כימות קומפלקסים של Myeloperoxidase-DNA ו-Neutrophil Elastase-DNA ממלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים באמצעות כריך ELISA שעבר שינוי

NETs משכו תשומת לב לאחרונה, אך כימות NETs in vivo הוכח כמאתגר. פרוטוקול זה מספק שיטה רצויה, רגישה ובעלת ערך רב לחקר המאפיינים של NETs במסגרות קליניות. טכניקה זו צריכה להרחיב כדי להעריך את חומרת אלח דם או ARDS, תסמונת מצוקה נשימתית חריפה.

מקובל כי ויסות מזבלות או דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק הוא המפתח לשיפור המצב הקליני של אלח דם. היתרון הגדול ביותר של שיטה זו כולל כימות מדויק של שאריות NET במחזור כמו myeloperoxidase-DNA ו neutrophil elastase-DNA בזמן קצר. מומלץ לסובב את הדגימות לפני הבדיקה ולהימנע מהפשרה חוזרת.

חשוב לעקוב אחר זמני הדגירה כפי שניתנו בפרוטוקול. התחל על ידי דילול נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים מבודדים טריים ל -10, 000 תאים למיליליטר ב- RPMI ללא אדום פנול 1640. מסננים אותם בצלחות תרבית של 35 מילימטר.

כדי לגרום למלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות או NETs, תחילה לעורר את הנויטרופילים הפולימורפו-גרעיניים עם PMA ננו-מולרי של 25. לאחר מכן עיכלו חלקית את המלכודות החוץ תאיות על ידי הוספת 0.6 מיקרוגרם למיליליטר של DNase I, ודגרו על התערובת במשך 50 דקות בטמפרטורת החדר. כעת, הוסף EDTA של חמישה מילימולרים כדי לעצור את פעילות ה- DNase, ולאסוף את המדיום המכיל את רשתות המסונתזות.

צנטריפוגה להסרת פסולת התא. אספו את הסופרנאטנטים מארבע בקרות בריאות. מערבבים, מאחסנים אותם בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף.

פיפטה 100 מיקרוליטר של אנטי myeloperoxidase מדולל המכיל 0.05 מיקרוגרם של הנוגדן לתוך צלחת ELISA. כעת, כסו את הצלחת בכיסוי פלסטיק דביק למניעת אידוי הדגימה, ודגרו על הדגימה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר את קשירת נוגדני הלכידה. למחרת, להשליך את תמיסת הנוגדנים המדוללת מהבארות, ופיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה לכל באר.

יש לייבש את הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר את עודפי PBS. חסום כל באר של הצלחת עם 200 מיקרוליטר של חיץ החסימה. מכסים אותו בכיסוי פלסטיק דביק, וחוסמים את הבארות על ידי דגירה עליו.

לאחר השלכת תמיסת החסימה מהבארות ושטיפת הצלחת שלוש עד ארבע פעמים, טפחו עליה יבשה על מגבת נייר. לאחר מכן, פיפטה 25 מיקרוליטר של פלזמה לתוך כל הבארות למעט הריק. ולדלל אותו עם 75 מיקרוליטר של PBS, מה שהופך את נפח הבאר הסופי 100 מיקרוליטר.

לאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטר של PBS לבאר הריקה. ערבבו את הדגימות על ידי הנחת הצלחת על שייקר למשך 10 שניות ב-250 סל"ד בטמפרטורת החדר. הוסיפו שני מיקרוליטרים של 100 DNase I בדילול מלא לכל הבארות, והניחו את הצלחת האטומה על השייקר למשך 10 שניות כדי לערבב היטב את הדגימות.

יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף מיקרוליטר אחד של 0.5 EDTA מולארי לכל באר כדי לעצור את תגובת DNase. לאחר מכן הניחו את הצלחת האטומה על השייקר למשך 15 שניות כדי לערבב היטב את הדגימות.

לבסוף, לדגור על הצלחת במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר לרכיבי החלבון של ה- NETs להיצמד לנוגדנים לכידה. למחרת, השליכו את הפתרון מהבארות. לאחר שטיפות באר מרובות, פיפטה 100 מיקרוליטר של נוגדן אנטי DNA מצומד peroxidase מצומד לתוך כל באר.

לדגור על הצלחת במשך 1 1/2 שעות, ולאחר מכן להשליך את הפתרון בארות. לאחר שטיפת הבארות שלוש פעמים, פיפטה 100 מיקרוליטר של מצע ABTS תמיסת מצע לתוך כל באר, ולדגור את הצלחת האטומה על שייקר בחושך. עצור את התגובה על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של חומצה גופרתית דו טוחנת.

מערבבים את תכולת הבאר על ידי הקשה זהירה על דפנות הצלחת. לאחר מכן, חבר את קורא microplate למחשב ולהפעיל את יישום התוכנה. בשורת המצב, צור ניסוי חדש ותן לו שם.

לאחר מכן הגדר את פרמטרי קריאת הלוחות על-ידי בחירה באפשרות 'בליעה' כסוג הקריאה, 'נקודת קצה' כמצב קריאה ושניים כאורכי הגל. לאחר מכן, קבעו למבדה אחת כ-405 ננומטר, למבדה שתיים כ-490 ננומטר. כעת, בחר את מצב כבוי הן עבור Automix והן עבור Blanking תוך שמירה על הכיול האוטומטי כמופעל.לאחר מכן בחר קרא את כל הצלחת תחת רצועות.

לבסוף, הגדר את עדיפות אורך גל עמודה עם רגיל כמהירות גררה ולאחר מכן בחר כבוי תחת קריאה אוטומטית. הכניסו את הצלחת היטב למגירת המכשירים וסגרו אותה. לחץ על קרא כך שהצלחת תיקרא מיד.

קרא את הספיגה של כל באר ב 405 ננומטר, ובצע חיסור אוטומטי של ספיגת מדיום הבדיקה מכל הדגימות הלא ידועות. עקומות כיול סטנדרטיות אמינות התקבלו הן עבור MPO-DNA והן עבור NE-DNA כאשר ערכי הספיגה לא עלו על 0.93 ו-0.9, בהתאמה. OD הגבוה ביותר התקבל כאשר 0.6 מיקרוגרם למיליליטר של DNase I יושם.

מקדמי השונות בין הבדיקות עבור המתחמים בבקרות בריאות היו 1.871 ו-0.987, בהתאמה, ואילו חולי הקורונה הראו מקדמי שונות של 2.532 ו-2.010, בהתאמה. מקדמי השונות הממוצעים של MPO-DNA ו-NE-DNA היו 6.524 ו-4.389, בהתאמה. הספציפיות של נוגדני הלכידה לקומפלקסים MPO-DNA ו- NE-DNA הראתה כי נוגדני הבקרה מסוג ISO הגיבו מעט לקומפלקסים.

אחוז שני המתחמים היה גבוה יותר בפלזמה מחולי קורונה ביחס לבקרות הבריאות. זמן העיכול של DNase צריך להיות אופטימלי, אחרת עיכול מוגזם יפחית את הספיגה.