Name: מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: חקור את מערכת Tol2 לטרנסגנזה מודולרית בדגי זברה לחקר פיתוח עוברים ומחלות כמו FASD. שיטה זו מאפשרת יצירה מהירה של זברות טרנסגניות ללא עיצוב מחדש של רכיבי ערכה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר המוצג במאמר זה נתמך על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות / המכון הלאומי לשימוש לרעה באלכוהול (NIH/NIAAA) R00AA023560 ל- C.B.L.

כל עוברי דגי הזברה המשמשים בהליך זה גודלו וגודלו בעקבות פרוטוקולים שנקבעו12 של IACUC. פרוטוקולים אלה אושרו על ידי אוניברסיטת לואיוויל.
הערה: במחקר זה נעשה שימוש בזן דגי הזברה מסוג בר, AB וקו מוטנטי כפול bmp4st72;smad5b1100 . כל המים ששימשו בהליך זה היו מי אוסמוזה הפוכה סטרילית. תמונות קונפוקליות צולמו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. מדידות האנדודרם נעשו באמצעות כלי המדידה ב-ImageJ. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנות סטטיסטיות.
1. ביצוע הפתרונות והמדיה
<ol><li>מדיה חיידקית: להמיס ציר LB או אגר לפי הוראות היצרן, ו autoclave. לפני מזיגת המדיה לצלחות פטרי 100 מ"מ, הוסיפו אמפיצילין (50 מיקרוגרם/מ"ל), קנמיצין (50 מק"ג/מ"ל), או שילוב של אמפיצילין/כלוראמפניקול (50 מק"ג/מ"ל ו-30 מק"ג/מ"ל, בהתאמה).</li>
	<li>כדי ליצור מלאי מדיה עוברית פי 20x, יש להמיס את הפריטים הבאים ב-1 ליטר מים: 17.5 גרם NaCl, 0.75 גרם KCl, 2.9 גרם CaCl 2, 0.41 גרם של K 2 HPO 4, 0.142 גרם של Na 2 HPO 4 ו-4.9 גרם של MgSO4·7H 2O. סנן-עיקור תמיסת המלאי באמצעות מערכת סינוןואקום 0.22 מיקרומטר, ולאחסן בטמפרטורה של 4°C. הערה: התעלם מהשקע הלבן שנוצר; זה לא ישפיע על התקשורת.</li>
	<li>ב 19 L של מים, להמיס 1.2 גרם של NaHCO3 ולהוסיף 1 L של מלאי מדיה עובר 20x כדי ליצור את פתרון מדיה עובר עובד, ולשמור על תמיסה זו ב 28 ° C.</li>
	<li>לתמיסה 2% פנול אדום, יש להמיס 20 מ"ג של מלח נתרן אדום פנול ב-1 מ"ל מים נטולי RNase, ולאחסן בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>2. תבניות הזרקת עוברים
<ol><li>להכנת צלחת הזרקת האגרוז, ממיסים את האגרוז במצע העוברי לריכוז סופי של 3% על ידי חימום לרתיחה.</li>
	<li>יוצקים 50 מ"ל אגרוז לתוך צלחות פטרי 100 מ"מ, ובזמן שהאגרוז עדיין נוזלי, מניחים בעדינות את תבנית ההזרקה באגרוז כדי למנוע היווצרות בועות מתחת לתבנית.</li>
	<li>תנו לצלחות האגרוז להתקרר. ברגע שהאגרוז מוצק, מסירים את תבנית ההזרקה ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C עד שהיא מוכנה לשימוש.</li>
</ol>3. פיפטות הזרקה
<ol><li>משוך נימים בקוטר 1.0 מ"מ (OD) המכילים חוט להט לתוך מחטים באמצעות מושך פיפטה אנכי כאשר הסולנואיד מוגדר ל-2.5 וגוף החימום מוגדר ל-14.6. הערה: כל מושך מחומם יעבוד אם הוא מושך את הנימים לשתי מחטים בצורה נקייה ושווה, אך יש למשוך את מחטי ההזרקה תוך שבוע מהזרקת עוברי דגי הזברה לקבלת תוצאות הזרקה עקביות.<ol><li>מניחים את הנימים במושך, מהדקים את המהדק בכל קצה, ולאחר מכן מפעילים את גוף החימום.</li>
