Name: פלטפורמת שבבים מיקרופלואידית קלינית לבידוד תאי גידול רב-תכליתיים במחזור הדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: למדו שיטת בידוד תאי גידול מיקרופלואידית קלינית לזיהוי CTCs בדם. הפרוטוקול משתמש בתאי MCF-7, MDA-MB-231 ו-HeLa עם צביעת Calcein AM ומיקרוצ'יפ לבידוד יעיל. השיטה משפרת מהירות ודיוק באבחון סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודת מחקר זו נתמכה על ידי קרן Anhui למדעי הטבע של סין (1908085MF197, 1908085QB66), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (21904003), פרויקט המחקר המדעי של ועדת החינוך של טיאנג'ין (2018KJ154), תוכנית המחקר המחוזית למדעי הטבע של מוסדות להשכלה גבוהה במחוז אנחווי (KJ2020A0239), ומעבדת המפתח של שנחאי לעיבוד מידע רב-ממדי, מעבדת המפתח של מזרח סין למידע רב-ממדי עיבוד, אוניברסיטת מזרח סין הרגילה (MIP20221).

דגימות דם של מטופלים סופקו על ידי בית החולים Longhua המסונף לאוניברסיטה הרפואית של שנחאי.הפרוטוקול עוקב אחר הנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי של בית החולים השלישי של אוניברסיטת פקין. התקבלה הסכמה מדעת מהמטופלים לשימוש בדגימות למטרות מחקר.
1. ניסוי מקדים לבדיקת יעילות הלכידה עם תאי גידול בתרבית
<ol><li>תרבית את תאי הגידול MCF-7, MDA-MB-231 ו-HeLa לקביעת יעילות הלכידה. לדלל את תרחיף תאי הגידול, לספור את מספר תאי הגידול ולחזור על הפעולה עד לקבלת מספר התאים הרצוי ב 1 מ"ל של PBS.<ol><li>תרבית את התאים בבקבוק תרבית תאים עם מספר תא התחלתי של ~ 1 x 105 תאים ב 1 מ"ל של מדיום הנשר של Dulbecco שונה (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. דגירה באטמוספירה לחה ב 37 °C (75 °F) עם 5% CO2 אטמוספירה.</li>
		<li>כאשר קווי התאים גדלים כחד-שכבות נצמדות למפגש של 95%, נתקו אותם מתרבית התרבית עם תמיסת טריפסין 0.25% למשך 2 דקות כמתואר ב-Chen et al.16.</li>
		<li>מכתימים את תאי הגידול עם calcein AM. שים 3 μL של calcein AM בצלחת התרבית, ולשמור את המנה באינקובטור במשך 30 דקות. לאחר מכן,לעכל את כל התאים עם טריפסין.</li>
		<li>לספור את תאי הגידול בתרבית PBS עם תא ספירת תאים, ולדלל עד 100 תאים סרטניים לכל 1 מ"ל של PBS מתקבלים. הערה: על מנת לספור במדויק את מספר התא, קח 50 μL של תרחיף התא המתקבל כדי לראות אם מספר תאי הגידול בו הוא חמישה או לא עם מיקרוסקופ. להחליט את נפח תרחיף התא שיש לקחת כדי לקבל 100 תאים סרטניים על פי המספר בפועל של תאי הגידול ב 50 μL של השעיית תאים.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנס את תרחיף התא המכיל 100 תאי גידול לכל 1 מ"ל PBS לתוך השבב המיקרופלואידי באמצעות מזרק עם משאבת מזרק בקצבי זרימה מגוונים של 0.5 מ"ל/שעה, 1 מ"ל/שעה, 2 מ"ל/שעה, 3 מ"ל/שעה, 4 מ"ל/שעה ו-5 מ"ל/שעה. השג את יעילות הלכידה עבור קצבי הזרימה השונים, וקבע את קצב הזרימה האופטימלי.<ol><li>ספרו את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב וזורמים החוצה מהשקע. חשב את יעילות הלכידה כמפורט להלן: יעילות לכידה = מספר התאים שנלכדו/(מספר התאים שנלכדו + מספר התאים הזורמים החוצה) × 100%</li>
		<li>חזור על הפעולה כדי להשיג את יעילות הלכידה עבור מספר שונה של תאי גידול מ 10 עד 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).</li>
	</ol></li>
	<li>בדוק ותקף את השבב המיקרופלואידי עבור מספר נדיר של תאים סרטניים. הזריקו את 10 המתלים לדוגמה אלה לתוך השבבים המיקרופלואידים באמצעות מחט חלולה העשויה עם מושך מיקרופיפטה כדי לשאוף 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ו -10 תאי גידול מדוללים ב -1 מ"ל של PBS. לזהות ולמנות את מספר תאי הגידול עבור כל דגימה לאחר לכידתם על השבב. הערה: אורך המחט החלולה הוא כ-3 ס"מ וקוטר חיצוני של 1 מ"מ.</li>
	<li>לבצע בדיקות קליניות לפני הניסוי עבור תאים סרטניים שהוקפצו לדגימות דם רגילות.<ol><li>לצבוע את תאי הגידול עם calcein AM, ולאחר מכן למנות 100 תאים סרטניים ב 5 μL של PBS. ספייק תאים אלה לתוך 1 מ"ל של דגימות דם נורמליות שלמות. הכנס תאים אלה לתוך השבב, ולמנות את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב עם immunofluorescence ירוק. בצע ספירת in vivo על השבב כמתואר לעיל, וחשב את יעילות הלכידה לאחר הלכידה.</li>
