Name: הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-Moss Physcomitrium patens (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: חקור דינמיקת דופן תא בצמחי Physcomitrium patens באמצעות הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר וצביעת calcofluor. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר שינויי עובי הדופן לאורך זמן ללא צורך בטרנספורמציה של חלבונים פלואורסצנטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד"ר סוסי פטרישיה ובטי נון מאוניברסיטת לואיוויל על הסיוע במיקרוסקופ הקונפוקלי. עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע (1456884 ל- M.P.R.) ועל ידי הסכם שיתוף פעולה של הקרן הלאומית למדע (1849213 ל- M.P.R).

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימת החומרים והציוד ובטבלה 1 לקבלת רשימת הפתרונות שישמשו בפרוטוקול זה.
1. הכנת צמחים לכלים תחתונים מזכוכית
<ol><li>לגדל את הרקמה פרוטונמלית טחב בתווך אגר BCDAT בצלחת פטרי 13 ס"מ תחת אור לבן קבוע (~ 50 μmol m-2 s-1) במשך 7 ימים ב 25 ° C בתא הצמיחה.</li>
	<li>יש לסנן-לעקר את הקלקופלור בלבן ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש. מגיב יציב במשך מספר חודשים.</li>
	<li>פזרו את רקמת הטחב בת 7 הימים לתוך מיקרו-צינורית בנפח 1.5 מ"ל המכילה 20 מיקרוליטר מים מעוקרים. ודא שרקמת הטחב פרוטונמלית מפוזרת מספיק כחתיכות קטנות במים. עבור סוג פראי (WT), השתמש במלקחיים כדי להפריד את הפרוטונמטה; עבור מוטציית GGB , השתמש בפיפט P-1000.</li>
	<li>הוסף 10 μL של calcofluor לבן מעוקר לתוך microtube 1.5 מ"ל ולהשאיר את microtube זקוף במכסה המנוע במשך 2 דקות עבור צביעה.</li>
	<li>מיד לאחר הצביעה, יש לערבב את הצמחים עם 200 μL של BCDATG מקורר, המכיל BCDAT בינוני בתוספת 0.5% (w/v) גלוקוז ו-0.4% (w/v) gellan gum, על ידי פיפטה חמש פעמים עם פיפטה P-1000. הערה: ודא שמדיום BCDATG מקורר מספיק (ממש לפני שהתווך מתמצק) כדי למנוע לחץ על הצמחים.</li>
	<li>מעבירים את התערובת המכילה את הצמחים ואת מדיום BCDATG לצלחת בסיס זכוכית בקוטר 27 מ"מ. ודא כי נפח BCDATG לערבוב התאים אינו עולה על 200 μL וכי 200 μL של BCDATG עם דגימות מופץ באופן שווה על פני השטח של צלחת תחתית זכוכית 7 מ"מ כדי לייצר שכבה דקה של סרט, כך הדגימות נמצאות במרחק העבודה האובייקטיבי במהלך ההדמיה.</li>
	<li>לאחר התמצקות במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, מכסים את השכבה הדקה ב-3 מ"ל BCDATG מקורר ומניחים לה להתייצב למשך 10 דקות כדי להתמצק שוב. הערה: ודא ששלבים 1.2-1.5 מתבצעים במכסה מנוע סטרילי כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>בתחתית המנה, ציירו תשעה קווים כל אחד בכיוונים מקבילים ומאונכים (איור 2). סמן את השורות בתווים מ- a עד h וסמן את העמודות במספרים מ- 1 עד 8. השתמש בחלק העליון, התחתון, הימני, האמצעי והשמאלי כדי לסמן את המיקומים בתוך כל ריבוע. לדוגמה, אם צמח נמצא בריבוע בשורה השנייה ובעמודה השישית וממוקם בחלק השמאלי העליון של הריבוע, אז צמח זה מקבל את השם "b6_upper_left".</li>
	<li>קדם גידול צלחת תחתית זכוכית המכילה את הצמחים תחת אור אדום במשך 5 ימים ב 25 ° C בתא הצמיחה, ולאחר מכן תחת אור לבן במשך 1-2 ימים לפני להיות נתון הדמיה time-lapse כל יום עד 3 ימים. עבור WT, טרום גידול הצמחים באור אדום חלש (0.5 μmol m-2 s-1) מלעיל במשך 5 ימים כדי לגרום לתגובה פוטוטרופית של הפרוטונמטה, כך שהצמחים יכולים להתחבר לתחתית הכלים11. הערה: האור האדום החלש מסופק על ידי העברת אור לבן דרך מסנן פלסטיק אקרילי אדום בעובי 3 מ"מ לתוך קופסאות חסינות אור. עבור מוטנטים של ggb, גידול באור אדום הוא אופציונלי, מכיוון שלמוטנטים של ggb אין תגובה פוטוטרופית3.</li>
</ol>2. הדמיה ושחזור תלת מימד