		<li>משוך את הנימים כדי ליצור שתי מחטי הזרקה.</li>
		<li>מוציאים את הנימים מהמושך ומאחסנים אותם בצלוחית פטרי ריקה עם רצועה של חימר דוגמנות המשמש כמחזיק המחט.</li>
	</ol></li>
</ol>4. הכנת mRNA טרנספוזאז
<ol><li>לינארית פלסמיד Tol2Kit המכיל טרנספוזאז עם אנדונוקלאז הגבלה NotI על ידי שילוב הדברים הבאים בצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 מ"ל: 10 μL של פלסמיד transposase (150 ng/μL), 1.5 μL של חיץ תגובה endonuclease הגבלה, 0.3 μL של NotI endonuclease.</li>
	<li>מלא את התגובה עד 20 μL עם מים ללא RNase, ולאחר מכן לערבב ולעכל ב 37 ° C במשך הלילה.</li>
	<li>עצור את עיכול transposase על ידי הוספת 1 μL של 0.5 M EDTA (pH 8.0), 2 μL של 5 M NH4OAc, ו 80 μL של 100% EtOH לתגובת העיכול, ולאחר מכן לערבב ולצנן ב -20 ° C במשך הלילה.</li>
	<li>צנטריפוגה את התמיסה ב 14,000x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן לשאוף את supernatant ולהשהות מחדש את גלולת DNA במים נטולי RNase.</li>
	<li>קבע את ריכוז הפלסמיד הליניארי בננוגרם למיקרוליטר (ng/μL) באמצעות פלואורומטר על ידי הפעלה תחילה של 2 μL של מים ריקים ללא RNase ולאחר מכן הרצת 2 μL של פלסמיד ליניארי. הערה: ריכוזי הפלסמיד נעים בדרך כלל בין 100-200 ננוגרם/מיקרוליטר</li>
	<li>הגדר את ייצור ה-mRNA SP6 על-ידי שילוב הרכיבים הבאים בסדר בצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל: 10 μL של 2x NTP/CAP, 2 μL של 10x מאגר תגובה, 0.1-1 מיקרוגרם של תבנית DNA ליניארית ו-2 μL של תערובת אנזימים SP6.</li>
	<li>מלא את התגובה עד 20 μL עם מים ללא RNase, ולאחר מכן לערבב ולדגור ב 37 ° C במשך 2 שעות.</li>
	<li>לאחר הדגירה במשך שעתיים, יש להוסיף 1 μL של DNase, לערבב היטב ולדגור במשך 15 דקות נוספות בטמפרטורה של 37°C.</li>
	<li>כדי לעצור את תגובת SP6, הוסף 30 μL של תמיסת משקעים LiCl לצינור התגובה, ולאחר מכן ערבב והתקרר ב -20 ° C למשך הלילה.</li>
	<li>צנטריפוגה את התמיסה ב 14,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C כדי pellet mRNA, ולאחר מכן לשאוף את supernatant ולשטוף את כדור mRNA עם 1 מ"ל של 80% EtOH (מדולל עם מים נטולי RNase).</li>
	<li>צנטריפוגה את התמיסה ב 14,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C כדי לשאוף את mRNA, ולאחר מכן לשאוף את supernatant. הניחו לגלולה להתייבש באוויר.</li>
	<li>להשהות מחדש את כדורית ה-mRNA ב-20 μL של מים נטולי RNase, לקבוע את ריכוז ה-mRNA בננוגרם למיקרוליטר (ng/μL) באמצעות פלואורומטר כמתואר בשלב 4.5 (צריך להיות לפחות 100 ng/μL), aliquot 100 ng של mRNA לכל צינור לשימוש יחיד, ולאחסן ב-80°C. הערה: כדי לוודא שה-mRNA אינו מתפרק, ניתן להפעיל במהירות 2 μL של mRNA על אלקטרופורזה של DNA כדי לאשר פס יחיד במהירות של 1,950 bps.</li>
</ol>5. שיבוט שער מרובה אתרים ליצירת וקטורי כניסה לטרנסגנזה
הערה: פרוטוקול זה שונה מ- Kwan et al.10, כאשר תגובת LR כתובה כתגובת חצי LR ובנפח כולל של 5 μL. כדי ליצור רכיבי כניסה חדשים, יש להשתמש בתגובות BP המשתמשות בווקטורי תורם של 5', אמצע ו-3'10,13.