		<li>חזור על שלב 1.4.1 עבור תשעה ריכוזים נוספים של מספרי תאי גידול מ-10 עד 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).</li>
		<li>מנה 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ו -10 תאי גידול כמתואר בשלב 1.3 ללא צביעה, ספייק לתוך 1 מ"ל של דם נורמלי שלם, להכניס דגימות אלה לתוך השבב microfluidic, וללכוד את תאי הגידול על השבב.</li>
		<li>כתם על השבב עם Hoechst, CK-FITC ו- CD45-PE. שים 3-5 μL של צבע פלואורסצנטי לתוך 20-30 μL של PBS, ולאחר מכן להציג פתרון זה על שבב microfluidic עם מזרק. מנה את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב עם immunofluorescence כחול וירוק כדי לקבוע את יעילות לכידה.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע שינוי של השבב המיקרופלואידי ללכידה מבוססת זיקה של אנטי-EpCAM. הערה: מכיוון ששבב הגל משלב בידוד מבוסס זיקה ובידוד מבוסס מאפיינים פיזיים, שנה את השבב עם סוכנים.<ol><li>שנה את פני השטח של השבב עם 100 μL של 4% (v/v) 3-mercaptopropyl trimethoxysilane באתנול בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות. הציגו פתרון זה לתוך השבב בזהירות ובאיטיות במקרה שהוא הורס את המבנה הפנימי של השבב, במיוחד את מליטה של המשטח העליון ואת זכוכית המצע. הערה: משטח השבב משתנה באמצעות מרקפטוסילן. האינטראקציות המתרחשות על השבב נקבעות על ידי קשרים כימיים. קשרים כימיים נקבעים כדי לממש את הקשר של הנוגדן שונה עם האנטיגן. ריאגנטים שונים משתנים בתוך השבב כדי ליצור קשרים כימיים המתחברים זה לזה. המגיב האחרון שיש לשנות הוא מולקולת הידבקות אנטי-אפיתל (anti-EpCAM). האנטיגן של פני השטח של תאי הגידול של EpCAM משתלב עם אנטי-EpCAM בתוך השבב כדי לממש את לכידת ה-CTCs.</li>
		<li>לשטוף עם אתנול 3x. הוסף 100 μL של חומר הצימוד N-y-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS, 1 μM) על השבב, ולאפשר לו אינטראקציה במשך 30 דקות.</li>
		<li>יש לשטוף עם PBS 3x. השתמש מזרק כדי להציג 1 מ"ל של PBS על השבב כדי לשטוף.</li>
		<li>טפלו בשבב עם 30-40 μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל נויטרווידין בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, מה שמוביל לשיתוק התאים על GMBS, ולאחר מכן שטפו עם PBS כדי להסיר עודפי אבידין.</li>
		<li>שנה את השבב עם 3 μL של נוגדן EpCAM אנטי-ביוטינילציה בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל ב-100 מיקרוליטר של PBS עם 1% (w/v) BSA. שמור את זה למשך הלילה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ניסוי קליני על השבב לספירת תאי הגידול במחזור הדם (CTCs)
<ol><li>טרום תהליך קליני דגימות דם לחולי סרטן באמצעות תמיסת ליזה של תאי דם אדומים (RBCL), או החדרת 2-3 מ"ל של דגימת הדם ישירות על השבב המיקרופלואידי באמצעות מזרק.<ol><li>בצע עיבוד מקדים, שאורך כ-30 דקות. לאסוף דגימות דם שלמות צינורות נוגדי קרישה. הוסף 6-9 מ"ל של תמיסת ליזה RBS לתוך 2-3 מ"ל של דם. צנטריפוגה ב 111 x גרם במשך 5-8 דקות בטמפרטורת החדר, ולהשליך את השכבה העליונה של נוזל אדום שקוף.</li>
	</ol></li>
	<li>ללכוד, להכתים, לזהות ולמנות את התאים על השבב כמתואר להלן.<ol><li>לכוד את התאים על השבב כמתואר בשלב 1.הכתים את השבב עבור CTCs שנלכדו באמצעות Hoechst, CK-FITC ו- CD45-PE. CK-FITC הוא כתם ספציפי לתאי גידול, ו- CD45-PE מיועד לתאי דם לבנים.</li>
		<li>הוסף 3 μL של CK-FITC ל- 20 μL של PBS. הכנס את זה לתוך מזרק, ולשאוב את CK-FITC מדולל על השבב. מניחים לכתם למשך 30 דקות. הכנס 300 μL של PBS על השבב כדי לשטוף את השבב.</li>
		<li>הוסף 3 μL של CD45-PE ל 20 μL של PBS. הכנס את זה לתוך המזרק, ולשאוב את CD45-PE מדולל על השבב. אפשר לעמוד במשך 30 דקות. הכנס 300 μL של PBS על השבב כדי לשטוף את השבב.</li>