<ol><li>הניחו את צלחת תחתית הזכוכית המכילה צמחים על במה של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, כאשר תחתית הזכוכית פונה למטרה. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי להדמיה של calcofluor עם עדשה אובייקטיבית 20x. צלם תמונות עם לייזר של 405 ננומטר, חור הסיכה ב- 1.0, רווח HV ב- 100, כוונון רקע היסט ב- 0, עוצמת לייזר ב- 5%-7%, גודל סריקה של 1,024 x 1,024 ומהירות סריקה של 1/2 מסגרת לשנייה. אסוף 17-30 מקטעים אופטיים מסדרה z בגודל צעד של 1.0 מיקרומטר. תן שם לתמונות באמצעות הקוד בשלב 1.6, כגון "b6_upper_left-day0", ושמור.<ol><li>בחר את ערוץ DAPI ברכישה וסמן את התיבה Z ב- ND Acquisition. כדי להגדיר את הגבול התחתון והעליון עבור ערימת Z, לחץ על הלחצנים העליון והתחתון.</li>
	</ol></li>
	<li>לבנייה מחדש של התמונות התלת-ממדיות, פתחו את קובץ ה-nd2 (איור 3A; ראו טבלת חומרים) ולחצו על אמצעי האחסון (איור 3B).</li>
</ol>3. הדמיה של אותם צמחים בנקודות זמן שונות
<ol><li>לאחר כל הדמיה, החזירו את צלחת בסיס הזכוכית לתא הצמיחה.</li>
	<li>חזור על הפעולה משלב 2.1 עבור הדמיה ושחזור תלת-ממדי. הערה: כדי למצוא את אותם צמחים, השתמש בקוד המוזכר בשלב 1.6 ותן את השם "b6_upper_left-day1", או "b6_upper_left-day2", בהתאם לגיל הצמחים.</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, C. T., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+construction%2C+perception%2C+and+remodeling+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).</li>
<li>Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+integrity+maintenance+during+plant+development+and+interaction+with+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Naure+Plants%22%5BJournal%5D)">Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment.</a> Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).</li>
<li>Bao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+function+of+ROP+GTPase+prenylation+important+for+multicellularity+in+the+moss+Physcomitrium+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens.</a> Development. 149 (12), (2022).</li>
<li>Colin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+living+plant+cell%3A+From+probes+to+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging the living plant cell: From probes to quantification.</a> The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).</li>
<li>Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFang%2C+Y+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2010 (2), (2010).</li>
<li>Goh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live-cell+imaging+approaches+to+study+lateral+root+formation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana.</a> Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).</li>
<li>Hamant, O., Das, P., Burian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+developing+shoot+meristems+using+a+confocal+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).</li>
<li>Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+FM4-64%2C+a+tool+for+tracing+the+endocytic+pathways+in+Arabidopsis+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).</li>
<li>Yagi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+synthetic+fluorescent+probe+labeling+for+live-cell+imaging+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants.</a> Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).</li>
<li>Whitewoods, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLAVATA+was+a+genetic+novelty+for+the+morphological+innovation+of+3D+growth+in+land+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants.</a> Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).</li>
<li>Bao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PSTAIRE-type+cyclin-dependent+kinase+controls+light+responses+in+land+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants.</a> Science Advances. 8 (4), 2116(2022).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים או כלכליים.