<ol><li>כדי לבצע את התגובה, אסוף 10 fmol כל אחד של p5E, pME ו- p3E ו- 20 fmol של וקטור היעד (pDest). הערה: רקומבינציית LR מרובת אתרים משתמשת בארבעה וקטורי פלסמיד שונים: וקטור כניסה 5' (p5E), וקטור כניסה אמצעי (pME), וקטור כניסה 3' (p3E) וקטור יעד (pDest), כדי ליצור מבנה מהונדס ייחודי שמשני צדדיו חזרות Tol2 המוכנות להזרקה לעוברים של דגי זברה.<ol><li>זהה את גודלם של כל ארבעת הווקטורים בזוגות בסיסים ממקור הפלסמיד (טבלה 1, Tol2Kit Wiki עמוד14 או Addgene11; ראה טבלת חומרים). הערה: עבור וקטורים חדשים, ריצוף פלסמיד מלא באמצעות חברות ריצוף מסחריות יכול לספק את גודל הפלסמיד המדויק ב- bps.</li>
		<li>קבע את הריכוז של כל ארבעת הווקטורים בננוגרם למיקרוליטר (ng/μL) באמצעות פלואורומטר, כמתואר בשלב 4.5.</li>
		<li>באמצעות משקל הדנ"א כ-660 גרם/מול וגודל הפלסמיד (ב-bps), חשב את סך הננוגרמים (ng) של פלסמיד הדרוש כדי להגיע ל-10 fmol (וקטורי כניסה) או 20 fmol (וקטור יעד). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq01.jpg" style="margin: auto;"> הערה: מעבדת Mosimann באוניברסיטת קולורדו, קמפוס רפואי אנשוץ, יצרה גיליון אלקטרוני זמין באופן חופשי כדי לחשב את כמות הפלסמיד הדרוש (ב- ng) ואת הנפח (ב- μL) של הווקטורים הדרושים בתגובת LR15.</li>
	</ol></li>
	<li>כדי ליצור את המבנה המתואר להלן, sox17: EGFPCAAX, השתמש בווקטורים הבאים: וקטור p5E המכיל את מקדם דג הזברה sox17 , שהוא 6,918 bp בגודל16; וקטור pME המכיל את ה-EGFP הפרנילטי, שהוא 3,345 bp בגודל10; וקטור p3E המכיל את רצף האותות SV40 late poly A, שהוא 2,838 bp בגודל10; ואת pDest, שהוא 5,883 bp בגודל10.</li>
	<li>באמצעות ריכוז הפלסמיד שנקבע בשלב 5.1.2 והכמות בננוגרם (ng) עבור כל וקטור (שלב 5.1.3), חשב את סך המיקרוליטרים (μL) של כל פלסמיד הדרוש כדי להגיע ל- 10 fmol (וקטורי כניסה) או 20 fmol (וקטור יעד), ולאחר מכן חלק זאת בשניים לשימוש בתגובות 5 μL חצי LR (כל הערכים המפורטים להלן מפורטים בטבלה 2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq02v2.jpg" style="margin: auto;"><ol><li>כדי לייצר 10 fmol של p5E-sox17, יש להשתמש ב-45.66 ng (בריכוז של 140.3 ng/μL) ולדלל במים סטריליים פי 4 כדי לקבל 0.65 μL.</li>
		<li>כדי לייצר 10 fmol של pME-EGFPCAAX, יש להשתמש ב-22.08 ng (בריכוז של 213.5 ng/μL) ולדלל במים סטריליים פי 10 כדי לקבל 0.52 μL.</li>
		<li>כדי לייצר 10 fmol של p3E-poly A, יש להשתמש ב-15.73 ng (בריכוז של 276.1 ng/μL) ולדלל במים סטריליים פי 20 כדי לקבל 0.57 μL.</li>
		<li>עבור 20 fmol של וקטור היעד, השתמש 77.66 ng של pDest (בריכוז של 307.3 ng / μL) ודלל עם מים סטריליים על ידי פקטור של 5 כדי לקבל 1.63 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>כדי להגדיר תגובת 5 μL חצי LR, שלב את נפחי p5E, pME, p3E ו- pDest שנקבעו בשלב 5.3 בצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל, ולאחר מכן הוסף מים סטריליים כדי להגיע לנפח תגובה כולל של 4 μL.</li>
	<li>מערבבים במרץ את תערובת האנזים LR 2x למשך דקה אחת כל אחד כדי להבטיח ערבוב תקין, ולאחר מכן מוסיפים 1 μL לתגובה ומערבבים היטב.</li>
	<li>יש לדגור ב-25°C למשך הלילה (16+ שעות).</li>
	<li>עצור את תגובת LR על ידי הוספת 0.5 μL של proteinase K (2 מיקרוגרם / μL), לדגור ב 37 ° C במשך 10 דקות, ולאחר מכן לקרר לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הפוך 3-4 μL של פלסמיד לתאים מופשרים בעלי כשירות כימית על ידי הוספת הפלסמיד ולתת לתאים לשבת על קרח במשך 25-30 דקות.</li>
	<li>בזמן שהתאים יושבים על קרח, חממו שתי צלחות אגר LB-ampicillin לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הלם חום את התאים באמבט מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות בדיוק.</li>
	<li>לאחר הלם החום, יש להוסיף לתאים 250 מיקרוליטר של מדיה נוזלית עשירה ונטולת אנטיביוטיקה, ולדגור עם רעידות בטמפרטורה של 37°C למשך שעה וחצי.</li>
	<li>יש לפזר 300 מיקרוליטר חיידקים על צלחת אמפיצילין אחת, ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.</li>
	<li>למחרת בבוקר, בדקו את המושבות לנוכחות שני פנוטיפים, שקופים ואטומים, בחרו את המושבות השקופות (כמתואר בקוואן ואחרים 10) אחת בכל פעם, חסנו את התרבית הנוזלית, ואז נערו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: מושבות שקופות מכילות כמעט תמיד את מושבת LR הנכונה (&gt;85% מהמקרים).</li>
	<li>באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן, בצע הכנת פלסמיד על כל תרבית נוזלית, ועכל באופן מאבחן כל פלסמיד כדי לאשר את הגודל המתאים של המבנה המהונדס, מה שמצביע על כך שתגובת שער LR פעלה כראוי.</li>