		<li>זהה את CTCs עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה של פי 20 או 40. CTCs פולטים פלואורסצנטיות כחולה וירוקה, ותאי דם לבנים (WBCs) פולטים פלואורסצנטיות כחולה ואדומה. זהה את ה- CTCs עם פלואורסצנטיות כחולה וירוקה ואת ה- WBCs עם פלואורסצנטיות כחולה ואדומה.</li>
		<li>מתוך תמונות immunofluorescence, למנות את מספר CTCs לכוד על השבב. מנה את CTCs כ- Hoechst+/CK-FITC+/CD45− ואת ה- WBCs כ- Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.</li>
	</ol></li>
	<li>העשירו את ה-CTCs שנלכדו על ידי שטיפה עם PBS דרך המזרק בכיוון ההפוך אל השבב המיקרופלואידי כדי לאסוף את ה-CTCs שנלכדו על השבב מהמפרצון. השתמש מזרק עם 1 מ"ל של PBS, להציג אותו מן השקע כדי להעשיר את CTCs נתפס על השבב בתוך 2-3 דקות, ולאסוף אותם מן המפרצון. יש להשתמש ב-1 מ"ל PBS לכל שלב כביסה, ולחזור על הפעולה 3x.</li>
	<li>הכתימו את תאי הגידול או CTCs שנלכדו על השבב המיקרופלואידי כמתואר להלן.<ol><li>מכתים באמצעות calcein AM. הוסף 5 μL של calcein AM ל 20 μL של PBS, להכתים את התאים במשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 111 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל תאים סרטניים, והשהה ב 1 מ"ל של PBS.</li>
		<li>כדי לזהות את גרעיני התא, הוסף 20 μL של תמיסת DAPI (10 μL של מגיב DAPI ב- 20 μL של PBS) לשבב בקצב זרימה אופטימלי של 1 מ"ל/שעה עבור מיקרו-מסננים בעלי אליפסה גדולה ו- 1.5 מ"ל/שעה עבור טרפזים. לעבור דרך 20 μL של תמיסת מלאי אנטי cytokeratin (3 μL של נוגדן anti-cytokeratin ב 20 μL של PBS) כדי להגיב עם השבב במשך 30 דקות.</li>
		<li>הכתימו את ה-WBCs שנתפסו על השבב. לאחר שה-CTCs נלכדו על השבב, הוסף 25 μL של תמיסת נוגדנים נגד CD45 (5 μL של תמיסת anti-CD45 ב-20 μL של PBS) לשבב, ואפשר להכתים למשך 30 דקות. לשטוף עם PBS, ולזהות את תאי אפיתל עם פלואורסצנטיות כחולה וירוקה.</li>
	</ol></li>
	<li>לבצע זיהוי immunofluorescence עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמתואר להלן.<ol><li>השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי ועורר את הדגימה עם הלייזר הכחול. מצא את התאים הפולטים פלואורסצנטיות כחולה, שהם תאי גרעין. השתמש באחת מההגדלות הבאות: 10x, 20x או 40x. מצא שדה ברור לתא הגידול. עבור מקור הלייזר הכחול, השתמש באורך גל של לוחית עירור של 420-485 ננומטר ובאורך גל של צלחת פליטה של 515 ננומטר.</li>
		<li>מבלי להזיז את הדגימות, השתמש במקור לייזר אחר. סובב את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי והלהיב את הדגימה עם הלייזר הירוק. מצא את התאים פולטים פלואורסצנטיות ירוקה, המעידה על תאים סרטניים. צלם תמונות של אותו שדה עם אותה הגדלה עם מקור לייזר ירוק זה. התאים הפולטים פלואורסצנטיות כחולה וירוקה מוכרים כתאי גידול. עבור מקור הלייזר הירוק, השתמש באורך גל של לוחית עירור של 460-550 ננומטר ובאורך גל של צלחת פליטה של 590 ננומטר</li>
		<li>מבלי להזיז את הדגימות, השתמש במקור לייזר אחר. סובב את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי והרגש את הדגימה עם הלייזר האדום. מצא את התאים הפולטים פלואורסצנטיות אדומה. צלם תמונות של אותו שדה עם אותה הגדלה עם מקור לייזר אדום זה. התאים הפולטים פלואורסצנטיות כחולה ואדומה מוכרים כתאי דם לבנים.</li>
		<li>שמור את התמונה המתקבלת באמצעות כל אחד ממקורות הלייזר לעיל. צלם מספר תמונות של אותו שדה עם אורות בצבעים שונים.</li>
		<li>השתמש באור אולטרה סגול עם אורך גל של צלחת עירור של 330-400 ננומטר ואורך גל של צלחת פליטה של 425 ננומטר. השתמש באור סגול עם אורך גל של לוחית עירור של 395-415 ננומטר ואורך גל של צלחת פליטה של 455 ננומטר.</li>
	</ol></li>
	<li>חשב את יעילות הלכידה כמו בשלב 1.2.1.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly-sensitive+capture+of+circulating+tumor+cells+using+micro-ellipse+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters.</a> Scientific Reports. 7 (1), 610(2017).</li>