שחזור תלת-ממדי בהילוך מהיר, או הדמיה 4-D, הוא כלי רב עוצמה לצפייה בדינמיקה של המורפולוגיה התאית במהלך תהליכים התפתחותיים. בפרוטוקול זה, על ידי ערבוב הקלקופלור הלבן בתווך, ניתן לראות את הדינמיקה של המורפולוגיה התאית התלת-ממדית בטחב P. patens. באמצעות שיטה זו, ראינו כי פני השטח של דפנות התא במוטציות ggb נקרעים לגזרים במהלך התפתחות3. יתר על כן, העיבוי המופחת של דפנות התא מתואם עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות התא בסוג פראי, מה שמאפשר חיזוי של אתרי ההתפשטות/הסתעפות. יתר על כן, מכיוון שניתן ל...

דפנות תאי הצמח עוברות שינויים דינמיים במהלך התרחבות התאים והתפתחותם 1,2,3. שמירה על שלמות דופן התא היא קריטית להידבקות תאי צמח במהלך גדילה והתפתחות, כמו גם לתגובה לאותות סביבתיים. למרות שהדמיית דינמיקה של דופן התא של תאים חיים לאורך תקופת זמן ארוכה היא קריטית להבנת האופן שבו הידבקות התא נשמרת במהלך הפיתוח והסתגלות לשינויים סביבתיים, השיטות הנוכחיות לצפייה ישירה בדינמיקה של דופן התא עדיין מאתגרות.
הדמיה בהילוך מהיר של שינויים תאיים יכולה לספק דינמיקה התפתחותית אינפורמטיבית של אורגניזם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה 4,5,6,7. בעוד שהדמיית תלת-ממד בהילוך מהיר היא בעלת פוטנציאל רב לחקר שינויים דינמיים בצורת התא במהלך גדילה והתפתחות, הטכניקה דורשת בדרך כלל טרנספורמציה של חלבון פלואורסצנטי 4,5,6,7. עם זאת, עבור רוב המערכות, טרנספורמציות גנטיות גוזלות זמן רב או מאתגרות מבחינה טכנית. כחלופה, צבעים פלואורסצנטיים המתחברים לרכיבים תאיים זמינים זה מכבר. הצבעים הפלואורסצנטיים יכולים לפלוט אור פלואורסצנטי לאחר הקרנה עם אור באורך גל מסוים. דוגמאות נפוצות הן Edu, DAPI, PI, FM4-64 ו- calcofluor לבן 8,9,10. חיסרון עיקרי אחד, עם זאת, הוא שצבעים אלה יכולים לשמש בדרך כלל רק ברקמות קבועות או לניסויים קצרים, בין השאר בשל הנזק שהם גורמים לתא 8,9,10.
עם הפרוטוקול המוצג כאן, אותות calcofluor יציבים כאשר calcofluor לבן מעורבב בתוך התווך במהלך ניסויים time-lapse ב טחב P. patens. באמצעות שיטה זו, ניתוק תאים במוטציות ggb באמצעות הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר נצפהבמשך תקופה של 3 ימים 3 (איור 1). שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות רבות אחרות המכילות קירות התא וכי יכול להיות מוכתם על ידי calcofluor.

<table><tbody><tr><td>מסנן אור פלסטיק אדום בעובי 3 מ"מ</td><td>&nbsp; מיצובישי</td><td>&nbsp; מס' 102</td><td></td></tr><tr><td>צלחת בסיס זכוכית בקוטר 27 מ"מ&nbsp;</td><td>איוואקי</td><td>3930-035</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>&nbsp; סיגמא</td><td>A6924</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor לבן&nbsp;</td><td>&nbsp; סיגמא</td><td>18909-100ML-F</td><td>Calcofluor לבן M2R, 1 גרם/ליטר וכחול אוונס, 0.5 גרם/ליטר</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי&nbsp;</td><td>ניקון&nbsp;</td><td>תוכנת אלמנטים A1</td><td> NIS; קובץ .nd2 במציג NIS-elements, להורדה מ-https://www.microscope.healthcare.nikon. com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer </td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי&nbsp;</td><td>ניקון&nbsp;</td><td>TE200&nbsp;</td><td>מצויד במצלמת DS-U3;</td></tr><tr><td>מסטיק גלן&nbsp;</td><td>Nacali Tesque</td><td>12389-96</td><td></td></tr><tr><td>תאי גידול צמחים</td><td>SANYO&nbsp;</td><td>Sanyo MLR-350H</td><td></td></tr><tr><td>מזרק מעוקר 0.22 &mu; מסנן m</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-moss physcomitrium patens