	<li>התמירו מחדש את המבנים הטרנסגניים הנכונים באמצעות פרוטוקול הטרנספורמציה החיידקי הסטנדרטי כמתואר בשלבים 5.4-5.12 באמצעות 0.5-1 μL של הפלסמיד, ודגרו רק בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.</li>
	<li>פסו מחדש את המושבות, ואשרו שלכל אחת מהן יש מבנה מהונדס LR כמו בשלב 5.14.</li>
	<li>קבע את ריכוז הפלסמיד כמתואר בשלב 4.5 (לפחות 150 ננוגרם/מיקרוליטר נדרשים להזרקת העובר).</li>
</ol>6. הזרקת הטרנסגן לעוברים
<ol><li>הפשירו דגימת mRNA טרנספוזאז חד-פעמית ומבנה מהונדס Tol2 על קרח והזהירו מראש צלחת הזרקת אגרוז לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>ערבבו את הדברים הבאים על קרח: 150 ננוגרם פלסמיד, 100 ננוגרם mRNA טרנספוזאז ו-2% פנול אדום (0.3 מיקרוליטר). לאחר מכן, הוסף מים נטולי RNA כדי להשלים את הנפח ל -3 μL.</li>
	<li>העבירו עוברים בשלב התא באמצעות פיפטות העברה לצלחת ההזרקה (המתוארת בשלב 2) מלאות בקרינה אלקטרומגנטית המכסה לחלוטין את האגר, ולאחר מכן לחצו בעדינות על כ-50-75 עוברים לכל חריץ של צלחת ההזרקה.</li>
	<li>הוסף את תערובת mRNA/פלסמיד/פנול אדומה לקצה הפתוח של מחט הזרקה נימית, מקם את מחט הנימים בבית השחי של מתקן ההזרקה, והפעל את מתקן ההזרקה. הערה: מתקן ההזרקה משתמש בגז דחוס, כגון אוויר, כדי לפעום את הנפח הרצוי (המתואר בשלב 6.5) של תערובת mRNA/פלסמיד/פנול אדום לתוך העובר כאשר הוא מופעל.</li>
	<li>הורידו את המחט הנימית לתוך ה-EM של צלחת ההזרקה, ושברו את הקצה באמצעות מלקחיים כדי לאפשר רק כמות קטנה של תערובת mRNA/פלסמיד/פנול אדומה להישאב החוצה על ידי מתקן ההזרקה.</li>
	<li>הזריקו לעוברים בולוס קטן של 3 nL של תערובת mRNA/פלסמיד/פנול אדום לגוף התא של העובר. הערה: בולוס 3 nL הוא נפח של תערובת mRNA/פלסמיד/פנול אדום שבו שבעה בולוסים יכולים תיאורטית להתאים באופן שווה על פני קו האמצע של העובר.</li>
	<li>בסיום הזרקת העוברים, הוציאו אותם מצלחת ההזרקה על ידי הוצאתם בעדינות מהחריץ והעברתם לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ עם EM טרי (כ-40 מ"ל), ולאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לעוברים להתפתח.</li>
</ol>7. בדיקת עוברים להחדרה מהונדסת
<ol><li>לביטוי חלבונים פלואורסצנטיים, יש לבחור את השלב ההתפתחותי המתאים בו יש לבטא את הטרנסגן הפלואורסצנטי, ולסנן נוכחות פלואורסצנטית תחת מיקרוסקופ מנתח פלואורסצנטי. הערה: עוברים אלה יהיו פסיפס בביטוי שלהם ויראו החדרה גנומית של המבנה המהונדס.</li>
	<li>סינון עבור טרנסגנים שאינם פלואורסצנטיים על ידי סינון עבור סמן טרנסגני פלואורסצנטי (כמתואר בשלב 7.1), כגון GFP המונע על ידי מקדם ספציפי ללב עבור הגן cmlc2 או mCherry מונע על ידי מקדם ספציפי לעדשה של αcyrstallin, אשר כלולים וקטורי יעד נפרדים.</li>
	<li>לאפשר לעוברים החיוביים להחדרה טרנסגנית להתפתח במלואם לשלבי דג הזברה הבוגר.</li>
	<li>ברגע שדגים טרנסגניים פוטנציאליים מגיעים לגיל הרבייה, סנן אותם בנפרד הן להעברת קו הנבט והן לביטוי טרנסגני על ידי הרבאתם לדגי זברה מסוג בר.</li>
	<li>אותם מבוגרים שהעוברים שלהם מתפתחים באופן תקין ונותנים את הביטוי הטרנסגני החזק והמתאים ביותר נשמרים כקווי דגי זברה טרנסגניים ייחודיים לעבודה וניתוחים עתידיים. הערה: כגישה חלופית לסינון החדרה גנומית של מבנים טרנסגניים, תכנן פריימרים PCR שרק מגבירים את המבנה המהונדס ולא DNA מסוג פראי.</li>
</ol>

<ol><li>Denny, L., Coles, S., Blitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome+and+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders.</a> American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).</li>
<li>Popova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comorbidity+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).</li>
<li>Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+spectrum+disorders%3A+Characteristics%2C+complications%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Mental+Health+Journal%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment.</a> Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).</li>
<li>Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+presentation%2C+diagnosis%2C+and+management+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder.</a> The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).</li>
<li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).</li>
<li>Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+gene-alcohol+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of gene-alcohol interactions.</a> Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).</li>
