle size analysis and stability monitoring for quality control.
- Translational Research: Maintains disease model fidelity for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, operator-independent protocol adaptable to other autoimmune and immunotherapy models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in autoimmune model studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable emulsion preparation across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by minimizing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunology and neuroinflammation assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in homogenizer operation and emulsion quality assessment.
- Needs access to shaking homogenizers, phase contrast microscopy, and particle size analyzers for QC.
- Demands cross-team standardization of reagent calculations and handling protocols.
- Adaptable to various antigens and adjuvants for different autoimmune or immunotherapy models.
- Practical limitations include initial equipment investment and protocol adherence for reproducibility.