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

הדמיה בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשרת התבוננות בשינויים הדינמיים של גדילה והתפתחות ברמה התאית והתת-תאית. באופן כללי, עבור תצפיות על פני תקופה ארוכה, הטכניקה דורשת טרנספורמציה של חלבון פלואורסצנטי; עם זאת, עבור רוב המערכות, טרנספורמציה גנטית גוזלת זמן או אינה זמינה מבחינה טכנית. כתב יד זה מציג פרוטוקול להדמיית קיטוע זמן תלת-ממדי של דינמיקת דופן התא במשך 3 ימים באמצעות צבע קלקופלור (המכתים תאית בדופן תא הצמח), שפותח בפטנס פיסקומיטריום טחב. אות צבע הקלקופלור מדופן התא יציב ויכול להימשך שבוע ללא ריקבון ברור. באמצעות שיטה זו, הוכח כי ניתוק התאים במוטציות ggb (שבו תת-היחידה בטא geranylgeranyltransferase-I הוא דפק החוצה) נגרמת על ידי התרחבות תאים בלתי מבוקרת פגמים שלמות דופן התא. יתר על כן, דפוסי צביעת calcofluor להשתנות עם הזמן; אזורים מוכתמים פחות בעוצמה מתואמים עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות העתידיים של התאים בסוג הבר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות רבות אחרות המכילות קירות התא וכי יכול להיות מוכתם על ידי calcofluor.

שיטה זו מאפשרת תצפית על דינמיקה של דופן התא במהלך ההתפתחות במוטנטים מסוג בר ומוטציות ggb (איור 1). התוצאות הראו שאזורים עם פחות עיבוי של דופן התא מתואמים עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות של התא, מה שמאפשר חיזוי של אתרי התפשטות/הסתעפות בסוג הבר (איור 1A). פני השטח של דפנות התא במוטנטים של ggb נקרעו לגזרים במהלך ההתפתחות עקב התפשטות בלתי מבוקרת של תאים3 (איור 1B). יתר על כן, אות הצביעה של פני השטח השב...

כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיה של הדינמיקה התלת-ממדית של דופן התא ברקמת טחב חי, המאפשר הדמיה של ניתוק דפנות התא במוטנטים מסוג ggb ועיבוי דפוסי דופן התא בסוג הבר במהלך ההתפתחות לאורך תקופה ארוכה.

הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-Moss Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In ...