<li>Fernandes, Y., Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Genesis. 59 (11), 23460(2021).</li>
<li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis%3A+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li>
<li>Choe, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+fluorescent+zebrafish+lines+that+have+revolutionized+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research.</a> Lab Animal Research. 37 (1), 26(2021).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+A+multisite+gateway-based+construction+kit+forTol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Don, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tol2+gateway-compatible+toolbox+for+the+study+of+the+nervous+system+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease.</a> Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).</li>
<li>Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols">https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols</a> (2017).</li>
<li>The Tol2Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page">http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</a> (2007).</li>
<li>Mosimann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+gateway+calculations%3A+Excel+spreadsheet%5BTitle%5D)+AND+%22protocols.io%22%5BJournal%5D)">Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet.</a> protocols.io. , (2022).</li>
<li>Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-endodermal+interactions+are+required+for+pancreatic+%CE%B2+cell+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction.</a> Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).</li>
<li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharyngeal+pouches+and+clefts%3A+Development%2C+evolution%2C+structure+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).</li>
<li>Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp+signaling+mediates+endoderm+pouch+morphogenesis+by+regulating+Fgf+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish.</a> Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).</li>
<li>Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+an+emerging+model+system+in+ecotoxicology+and+toxicology%3A+Historical+review%2C+recent+advances%2C+and+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends.</a> Science of The Total Environment. 848, 157665(2022).</li>
<li>Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+the+toxicant+screening+model%3A+Transgenic+and+omics+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches.</a> Aquatic Toxicology. 234, 105813(2021).</li>
<li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109 (3), 577-584 (1988).</li>
<li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication%2C+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103 (2), 403-412 (1990).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2-mediated+transgenesis%2C+gene+trapping%2C+enhancer+trapping%2C+and+Gal4-UAS+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

דגי זברה מתאימים באופן אידיאלי לחקר ההשפעה של חשיפה לאתנול על התפתחות ומצבי מחלות 7,8. דגי זברה מייצרים מספר רב של עוברים שקופים, מופרים חיצונית וניתנים למשיכה גנטית, מה שמאפשר הדמיה חיה של מספר רקמות וסוגי תאים המסומנים בטרנסגנים בו זמנית בהקשרים סביבתיים מרובים19,20. חוזקות אלה, בשילוב עם השימור הגנטי ההתפתחותי החזק עם בני אדם, הופכות את דגי הזברה למערכת מודל רבת עוצמה להדמיית ההשפעה</...

חשיפה לאתנול טרום לידתי מולידה רצף של ליקויים מבניים וליקויים קוגניטיביים המכונים הפרעות ספקטרום אלכוהול עוברי (FASD)1,2,3,4. היחסים המורכבים בין גורמים מרובים הופכים את לימוד והבנת האטיולוגיה של FASD בבני אדם למאתגרים. כדי לפתור את האתגר הזה, נעשה שימוש במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים. הכלים הביולוגיים והניסיוניים הזמינים במודלים אלה הוכיחו את עצמם כחיוניים לפיתוח הבנתנו את הבסיס המכניסטי של טרטוגניות אתנול, והתוצאות ממערכות מודל אלה תואמות להפליא את מה שנמצא במחקרי אתנול אנושיים 5,6. בין אלה, דגי זברה התפתחו כמודל רב עוצמה לחקר אתנול טרטוגנזה7,8, בין היתר בשל ההפריה החיצונית שלהם, פריון גבוה, יכולת משיכה גנטית ועוברים שקופים. עוצמות אלה משתלבות והופכות את דגי הזברה לאידיאליים למחקרי הדמיה חיים בזמן אמת של FASD באמצעות קווי דגי זברה טרנסגניים.