<li>World Health Organization Cancer report. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer</a> (2022).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).</li>
<li>Mehlen, P., Puisieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+A+question+of+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: A question of life or death.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).</li>
<li>Sollier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-selective+collection+of+circulating+tumor+cells+using+Vortex+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+circulating+tumor+cells+from+patients+with+localized+and+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (25), 23(2010).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).</li>
<li>Nagrath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumor+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Murlidhar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+radial+flow+microfluidic+device+for+ultra-high-throughput+affinity-based+isolation+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells.</a> Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).</li>
<li>Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdevice+for+the+isolation+and+enumeration+of+cancer+cells+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood.</a> Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).</li>
<li>Preira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+circulating+cell+sorting+by+deformability+using+a+microfluidic+gradual+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter.</a> Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).</li>
<li>Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+microfluidics+combined+with+active+and+passive+approaches+for+continuous+cell+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation.</a> Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).</li>
<li>Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumour+cells+by+physical+means+in+a+microfluidic+device%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review.</a> RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).</li>
<li>Kumeria, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoswitchable+membranes+based+on+peptide-modified+nanoporous+anodic+alumina%3A+Toward+smart+membranes+for+on-demand+molecular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport.</a> Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).</li>
<li>Mahesh, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microfluidic+platform+for+physical+and+immunological+detection+and+capture+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells.</a> Biosensors. 12 (4), 220(2022).</li>
<li>Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+antibody-coated%2C+physical-based+microfluidic+chip+with+wave-shaped+arrays+for+isolating+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells.</a> Biomedical Microdevices. 19 (3), 66(2017).</li>
<li>Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+circulating+tumour+cell+enrichment+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">A review of circulating tumour cell enrichment technologies.</a> Cancers. 13 (5), 970(2021).</li>
<li>Chen, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inertia-deformability+hybrid+CTC+chip%3A+Design%2C+clinical+test+and+numerical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Devices%22%5BJournal%5D)">An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study.</a> Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004(2018).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