הדמיה בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשרת התבוננות בשינויים הדינמיים של גדילה והתפתחות ברמה התאית והתת-תאית. פרוטוקול פשוט זה להדמיית קיטועי זמן תלת-ממדיים יכול לחקור ישירות את הדינמיקה של דופן התא לאורך תקופה ארוכה. פרוטוקול זה משתמש בצבע calcofluor כדי לסמן את הדינמיקה של עובי דופן התא, ולכן אינו דורש טרנספורמציה של חלבון פלואורסצנטי.אותות calcofluor הם יציבים והוא יכול להימשך יותר משבוע. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות רבות אחרות עם מבנים פשוטים המכילים דפנות תאים והוא יכול להיות מוכתם על ידי calcofluor כגון בצמחים פורחים. בפרוטוקול זה, אותות הקלקופלור יציבים כאשר צבע זה מעורבב בתווך במהלך כל התהליך של הדמיה בהילוך מהיר.כדי להתחיל, לפזר את רקמת הטחב בת שבעת הימים לתוך צינור מיקרו 1.5 מיליליטר המכיל 20 מיקרוליטר של מים מעוקרים. עבור סוג פראי להשתמש מלקחיים כדי להפריד את protonemata. עבור מוטציית ggb, יש להפריד את הפרוטונמטה באמצעות פיפטה AP-1000.מוסיפים 10 מיקרוליטר של הקלקופלור-לבן המעוקר לתוך המיקרו-צינור ומשאירים את הצינור זקוף במכסה המנוע למשך שתי דקות להכתמה. מיד לאחר הצביעה, מערבבים את הצמחים עם 200 מיקרוליטר של BCDATG מקורר המכיל מדיום BCDAT על ידי פיפטינג חמש פעמים עם פיפטה P1000 ומעבירים את התערובת לצלחת בסיס זכוכית 27 מילימטר. ודא כי 200 מיקרוליטר של BCDATG עם דגימות מופץ באופן שווה על פני השטח של צלחת זכוכית 27 מ"מ תחתית כדי לייצר שכבה דקה של סרט כך הדגימות נמצאים במרחק העבודה האובייקטיבי במהלך ההדמיה.לאחר התמצקות במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, מכסים את השכבה הדקה בשלושה מיליליטר של BCDATG מקורר ומניחים לה להתייצב למשך 10 דקות כדי להתמצק שוב. בתחתית המנה מציירים תשעה קווים כל אחד בכיוונים מקבילים ומאונכים ומסמנים את השורות בתווים מא' עד ח', ואת העמודות במספרים מאחת עד שמונה. השתמש בחלק העליון, התחתון, הימני, האמצעי והשמאלי כדי לסמן את המיקומים בתוך כל ריבוע.לדוגמה, אם צמח נמצא בריבוע בשורה השנייה, בעמודה השישית וממוקם בחלק השמאלי העליון של הריבוע, אז צמח זה מקבל את השם b6 בפינה השמאלית העליונה. הניחו את צלחת תחתית הזכוכית תחת אור לבן למשך יום עד יומיים לפני שתעברו הדמיה בהילוך מהיר מדי יום, למשך עד שלושה ימים. כדי לבנות מחדש את התמונות התלת-ממדיות, פתח את הקובץ ND2 ולחץ על אמצעי אחסון.לשחזר את דופן התא ביום אפס, ביום הראשון, ביום השלישי וביום הרביעי. לאחר צילום כל תמונה, החזירו את הצלחת מבוססת הזכוכית לתא הגידול. שינויים דינמיים בדפנות הצולבות הודגמו על ידי צביעה לבנה בקלקופלור בסוג פראי, ומוטציות ggb.עבור מוטציות ggb, קווים מקווקווים לבנים מתחת לכל תמונה מציינים את דופן תא המשטח השבור בתאים המתרחבים, וקווים כתומים מציינים את התאים מתחת לפני השטח של דופן התא ב- ggb. ההבדלים באות הקלקופלור-לבן יכולים להיות מזוהים על מיקומי פני השטח של התאים ואזורים מוכתמים פחות בצפיפות הצביעו על התרחבות תאים במוטציות ggb או באתרי הסתעפות חדשים בסוג הבר. עבור תרבית טרום תרבית מסוג בר, הצמחים באור אדום חלש מלמעלה במשך חמישה ימים נדרשים כדי לעורר את התגובה הפוטוטרופית של פרוטונמטה, כך שניתן יהיה לחבר את הצמחים לתחתית הכלים וניתן יהיה לצאת מהצמחים במרחק העבודה האובייקטיבי במהלך ההדמיה מכיוון שניתן להשתמש בקלקופלור-לבן עם צבעים אחרים כגון מיקרוספירה.מידע נוסף על התרחבות התא ניתן גם ללמוד. דינמיקה של דופן תא הצמח היא קריטית לביצוע יעיל של צמיחה והתפתחות, כמו גם לתגובה לאותות סביבתיים. פרוטוקול זה מאפשר חלוקה ישירה של שינויים באותות דופן התא ואינטגרציה.

3-d-time-lapse-imaging-cell-wall-dynamics-using-calcofluor-moss

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

השתקפות פנימית מוחלטת פלואורסצנטי (TIRF) מיקרוסקופיה היא גישה חזקה כדי לבחון מבנים סמוך לפני השטח של התא על ניגודיות גבוהה ורזולוציה הזמני. אנו מדגימים כיצד TIRF יכול להיות מועסק על מנת ללמוד על הדינמיקה חלבונים בקליפת המוח של קיר סגורים תאים תאים חיידקיים פטרייתי.

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

מאמר זה מספק פרוטוקול לגידול שתילים של ארבידופסיס ב RootChip, פלטפורמת הדמיה microfluidic המשלבת שליטה אוטומטית של תנאי הגידול עם מעקב שורש מיקרוסקופי ו להתרגז על בסיס מדידת רמות מטבוליט תאיים.