דגי זברה טרנסגניים שימשו באופן נרחב לחקר היבטים רבים של התפתחות עוברית9. עם זאת, יצירת מבנים טרנסגניים וקווים טרנסגניים הבאים יכולה להיות קשה מאוד. טרנסגן סטנדרטי דורש אלמנט מקדם פעיל כדי להניע את הטרנסגן ואות פולי A או "זנב", כולם בווקטור חיידקי יציב לתחזוקה וקטורית כללית. הדור המסורתי של מבנה מהונדס מרובה רכיבים דורש שלבי שיבוט משנה מרובים הגוזלים זמן רב10. גישות מבוססות PCR, כגון הרכבת גיבסון, יכולות לעקוף חלק מהבעיות הקשורות לשיבוט משנה. עם זאת, פריימרים ייחודיים חייבים להיות מתוכננים ונבדקים עבור הדור של כל מבנה מהונדס ייחודי10. מעבר לבניית טרנסגנים, אינטגרציה גנומית, העברת תאי נבט וסינון לאינטגרציה טרנסגנית תקינה היו קשים גם כן. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לשימוש במערכת טרנסגנזה מבוססת טרנספוזון Tol2 (Tol2Kit)10,11. מערכת מודולרית זו משתמשת בשיבוט שער מרובה אתרים כדי ליצור במהירות מבנים טרנסגניים מרובים מספרייה הולכת ומתרחבת של וקטורי "כניסה" ו"יעד". אלמנטים משולבים הניתנים לטרנספוזיה Tol2 מגבירים מאוד את קצב הטרנסגנזה, ומאפשרים בנייה מהירה ואינטגרציה גנומית של טרנסגנים מרובים. באמצעות מערכת זו, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש ביצירת קו דגי זברה טרנסגניים של אנדודרם כדי לחקור את הפגמים המבניים הספציפיים לרקמות העומדים בבסיס FASD. בסופו של דבר, בפרוטוקול זה, אנו מראים כי ההתקנה המודולרית והבנייה של מבנים טרנסגניים יסייעו מאוד למחקר FASD מבוסס דגי זברה.

<table><tbody><tr><td>ארגז הכלים Addgene Tol2</td><td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>אוויר</td><td></td><td></td><td>מסופק ישירות על ידי האוניברסיטה</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>איזון אנליטי</td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>Borosil 1.0 מ"מ OD x 0.75 מ"מ ID נימי</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>BioVision</td><td>2486</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי</td><td>אולימפוס</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>אולימפוס</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Lawson Lab תורם הכנת פלסמיד</td><td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>LB אגר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP9724</td><td></td></tr><tr><td>LB מרק</td><td>פישר מדעי</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>EEO נמוך / רב תכליתי / ביולוגיה מולקולרית כיתה אגרוז</td><td>פישר מדעי</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Plus Enzyme</td><td>Fisher Scientific</td><td>12538200</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי (Heptahydrate)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מיקרו פיפטה</td><td>מכשור מדעי יישומי</td> צינור מיקרוצנטריפוגה <td>MIMPH-M-PIP</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ"ל&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-724</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-716</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>קצות מיקרופיפטה 10 &mu; L&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>טיפים למיקרופיפטה 1000 &mu; L&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13611127</td><td></td></tr><tr><td>טיפים למיקרופיפטות 200 &mu; L&nbsp;</td><td></td> ערכת תמלול <td>Fisher Scientific</td> 13611112 <td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Mosimann Lab Tol2 גיליון עבודה לחישוב</td><td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר NanoDrop</td><td></td><td>NanoDrop ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי 100 מ"מ&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>פנול מלח נתרן אדום</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P4758-5G</td><td></td></tr><tr><td>פיפטמן L p1000L מיקרופיפטה</td><td>גילסון</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>פיפטמן L p200L מיקרופיפטה</td><td>גילסון</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>פיפטמן L p2L מיקרופיפטה</td><td>גילסון</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט (דו-בסיסי)</td> <td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>מזרק לחץ</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep ספין מיני-פרפ ערכת</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט (דו-בסיסי)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Stericup .22 ומיקרו; מערכת סינון ואקום M&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>Tol2 Wiki Page</td><td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Top10 Chemical Qualified E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Pipetter Puller</td><td>David Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish microinjection mold</td><td>Adaptive Science</td><td>Tools i34</td><td></td></tr></tbody></table>

מערכת tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) מאופיינות במערך משתנה מאוד של פגמים מבניים וליקויים קוגניטיביים הנובעים מחשיפה לאתנול לפני הלידה. בשל הפתולוגיה המורכבת של FASD, מודלים של בעלי חיים הוכיחו את עצמם כקריטיים להבנתנו הנוכחית של פגמים התפתחותיים הנגרמים על ידי אתנול. דגי זברה הוכיחו את עצמם כמודל רב עוצמה לבחינת פגמים התפתחותיים הנגרמים על ידי אתנול בשל רמת השימור הגבוהה הן של גנטיקה והן של התפתחות בין דגי זברה לבני אדם. כמערכת מודל, לדגי זברה יש תכונות רבות שהופכות אותם לאידיאליים למחקרים התפתחותיים, כולל מספר רב של עוברים מופרים חיצונית שהם ניתנים למשיכה גנטית ושקופים. זה מאפשר לחוקרים לשלוט במדויק על העיתוי והמינון של חשיפה לאתנול בהקשרים גנטיים מרובים. אחד הכלים הגנטיים החשובים הזמינים בדגי זברה הוא טרנסגנזה. עם זאת, יצירת מבנים טרנסגניים והקמת קווים טרנסגניים יכולה להיות מורכבת וקשה. כדי להתמודד עם בעיה זו, חוקרי דגי זברה הקימו את מערכת הטרנסגנזה Tol2 המבוססת על טרנספוזון. מערכת מודולרית זו משתמשת בגישת שיבוט שער מרובה אתרים להרכבה מהירה של מבנים טרנסגניים שלמים מבוססי טרנספוזון Tol2. במאמר זה אנו מתארים את ארגז הכלים הגמיש של מערכת Tol2 ופרוטוקול ליצירת מבנים טרנסגניים המוכנים לטרנסגנזה של דגי זברה והשימוש בהם במחקרי אתנול.