לפרוגנוזה ולאבחון מוקדם של סרטן יש השפעה משמעותית על הטיפול בסרטן1. בידוד CTC עם שבבים מיקרופלואידים מציע ביופסיה נוזלית ללא פלישה. עם זאת, CTCs הם נדירים ביותר והטרוגניים בדם1, מה שהופך את זה למאתגר לבודד CTCs. CTCs יש תכונות דומות למקורות הגידול המקוריים שממנו הם מגיעים. לפיכך, CTCs ממלאים תפקיד חיוני בגרורות סרטניות1. 
הפרוטוקול המוצע מאפשר ניתוח מלא של בידוד CTC עם השבב המיקרופלואידי. הפרוטוקול כולל את כל נהלי המפתח הק...

תאי גידול במחזור הדם (CTCs) משמעותיים בפרוגנוזה של סרטן, אבחון וטיפול נגד סרטן. ספירת CTC חיונית מכיוון ש- CTCs הם נדירים והטרוגניים. הספירה, שינוי האהדה והצביעה האימונופלואורסצנטית הקלינית של CTCs נדירים הן טכניקות רבות עוצמה לבידוד CTC מכיוון שהן מציעות את האלמנטים הדרושים עם רגישות גבוהה1. מספר נדיר של תאי גידול מעורבבים עם דם נורמלי מחקה באופן הדוק דם חולה אמיתי מאז 2-3 מ"ל של דם חולה אמיתי מכיל רק 1-10 CTCs. כדי לפתור בעיה ניסיונית קריטית, במקום להשתמש במספר גדול של תאי גידול שהוכנסו ל-PBS או מעורבבים עם דם רגיל, השימוש במספר נדיר של תאי גידול מספק לנו מספר נמוך של תאי דם, שהוא קרוב יותר למציאות בעת ביצוע ניסוי.
סרטן הוא סיבת המוות המובילה בעולם2. CTCs הם תאי גידול שנשפכים מהגידול המקורי ומסתובבים במערכת הדם והלימפה3. כאשר CTCs עוברים לסביבה חדשה הניתנת לשרידות, הם גדלים כגידול שני. זה נקרא גרורות והוא אחראי ל 90% ממקרי המוות בחולי סרטן4. CTCs חיוניים לפרוגנוזה, לאבחון מוקדם ולהבנת מנגנוני הסרטן. עם זאת, CTCs הם נדירים ביותר והטרוגניים בדם המטופל 5,6.
שבבים מיקרופלואידים מציעים ביופסיה נוזלית שאינה פולשת לגידול. יש להם את היתרון של היותם ניידים, בעלות נמוכה ובעלי קנה מידה תואם תאים. הבידוד של CTCs עם שבבים מיקרופלואידים מסווג בעיקר לשני סוגים: מבוסס זיקה, המסתמך על אנטיגן-נוגדנים קושרים 7,8,9 והיא השיטה המקורית והנפוצה ביותר לבידוד CTC; ושבבים פיזיים, המנצלים את הבדלי הגודל והעיוות בין תאי הגידול לתאי הדם 10,11,12,13,14,15, הם נטולי תוויות וקלים לתפעול. היתרון של שבבים מיקרופלואידים על פני טכניקות חלופיות הוא שהגישה המבוססת פיזית של מיקרו-פילטרים בעלי אליפסה גדולה לוכדת היטב CTCs ביעילות לכידה גבוהה. הסיבה לכך היא שמיקרו-עמודי אליפסה מאורגנים במנהרות דקות של רווחי קו. מרווחי הקו שונים מהמרווחים המסורתיים בין נקודות נקודתיות שנוצרו על ידי מיקרו-פוסטים כגון מיקרו-פוסטים של מעוין. לכידה מבוססת שבב גל של CTCs משלבת הן בידוד מבוסס רכוש פיזי והן בידוד מבוסס אהדה. לכידה מבוססת שבב גל כוללת 30 מערכים בצורת גל עם נוגדן של אנטי-EpCAM מצופה על מיקרופוסטים עגולים. ה-CTCs נלכדים על ידי הפערים הקטנים, והפערים הגדולים משמשים להאצת קצב הזרימה. ה-CTCs המוחמצים צריכים לעבור את הפערים הקטנים במערך הבא ונלכדים על ידי בידוד מבוסס זיקה המשולב בתוך השבב16.
מטרת הפרוטוקול היא להדגים ספירה של מספרים נדירים של תאי גידול ואת הניתוח הקליני של CTCs עם שבבים מיקרופלואידים. הפרוטוקול מתאר את שלבי הבידוד של CTC, כיצד להשיג מספר נמוך של תאי גידול, ההפרדה הפיזית הקלינית של מסנני אליפסה קטנים, מסנני אליפסה גדולה ומסנני טרפז, שינוי זיקה והעשרה17.