זמן לשגות דימות פלואורסצנטי של צמיחה רוט ארבידופסיס עם מניפולציה מהירה של הסביבה רוט שימוש RootChip

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

בסרטון זה, אנו מתארים הליך צביעה כדי לדמיין שקיעת תאית בתוך דפנות התא של Arabidopsis thaliana, צמח דיקוט, באמצעות calcofluor לבן, אשר נקשר במיוחד גלוקנים הקשורים β, מציג פלואורסצנטיות תחת אור UV.

צביעה לבנה Calcofluor: שיטה פשוטה להדמיית פלואורסצנטיות הנגרמת על ידי UV של משקעי תאית בדפנות התא של קטעי גזע צמח דיקוט

איתות 2 + Ca מסדירה תהליכים ביולוגיים מגוונים בצמחים. כאן אנו מציגים גישות לניטור לחץ אביוטי המושרה Ca מרחב ובזמן 2 + אותות בתאי ארבידופסיס ורקמות באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים מקודד גנטי Aequorin או Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca 2 + אותות בצמחים ארבידופסיס

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לפקח דינמיקת fluorescently- מתויג חלבון על משטחי תא צמח עם מיקרוסקופיה epifluorescence זווית משתנה, מראה מהבהב נקודות של PATROL1 מתויג GFP, חלבון סחר קרום, בקליפת התא של המתחם הפיוניות ב thaliana ארבידופסיס.

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

תאים חיידקיים במרחב מאוד מאורגנים. כדי לבצע את הארגון הזה לאורך זמן בתאים Myxococcus xanthus גדל לאט, פותחה מלכודת קרינה פלואורסצנטית הדמיה לחיות תאים עם רזולוציה גבוהה ייתכן במשך מספר דורות. באמצעות שיטה זו, ייתכן הדינמיקה של חלבונים חשובים על כרומוזום סגרגציה ועל חלוקת התא יכול להיקבע.

קרינה פלואורסצנטית Live-תא הדמיה של שלמה וגטטיבי תא מחזור של חיידק חברתית גידול איטי Myxococcus xanthus

אנחנו מדווחים על שיטה פשוטה רב-תכליתי לביצוע פלורסנט לחיות-הדמיה של עלים תודרנית לבנה על פני תקופה ארוכה של זמן. אנו משתמשים צמח תודרנית הטרנסגניים לבטא גן כתב פלורסנט תחת השליטה של יזם הקשורות חסינות כדוגמה להשגת הבנה ייתכן של תגובות חיסוניות הצמח.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

צבעי פלורסנט חיוניים הם כלים חיוניים לניתוח הדמיה של תא חי בביולוגיה מודרנית של תאים פטרייתיים. נייר זה מפרט את היישום של צבעי פלורסנט ידוע פחות ידועים עבור מעקב הדינמיקה קרום הפלזמה, אנדו-/אקסוציטוזה וקיר התא מורגנזה בפטריות filamentous.

יישום של ממברנה וקיר תא צבעי פלורסנט סלקטיבית עבור הדמיה בשידור חי התא של פטריות Filamentous

אנו מציגים שיטה פשוטה ונגישה להדמיית ציאנובקטריה נימית במישור XY. נעשה שימוש במטריצת אגרוז נקודת התכה נמוכה, המאפשרת רכישת תמונות של חלבונים המעורבים בחלוקה, בכיוון אנכי. לכן, מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על כל אורגניזם נימה וסוגים שונים של חלבונים.

שיטת אימוביליזציה אנכית לניתוח מיקרוסקופ בהילוך מהיר בכחוליות נימה

דוח זה מתאר את השיטות הבסיסיות המשמשות לתרבית ולמניפולציה ניסויית של אצת הסטרפטופיטים החד-תאית, Penium margaritaceum. הוא גם מספק פרוטוקולים בסיסיים של הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה, כולל תיוג תאים חיים עם נוגדנים חד-שבטיים ובדיקות פלואורסצנטיות אחרות ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

פרוטוקולי סינון ניסיוניים, אימונוציטוכימיה וטכניקות הדמיה מבוססות מיקרוסקופיה עבור Penium margaritaceum

חקור דינמיקת דופן תא בצמחי Physcomitrium patens באמצעות הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר וצביעת calcofluor. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר שינויי עובי הדופן לאורך זמן ללא צורך בטרנספורמציה של חלבונים פלואורסצנטיים.

הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-Moss Physcomitrium patens

גלה סרטונים נוספים