כדי ליצור את המבנים הטרנסגניים, השתמשנו במערכת הטרנסגנזה Tol2. שלושה וקטורי כניסה, כולל p5E, המחזיק את האלמנטים מקדם/משפר הגנים, pME, המחזיק את הגן לביטוי על ידי האלמנטים המקדם/משפר, ו-p3E, אשר לכל הפחות, מחזיק את זנב הפוליA, שימשו ליצירת המבנה המהונדס באמצעות שיבוט LR מרובה אתרים. וקטור היעד, pDest, מספק את החזרות של Tol2 להחדרה גנומית של המבנה המהונדס בעוברים של דגי זברה, ומכיל את כל המידע הגנטי החיוני לצמיחת חיידקים (איור 1A). לצורך כתב יד זה, יצרנו והזרקנו מבנה מהונדס sox17:...

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

דגי זברה טרנסגניים הוכיחו את עצמם כקריטיים להבנתנו את התפתחות העוברים. מערכת Tol2 היא כלי רב-תכליתי המאפשר לחוקרים ליצור במהירות ובשיטתיות דגי זברה טרנסגניים מרובים עבור מחקרי FASD. העיצוב המודולרי והקלות של יצירת רכיבי ערכה חדשים הופכים את מערכת Tol2 לכלי רב-תכליתי ליצירת טרנסגניות חדשות ללא צורך בעיצוב מחדש של רכיבים כלשהם בערכה.עצתי לחוקרים המבצעים טכניקה זו בפעם הראשונה היא לבצע מספר ריצות ניסוי כדי להתאמן על הדיוק של יצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים. כדי להתחיל, ליניאריזציה של פלסמיד ערכת Tol2 המכיל טרנספוזאז עם אנדונוקלאז הגבלה אחד על ידי שילוב של 10 מיקרוליטר של פלסמיד טרנספוזאז, 1.5 מיקרוליטר של חיץ תגובת הגבלה אנדונוקלאז, ו 0.3 מיקרוליטר של אנדונוקלאז אחד בצינור מיקרוצנטריפוגה של 500 מיקרוליטר. מלא את התגובה עד 20 מיקרוליטר עם מים ללא RNAse.מערבבים ומעכלים בטמפרטורה של 37 מעלות למשך הלילה. למחרת, לעצור את העיכול על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של 0.5 EDTA טוחן, שני מיקרוליטר של חמישה אמוניום אצטט טוחן, ו 80 מיקרוליטר של 100% אתנול לתערובת התגובה. מערבבים ומצננים במינוס 20 מעלות למשך הלילה.למחרת, צנטריפוגות ושאפו את הסופרנאטנט לפני שתשהו מחדש את כדורית הדנ"א במים נטולי RNAse. לאחר מכן לקבוע את ריכוז פלסמיד ליניארי בננוגרם למיקרוליטר על פלואורומטר על ידי הפעלת שני מיקרוליטרים של הדגימה. הגדר את ייצור ה- mRNA SP6 על ידי שילוב של 10 מיקרוליטר של 2X NTP/CAP, שני מיקרוליטרים של מאגר תגובה 10X, 0.1 עד מיקרוגרם אחד של תבנית DNA ליניארית בשני מיקרוליטרים של תערובת אנזימים SP6 בשפופרת של 500 מיקרוליטר.ממלאים את התגובה עד 20 מיקרוליטר במים נטולי RNAse ומערבבים לפני הדגירה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שעתיים, מוסיפים מיקרוליטר אחד של DNAse, מערבבים היטב ודגרים במשך 15 דקות נוספות. עצור את התגובה על ידי הוספת 30 מיקרוליטר של תמיסת משקעים ליתיום כלורי.מערבבים ומצננים במינוס 20 מעלות למשך הלילה. למחרת, צנטריפוגו את התמיסה לגלולת ה-mRNA ושאפו את הסופרנאטנט לפני ששטפו את הגלולה במיליליטר אחד של 80% אתנול. ייבשו באוויר את הגלולה והשהו אותה מחדש ב-20 מיקרוליטר מים נטולי RNAse.לקבוע את ריכוז mRNA באמצעות פלואורומטר, ולאחר מכן aliquot 100 ננוגרם של mRNA לכל צינור לשימוש יחיד ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לבצע את התגובה, אסוף 10 femtomole כל אחד של P5E, PME ו- P3E ו- 20 femtomole של וקטור היעד PDEST. זהה את הגודל של כל ארבעת הווקטורים וזוגות הבסיס ממקור הפלסמיד.