<table><tbody><tr><td>Calcein AM</td><td>BIOTIUM</td><td>80011</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות מיקרו-נימיות מכוילות</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P0799</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>CK-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347653</td><td>נוגדן חד שבטי ציטוקרטין</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30081.05</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>GIBCO, ארה"ב</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>בדיקות מולקולריות, Solarbio Corp., סין</td><td>C0031</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Ying ביוטכנולוגיה אמינה, סין</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ליזה של תאי דם אדומים (RBCL)</td> <td>Solarbio, בייג'ינג</td><td>R1010</td><td></td></tr></tbody></table>

פלטפורמת שבבים מיקרופלואידית קלינית לבידוד תאי גידול רב-תכליתיים במחזור הדם

Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells

תאי גידול במחזור הדם (CTCs) משמעותיים בפרוגנוזה של סרטן, אבחון וטיפול נגד סרטן. ספירת CTC חיונית בקביעת מחלת המטופל מכיוון ש- CTCs הם נדירים והטרוגניים. CTCs מנותקים מהגידול הראשוני, נכנסים למערכת זרימת הדם, ועלולים לגדול באתרים מרוחקים, ובכך לשלוח גרורות לגידול. מכיוון ש- CTCs נושאים מידע דומה לגידול הראשוני, בידוד CTC ואפיון לאחר מכן יכולים להיות קריטיים בניטור ואבחון סרטן. הספירה, שינוי האהדה והצביעה האימונופלואורסצנטית הקלינית של CTCs נדירים הן שיטות רבות עוצמה לבידוד CTC מכיוון שהן מספקות את האלמנטים הדרושים עם רגישות גבוהה. שבבים מיקרופלואידים מציעים שיטת ביופסיה נוזלית ללא כל כאב עבור החולים. בעבודה זו, אנו מציגים רשימה של פרוטוקולים עבור שבבים מיקרופלואידים קליניים, פלטפורמת בידוד CTC רב-תכליתית, המשלבים מערך של פונקציות ושירותים הדרושים להפרדה, ניתוח ואבחון מוקדם של CTC, ובכך מאפשרים ניתוח ביומולקולרי וטיפול בסרטן. התוכנית כוללת ספירת תאי גידול נדירים, עיבוד מקדים קליני של דם המטופל, הכולל ליזה של תאי דם אדומים, ובידוד והכרה של CTCs באתרם על שבבים מיקרופלואידים. התוכנית מאפשרת ספירה מדויקת של תאי גידול או CTCs. בנוסף, התוכנית כוללת כלי המשלב בידוד CTC עם שבבים מיקרופלואידים רב-תכליתיים וזיהוי אימונופלואורסצנטי באתרו על השבבים, ולאחר מכן אנליזה ביומולקולרית.

ההתקנה כולה כוללת משאבת מזרק, מזרק ושבב מיקרופלואידי. תרחיף התא במזרק מחובר למשאבת המזרק, ותרחיף התא מוכנס לשבב המיקרופלואיד כדי ללכוד את התאים. יעילות הלכידה של כל השבבים המיקרופלואידים שנוצלו הייתה בסביבות 90% ומעלה. עבור שבב הגל, תכננו מיקרו-מבנים עם פערים מגוונים. המרווחים הקטנים משמשים ללכידת CTCs, והמרווחים הגדולים משמשים להאצת קצב הזרימה. מתלה התא זורם במהירות באזורי הפער הגדול. ההחמצות נוטות להיתפס על ידי הפערים הקטנים במערך16 שלאחר מכן. עבור שבבי אליפסה, תכננו רווחי קו במקום רווחי נקודה כ...

השבב המיקרופלואידי הקליני הוא טכניקת ניתוח ביו-רפואית חשובה המפשטת עיבוד מקדים של דגימות דם קליניות של מטופלים ומכתימה באופן אימונופלואורסצנטי תאי גידול במחזור הדם (CTCs) באתרם על השבב, ומאפשרת זיהוי וזיהוי מהירים של CTC יחיד.

Circulating tumor cells (CTCs) are significant in cancer prognosis, diagnosis, and anti-cancer therapy. CTC enumeration is vital in determining patient ...

