פלטפורמת שבבים מיקרופלואידית קלינית לבידוד תאי גידול רב-תכליתיים במחזור הדם
13 באוקטובר 2023
השבב המיקרופלואידי הקליני הוא טכניקת ניתוח ביו-רפואית חשובה המפשטת עיבוד מקדים של דגימות דם קליניות של מטופלים ומכתימה באופן אימונופלואורסצנטי תאי גידול במחזור הדם (CTCs) באתרם על השבב, ומאפשרת זיהוי וזיהוי מהירים של CTC יחיד.
פרוטוקול זה תיאר שיטה לספירת תאי גידול אדומים, ואת בידוד CTC קליני. כדי להתחיל, תרבית את תאי הגידול MCF-7, MDA-MB-231, ו- HeLa בבקבוק תרבית תאים בבת אחת 10 עד החמישי במילימטר אחד של DMEM, בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
כאשר קווי התאים גדלים כחד-שכבות דבקות למפגש של 95%, נתקו אותם מצלחת התרבית עם תמיסת טריפסין 0.25% למשך שתי דקות. מכתימים את תאי הגידול על ידי הוספת שלושה מיקרוליטרים של Calcein AM, ומניחים את המנה באינקובטור למשך 30 דקות. בסוף הדגירה, לעכל את כל התאים עם טריפסין.
לספור את תאי הגידול בתרבית PBS עם תא ספירת תאים, ולדלל עד 100 תאי גידול לכל מיליליטר של PBS מתקבלים. לאחר מכן, להציג את השעיית התא המדולל לתוך שבב microfluidic באמצעות מזרק עם משאבת מזרק בקצבי זרימה מגוונים. השג את יעילות הלכידה עבור קצבי הזרימה השונים, וקבע את קצב הזרימה האופטימלי.
ספרו את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב, וזורמים החוצה מהשקע. חשב את יעילות הלכידה באמצעות הנוסחה הנתונה. חזור על ההליך כדי להשיג את יעילות הלכידה עבור מספר שונה של תאים סרטניים, מ 10 עד 100.
בדוק ותקף את השבב המיקרופלואידי עבור מספר נדיר של תאים סרטניים. הזריקו את 10 מתלי הדגימה הללו לתוך השבבים המיקרופלואידים באמצעות מחט חלולה העשויה עם מושך מיקרופיפטה כדי לשאוף תאי גידול מדוללים. לזהות ולמנות את מספר תאי הגידול עבור כל דגימה לאחר לכידתם על השבב.
לאחר מכן, להכתים את תאי הגידול עם Calcein AM, ולמנות 100 תאים סרטניים בחמישה מיקרוליטרים של PBS. יש להקפיץ תאים אלה למיליליטר אחד של דגימת דם שלמה ונורמלית. הכנס תאים אלה לתוך השבב, ולמנות את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב עם immunofluorescence ירוק.
בצע ספירת in vivo כמתואר, וחשב את יעילות הלכידה לאחר הלכידה. מנה אחד עד 10 תאים סרטניים ללא צביעה. יש להפוך את התאים האלה למיליליטר אחד של דם שלם ונורמלי.
הכנס דגימות אלה לתוך שבב microfluidic, וללכוד את תאי הגידול. הוסף שלושה עד חמישה מיקרוליטרים של צבע פלואורסצנטי לתוך 20 עד 30 מיקרוליטר של PBS, ולהציג פתרון זה על השבב עם מזרק. מנה את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב עם immunofluorescence כחול וירוק כדי לקבוע את יעילות לכידה.
לאחר מכן, שנה את פני השטח של השבב עם 100 מיקרוליטר של 4%3-mercaptopropyl trimethoxysilane ואתנול בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות ללכידה מבוססת זיקה של מולקולת הידבקות תאים אנטי אפיתל. בסוף הדגירה, לשטוף את השבב שלוש פעמים עם אתנול. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של סוכן הצימוד GMBS, ולאפשר לו אינטראקציה במשך 30 דקות.
בסוף הדגירה, להשתמש מזרק לשטוף את השבב שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS. טפל בשבב עם 30 עד 40 מיקרוליטר של 10 מיקרוגרם למיליליטר נויטרווידין בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, מה שמוביל לשיתוק התאים ל- GMBS, ולאחר מכן שטוף עם PBS כדי להסיר עודפי אבידין. שנה את השבב עם שלושה מיקרוליטרים של נוגדן מולקולת הידבקות תאי אפיתל אנטי-ביוטינילציה, ודגור בן לילה.
כל תאי הגידול נלכדו סביב מערך שבב הגל ללא תאים חסרים, מה שמעיד על יעילות הלכידה הגבוהה של השבב המיקרופלואידי. תאי גידול מוכתמים עם Hoechst ו Calcein AM מוצגים כאן. CTCs מחולה סרטן קיבה שנלכדו באמצעות מיקרו-מסננים אליפסה קטנים מוצגים כאן.
