הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-Moss Physcomitrium patens
10 בפברואר 2023
כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיה של הדינמיקה התלת-ממדית של דופן התא ברקמת טחב חי, המאפשר הדמיה של ניתוק דפנות התא במוטנטים מסוג ggb ועיבוי דפוסי דופן התא בסוג הבר במהלך ההתפתחות לאורך תקופה ארוכה.
הדמיה בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשרת התבוננות בשינויים הדינמיים של גדילה והתפתחות ברמה התאית והתת-תאית. פרוטוקול פשוט זה להדמיית קיטועי זמן תלת-ממדיים יכול לחקור ישירות את הדינמיקה של דופן התא לאורך תקופה ארוכה. פרוטוקול זה משתמש בצבע calcofluor כדי לסמן את הדינמיקה של עובי דופן התא, ולכן אינו דורש טרנספורמציה של חלבון פלואורסצנטי.
אותות calcofluor הם יציבים והוא יכול להימשך יותר משבוע. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות רבות אחרות עם מבנים פשוטים המכילים דפנות תאים והוא יכול להיות מוכתם על ידי calcofluor כגון בצמחים פורחים. בפרוטוקול זה, אותות הקלקופלור יציבים כאשר צבע זה מעורבב בתווך במהלך כל התהליך של הדמיה בהילוך מהיר.
כדי להתחיל, לפזר את רקמת הטחב בת שבעת הימים לתוך צינור מיקרו 1.5 מיליליטר המכיל 20 מיקרוליטר של מים מעוקרים. עבור סוג פראי להשתמש מלקחיים כדי להפריד את protonemata. עבור מוטציית ggb, יש להפריד את הפרוטונמטה באמצעות פיפטה AP-1000.
מוסיפים 10 מיקרוליטר של הקלקופלור-לבן המעוקר לתוך המיקרו-צינור ומשאירים את הצינור זקוף במכסה המנוע למשך שתי דקות להכתמה. מיד לאחר הצביעה, מערבבים את הצמחים עם 200 מיקרוליטר של BCDATG מקורר המכיל מדיום BCDAT על ידי פיפטינג חמש פעמים עם פיפטה P1000 ומעבירים את התערובת לצלחת בסיס זכוכית 27 מילימטר. ודא כי 200 מיקרוליטר של BCDATG עם דגימות מופץ באופן שווה על פני השטח של צלחת זכוכית 27 מ"מ תחתית כדי לייצר שכבה דקה של סרט כך הדגימות נמצאים במרחק העבודה האובייקטיבי במהלך ההדמיה.
לאחר התמצקות במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, מכסים את השכבה הדקה בשלושה מיליליטר של BCDATG מקורר ומניחים לה להתייצב למשך 10 דקות כדי להתמצק שוב. בתחתית המנה מציירים תשעה קווים כל אחד בכיוונים מקבילים ומאונכים ומסמנים את השורות בתווים מא' עד ח', ואת העמודות במספרים מאחת עד שמונה. השתמש בחלק העליון, התחתון, הימני, האמצעי והשמאלי כדי לסמן את המיקומים בתוך כל ריבוע.
לדוגמה, אם צמח נמצא בריבוע בשורה השנייה, בעמודה השישית וממוקם בחלק השמאלי העליון של הריבוע, אז צמח זה מקבל את השם b6 בפינה השמאלית העליונה. הניחו את צלחת תחתית הזכוכית תחת אור לבן למשך יום עד יומיים לפני שתעברו הדמיה בהילוך מהיר מדי יום, למשך עד שלושה ימים. כדי לבנות מחדש את התמונות התלת-ממדיות, פתח את הקובץ ND2 ולחץ על אמצעי אחסון.
לשחזר את דופן התא ביום אפס, ביום הראשון, ביום השלישי וביום הרביעי. לאחר צילום כל תמונה, החזירו את הצלחת מבוססת הזכוכית לתא הגידול. שינויים דינמיים בדפנות הצולבות הודגמו על ידי צביעה לבנה בקלקופלור בסוג פראי, ומוטציות ggb.