פרוטוקול זה תיאר שיטה לספירת תאי גידול אדומים, ואת בידוד CTC קליני. כדי להתחיל, תרבית את תאי הגידול MCF-7, MDA-MB-231, ו- HeLa בבקבוק תרבית תאים בבת אחת 10 עד החמישי במילימטר אחד של DMEM, בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.כאשר קווי התאים גדלים כחד-שכבות דבקות למפגש של 95%, נתקו אותם מצלחת התרבית עם תמיסת טריפסין 0.25% למשך שתי דקות. מכתימים את תאי הגידול על ידי הוספת שלושה מיקרוליטרים של Calcein AM, ומניחים את המנה באינקובטור למשך 30 דקות. בסוף הדגירה, לעכל את כל התאים עם טריפסין.לספור את תאי הגידול בתרבית PBS עם תא ספירת תאים, ולדלל עד 100 תאי גידול לכל מיליליטר של PBS מתקבלים. לאחר מכן, להציג את השעיית התא המדולל לתוך שבב microfluidic באמצעות מזרק עם משאבת מזרק בקצבי זרימה מגוונים. השג את יעילות הלכידה עבור קצבי הזרימה השונים, וקבע את קצב הזרימה האופטימלי.ספרו את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב, וזורמים החוצה מהשקע. חשב את יעילות הלכידה באמצעות הנוסחה הנתונה. חזור על ההליך כדי להשיג את יעילות הלכידה עבור מספר שונה של תאים סרטניים, מ 10 עד 100.בדוק ותקף את השבב המיקרופלואידי עבור מספר נדיר של תאים סרטניים. הזריקו את 10 מתלי הדגימה הללו לתוך השבבים המיקרופלואידים באמצעות מחט חלולה העשויה עם מושך מיקרופיפטה כדי לשאוף תאי גידול מדוללים. לזהות ולמנות את מספר תאי הגידול עבור כל דגימה לאחר לכידתם על השבב.לאחר מכן, להכתים את תאי הגידול עם Calcein AM, ולמנות 100 תאים סרטניים בחמישה מיקרוליטרים של PBS. יש להקפיץ תאים אלה למיליליטר אחד של דגימת דם שלמה ונורמלית. הכנס תאים אלה לתוך השבב, ולמנות את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב עם immunofluorescence ירוק.בצע ספירת in vivo כמתואר, וחשב את יעילות הלכידה לאחר הלכידה. מנה אחד עד 10 תאים סרטניים ללא צביעה. יש להפוך את התאים האלה למיליליטר אחד של דם שלם ונורמלי.הכנס דגימות אלה לתוך שבב microfluidic, וללכוד את תאי הגידול. הוסף שלושה עד חמישה מיקרוליטרים של צבע פלואורסצנטי לתוך 20 עד 30 מיקרוליטר של PBS, ולהציג פתרון זה על השבב עם מזרק. מנה את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב עם immunofluorescence כחול וירוק כדי לקבוע את יעילות לכידה.לאחר מכן, שנה את פני השטח של השבב עם 100 מיקרוליטר של 4%3-mercaptopropyl trimethoxysilane ואתנול בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות ללכידה מבוססת זיקה של מולקולת הידבקות תאים אנטי אפיתל. בסוף הדגירה, לשטוף את השבב שלוש פעמים עם אתנול. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של סוכן הצימוד GMBS, ולאפשר לו אינטראקציה במשך 30 דקות.בסוף הדגירה, להשתמש מזרק לשטוף את השבב שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS. טפל בשבב עם 30 עד 40 מיקרוליטר של 10 מיקרוגרם למיליליטר נויטרווידין בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, מה שמוביל לשיתוק התאים ל- GMBS, ולאחר מכן שטוף עם PBS כדי להסיר עודפי אבידין. שנה את השבב עם שלושה מיקרוליטרים של נוגדן מולקולת הידבקות תאי אפיתל אנטי-ביוטינילציה, ודגור בן לילה.כל תאי הגידול נלכדו סביב מערך שבב הגל ללא תאים חסרים, מה שמעיד על יעילות הלכידה הגבוהה של השבב המיקרופלואידי. תאי גידול מוכתמים עם Hoechst ו Calcein AM מוצגים כאן. CTCs מחולה סרטן קיבה שנלכדו באמצעות מיקרו-מסננים אליפסה קטנים מוצגים כאן.כמו כן, מוצגים CTCs מחולה סרטן המעי הגס שנלכד באמצעות מיקרו-פילטרים טרפזיים, ופולטים פלואורסצנטיות כחולה וירוקה. יעילות לכידה גבוהה וכדאיות נצפתה עבור תאים סרטניים שנלכדו באמצעות מיקרו-מסננים גדולים של אליפסה. ניתוח אימונופלואורסצנטי קליני של CTCs המעי הגס שנלכדו על השבב המיקרופלואידי זיהה CTCs כחיובי DAPI, CK-חיובי, CD45-שלילי, ואת WBCs כחיובי DAPI, CK-שלילי, CD45-חיובי.תאי גידול במעי הגס שגודלו בתרבית על שבב האליפסה הגדול לאחר לכידתם, ותאי גידול מעי גס שנלכדו על מיקרו-פילטרים של האליפסה הגדולה מוצגים כאן. שיטה זו של שינוי עם aptamer מספקת גישה חדשה להעשרת בידוד CTC.

clinical-microfluidic-chip-platform-for-isolation-versatile

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בתאי הגידול במחזור מבודדים מהדם של חולי סרטן ללא גרימת נזק לתאים. בידוד של תאים סרטניים נעשה באמצעות משטח bimolecular של selectin-E בנוסף נוגדנים כנגד סמנים אפיתל. ציפוי Nanotube במיוחד מקדם תאים סרטניים וכתוצאה מכך הידבקות purities ללכוד גבוהה.