כמו כן, מוצגים CTCs מחולה סרטן המעי הגס שנלכד באמצעות מיקרו-פילטרים טרפזיים, ופולטים פלואורסצנטיות כחולה וירוקה. יעילות לכידה גבוהה וכדאיות נצפתה עבור תאים סרטניים שנלכדו באמצעות מיקרו-מסננים גדולים של אליפסה. ניתוח אימונופלואורסצנטי קליני של CTCs המעי הגס שנלכדו על השבב המיקרופלואידי זיהה CTCs כחיובי DAPI, CK-חיובי, CD45-שלילי, ואת WBCs כחיובי DAPI, CK-שלילי, CD45-חיובי.
תאי גידול במעי הגס שגודלו בתרבית על שבב האליפסה הגדול לאחר לכידתם, ותאי גידול מעי גס שנלכדו על מיקרו-פילטרים של האליפסה הגדולה מוצגים כאן. שיטה זו של שינוי עם aptamer מספקת גישה חדשה להעשרת בידוד CTC.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה למנייה של תאי גידול אדומים ובידוד תאי גידול מסתובבים (CTCs) באמצעות שבב מיקרו-נוזלי קליני. טכניקה זו מפשטת את עיבוד דגימות הדם ומאפשרת זיהוי וזיהוי מהירים של CTCs בודדים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ניתוח ביו-רפואי
- דיאגנוסטיקה קלינית
- טכניקות תרבית תאים
רקע
- תאי גידול מסתובבים (CTCs) חיוניים לאבחון וניטור סרטן.
- שבבים מיקרו-נוזליים משפרים את יעילות בידוד ה-CTCs.
- צביעה אימונופלואוריסצנטית מסייעת בהדמיה של CTCs.
- שיטות תרבית תאים סטנדרטיות חיוניות להכנת תאי גידול לניתוח.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה אמינה למנייה של CTCs.
- לשפר את יעילות עיבוד דגימות דם קליניות.
- להקל על זיהוי CTCs באתר.
שיטות ששימשו
- תרבית של קווי תאי גידול (MCF-7, MDA-MB-231, HeLa) ב-DMEM.
- צביעה של תאים עם Calcein AM לצורך הדמיה.
- ניתוק תאים באמצעות trypsin לצורך מנייה.
- שימוש בשבב מיקרו-נוזלי לבידוד וניתוח CTCs.
תוצאות עיקריות
- מנייה מוצלחת של תאי גידול אדומים.
- בידוד יעיל של CTCs מדגימות דם.
- הוכחת יעילות השבב המיקרו-נוזלי בסביבות קליניות.
- זיהוי מהיר של CTCs בודדים באמצעות צביעה אימונופלואוריסצנטית.
מסקנות
- השבב המיקרו-נוזלי הוא כלי חשוב לניתוח CTCs.
- שיטה זו משפרת את המהירות והדיוק של האבחון הקליני של סרטן.
- מחקרים נוספים יכולים להרחיב את היישום שלה באונקולוגיה קלינית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and enumeration of circulating tumor cells (CTCs) are critical for advancing liquid biopsy strategies in oncology drug discovery and translational research. This microfluidic chip platform enables high-sensitivity detection and in situ characterization of rare CTCs, supporting predictive biomarker development and early-stage mechanistic de-risking. Integration of affinity-based capture and immunofluorescence analysis positions this technology at a key inflection point for portfolio triage and target validation in cancer R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of tumor cell heterogeneity and metastatic potential through rare cell capture.
- Supports functional validation of epithelial and mesenchymal markers via immunofluorescence staining.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct enumeration and phenotyping of CTCs from clinical samples.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized workflow for preparing and analyzing blood samples for CTC content.
- Delivers quantitative outputs for capture efficiency and cell viability, supporting assay reproducibility.
- Enables platform scalability and reuse for compound screening or biomarker studies involving rare cell populations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling in situ CTC characterization from patient samples.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by bridging in vitro and clinical sample analysis.
- Reduces biological risk in candidate selection by providing real-time, patient-derived cellular readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic chip platform fits within the discovery-to-translational continuum, enabling early hypothesis testing, lead identification, and preclinical biomarker validation for oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of CTC biology and metastatic mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative CTC enumeration and viability metrics for assay development.
- Analytics: Provides immunofluorescence-based phenotyping and statistical capture efficiency outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Enables direct analysis of patient-derived CTCs, supporting biomarker alignment and risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, reusable platform adaptable to diverse cancer types and biomarker panels.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in oncology research.
- Operational Value: Standardizes rare cell isolation and analysis, improving reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative CTC data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of oncology assets based on translational biomarker evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, immunofluorescence, and rare cell analysis.
- Needs access to cell culture, fluorescence microscopy, and analytical instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data interpretation.
- Adaptable to various tumor types and blood sample volumes with protocol optimization.
- Capture efficiency and marker specificity must be validated for each clinical context.