עבור מוטציות ggb, קווים מקווקווים לבנים מתחת לכל תמונה מציינים את דופן תא המשטח השבור בתאים המתרחבים, וקווים כתומים מציינים את התאים מתחת לפני השטח של דופן התא ב- ggb. ההבדלים באות הקלקופלור-לבן יכולים להיות מזוהים על מיקומי פני השטח של התאים ואזורים מוכתמים פחות בצפיפות הצביעו על התרחבות תאים במוטציות ggb או באתרי הסתעפות חדשים בסוג הבר. עבור תרבית טרום תרבית מסוג בר, הצמחים באור אדום חלש מלמעלה במשך חמישה ימים נדרשים כדי לעורר את התגובה הפוטוטרופית של פרוטונמטה, כך שניתן יהיה לחבר את הצמחים לתחתית הכלים וניתן יהיה לצאת מהצמחים במרחק העבודה האובייקטיבי במהלך ההדמיה מכיוון שניתן להשתמש בקלקופלור-לבן עם צבעים אחרים כגון מיקרוספירה.
מידע נוסף על התרחבות התא ניתן גם ללמוד. דינמיקה של דופן תא הצמח היא קריטית לביצוע יעיל של צמיחה והתפתחות, כמו גם לתגובה לאותות סביבתיים. פרוטוקול זה מאפשר חלוקה ישירה של שינויים באותות דופן התא ואינטגרציה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב היד הנוכחי מציג פרוטוקול מפורט להדמיה בתלת-ממד של דינמיקת דופן התאים ברקמת אזוב חיה. השיטה מאפשרת הדמיה של ניתוק דופן התאים במוטציות ggb ודפוסי העיבוי באזוב מסוג בר במהלך התפתחות לאורך תקופה ממושכת.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- התפתחות צמחים
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- הדמיה תלוית זמן חיונית לצפייה בדינמיקת תאים.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת הדמיה מפורטת של תהליכי צמיחה.
- צבע קלקופלור משמש לצביעת דופן התאים ללא צורך בטרנספורמציה של חלבונים פלואורסצנטיים.
- היציבות של אותות הקלקופלור משפרת את האמינות של ההדמיה לאורך זמן.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול להדמיה של דינמיקת דופן התאים באזוב.
- לחקור את ההבדלים בהתנהגות דופן התאים בין מוטציות ggb לאזוב מסוג בר.
- לספק שיטה הניתנת ליישומים במערכות צמחים אחרות עם דופן תאים.
שיטות ששימשו
- הדמיה בתלת-ממד תלוית זמן עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- שימוש בצבע קלקופלור לסימון דינמיקת דופן התאים.
- שימוש באותות קלקופלור יציבים לאורך כל תהליך ההדמיה.
- יישום הפרוטוקול על מערכות צמחים שונות.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של ניתוק דופן התאים במוטציות ggb.
- תצפית על דפוסי העיבוי באזוב מסוג בר.
- הוכחת יישום הפרוטוקול על מבנים צמחיים אחרים.
- אימות אותות קלקופלור יציבים לאורך תקופות הדמיה ממושכות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה אמינה לחקר דינמיקת דופן התאים.
- התובנות שהושגו יכולות לשפר את ההבנה של התפתחות הצמחים.
- שיטה זו יכולה להתאים לשימוש במיני צמחים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics using calcofluor in Physcomitrium patens enables direct, quantitative visualization of cell wall remodeling over extended periods without genetic transformation. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence in plant cell wall biology, which is critical for early discovery and target validation in crop trait engineering and plant-based bioproduction. The method's stability and adaptability position it as a reusable capability for diverse cell wall-containing systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell wall remodeling and expansion mechanisms in live tissues.
- Supports functional validation of genetic perturbations affecting cell wall integrity.
- Facilitates predictive confidence in pathway assignment and target prioritization for plant cell wall biosynthesis.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible readout for cell wall dynamics without the need for transgenic lines.
- Delivers quantitative, time-resolved imaging outputs suitable for comparative analysis across genotypes or treatments.
- Enables scalable preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by correlating cell wall staining patterns with future expansion or branching sites.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in plant-based production systems.
- Reduces biological risk by providing mechanistic insight into cell wall defects and their phenotypic consequences.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for plant cell wall research, supporting both hypothesis-driven studies and screening campaigns.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on cell wall expansion and integrity in live tissues.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Supports statistical comparison of cell wall dynamics across genotypes and time points.
- Translational Research: Facilitates alignment of imaging biomarkers with phenotypic outcomes relevant to plant productivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple plant systems and experimental contexts requiring cell wall visualization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell wall biology.
- Operational Value: Offers standardized, scalable, and reproducible imaging workflows without genetic modification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of cell wall targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of plant-based R&D programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and time-lapse imaging analysis.
- Needs access to stable calcofluor dye and compatible imaging instrumentation.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- Adaptable to various plant systems with cell walls amenable to calcofluor staining.
- Signal stability and imaging duration should be validated for each new system.