בידוד מהיר של נספח אווירי בתאי הגידול במחזור של דגימות דם החולה

במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות תאים בודדים עם פלטפורמה מיקרופלואידית, המשתמשת בתפיסת עיצוב מיקרו-באר חדשה כדי לאפשר בידוד תא בודד ביעילות גבוהה ותרבית משובטת לטווח ארוך.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

פרוטוקול זה מתאר פונקציונליזציה של פני השטח הניתנת להתאמה אישית של מערכת הדסטיוביוטין, הסטרפטווידין וה-APTES על מנת לבודד סוגי תאים ספציפיים מעניינים. בנוסף, כתב יד זה מכסה את היישומים, האופטימיזציה והאימות של תהליך זה.

שיטה של ​​בידוד תא ממוקד באמצעות Functionalization משטח הזכוכית

פרוטוקול לנצל פולי (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) מצופה Microfilter עבור יעיל ללכוד ולשחרר thermoresponsive של תאים סרטניים קיימא במחזור (CTC) מוצג. שיטה זו מאפשרת ללכוד של CTC מ 'דם בחולים ושחרורו של CTC קיימא עבור במורד הזרם מחוץ שבב תרבות, מנתח ואפיון.

לכידת שחרור בתאי גידול במחזור קיימא מן הדם

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה משולבת כדי לזהות תכונות פנוטיפקס ומולקולריות המאפיינות תאים סרטניים במחזור (CTCs). אנו משלבים כתמים חיים ומיקרומניפולציה רובוטית של CTCs יחיד ומקובצים עם שיטות מבוססות תא יחיד עבור ניתוח המטה והערכה של גרורות-זריעת היכולת.

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

האפיון של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) הוא נושא פופולרי במחקר טרנסלtional. פרוטוקול זה מתאר את הטיפול באופן אוטומטי למחצה החיסונית (IF) לאפיון PD-L1 וספירה של CTCs בסרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC) מטופלים דגימות.

Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

בעידן האימונותרפיה והפרופיל הגנומי של התא הבודד, ביולוגיה של סרטן דורשת כלים חדשניים במבחנה וחישוביים לחקר הממשק הגידולי-חיסוני בהקשר מרחבי-זמני נכון. אנו מתארים פרוטוקולים לניצול תרביות מיקרופלואידיות מיקרופלואידיות של גידולים חיסוניים בסביבות דו-ממדיות ותלת-ממדיות, התואמים לניטור דינמי ורב-פרמטרי של תפקודים תאיים.

מודלים של תרבית משותפת מיקרופלואידית לניתוח התגובה החיסונית במיקרו-סביבות גידוליות במבחנה

Culturing CTCs מאפשר אפיון תפקודי עמוק יותר של סרטן, באמצעות הבעת ביטוי סמן ספציפי, והערכת עמידות לתרופות ואת היכולת ליישב את הכבד בין אפשרויות אחרות. בסך הכל, תרבות CTC יכולה להיות כלי קליני מבטיח לרפואה מותאמת אישית כדי לשפר את תוצאות המטופל.

קווי תאים סרטניים במחזור: כלי חדשני למחקר יסודי ותרגום

תאי גידול במחזור (CTC) הם קריטיים לחקר התקדמות הסרטן והגרורות. מאמר זה מציג פרוטוקול משולב בעל תפוקה גבוהה להעשרת CTC וריצוף CTC יחיד, המשפר את יעילות הלכידה וטוהר ה-CTC תוך הפחתת עלויות הזיהום והריצוף, ובכך מקדם מחקר אונקולוגי מדויק ויישומים קליניים.

טכנולוגיית מיון תאי גידול במחזור וריצוף תאים בודדים מבוססת מיקרופלואידיקה

למדו שיטת בידוד תאי גידול מיקרופלואידית קלינית לזיהוי CTCs בדם. הפרוטוקול משתמש בתאי MCF-7, MDA-MB-231 ו-HeLa עם צביעת Calcein AM ומיקרוצ'יפ לבידוד יעיל. השיטה משפרת מהירות ודיוק באבחון סרטן.

פלטפורמת שבבים מיקרופלואידית קלינית לבידוד תאי גידול רב-תכליתיים במחזור הדם

גלה סרטונים נוספים