לאחר קביעת הריכוז של כל ארבעת הווקטורים, תוך שימוש במשקל הדנ"א כ-660 גרם לכל שומה וגודל פלסמיד וזוגות בסיסים, מחשבים את סך כל הננוגרמים של פלסמיד הדרושים כדי להגיע ל-10 פמטומול עבור וקטורי כניסה או 20 פמטומולי עבור וקטור יעד. לאחר מכן, צור את המבנה sox17:EGFP-CAAX באמצעות הרכיבים המתוארים בכתב היד. באמצעות ריכוז הפלסמיד, חשב את סך כל המיקרוליטרים של כל פלסמיד הדרוש כדי להגיע ל -10 פמטומול או 20 פמטומול, ולאחר מכן חלק זאת בשניים לשימוש בתגובות חצי LR של חמישה מיקרוליטרים.צור 10 femtomole של P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) ו- 20 femtomole של וקטור יעד. הגדר תגובת חצי LR של חמישה מיקרוליטרים על ידי שילוב הנפחים של P5E, PME, P3E ו- PDEST בשפופרת של 500 מיקרוליטר. לאחר מכן מוסיפים מים סטריליים כדי להפוך את נפח ארבעה מיקרוליטר.מערבבים את אנזים ה-LR פעמיים במשך דקה כל אחד לפני הוספת מיקרוליטר אחד לתגובה ומערבבים היטב לפני הדגירה ב-25 מעלות צלזיוס. למחרת, להפסיק את תגובת LR על ידי הוספת 0.5 מיקרוליטר של proteinase K.Incubate ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחר מכן מגניב לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הפוך שלושה עד ארבעה מיקרוליטרים של פלסמיד לתאים מופשרים מבחינה כימית על ידי הוספת הפלסמיד ולתת לתאים לשבת על קרח במשך 25 עד 30 דקות.ואז חום לחשמל את התאים באמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות. לאחר הלם החום, הוסיפו 250 מיקרוליטר של מדיה נוזלית עשירה ללא אנטיביוטיקה לתאים ודגרו עם רעידות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות. מורחים 300 מיקרוליטר של תרחיף חיידקי על צלחת אחת של אמפיצילין לוריא-ברטאני ודגרים למשך הלילה.למחרת, סנן את המושבות לנוכחות שני פנוטיפים: ברור ואטום. קוטפים את המושבות השקופות אחת בכל פעם, מחסנים את התרבית הנוזלית ומנערים בטמפרטורה של 37 מעלות למשך הלילה. ערבבו 150 ננוגרם פלסמיד, 100 ננוגרם mRNA טרנספוזאז ו-2% פנול אדום על קרח.לאחר מכן להוסיף מים ללא RNA כדי להפוך את נפח שלושה מיקרוליטר. העבר עובר אחד בשלב התא באמצעות פיפטות העברה לצלחת ההזרקה המלאה ב- EM המכסה לחלוטין את האגר ולאחר מכן לחץ בעדינות על כ 50 עד 75 עוברים לכל חריץ של צלחת ההזרקה. הוסף את תערובת פנול פנול אדום mRNA לקצה הפתוח של מחט הזרקת נימים.מניחים את מחט הנימים בזרוע מתקן ההזרקה ומפעילים את מתקן ההזרקה. הורידו את המחט לתוך צלחת ההזרקה ושברו את הקצה באמצעות מלקחיים כדי לאפשר רק כמות קטנה של תערובת להישאב החוצה על ידי מתקן ההזרקה. להזריק את העוברים עם בולוס שלושה ננוליטר של תערובת פנול פנול אדום mRNA לתוך גוף התא של העובר.בסיום, הוציאו את העוברים מצלחת ההזרקה על ידי הוצאתם בעדינות מהחריץ והעבירו אותם לצלחת פטרי 100 מ"מ עם EM טרי. דוגרים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. בחר את השלב ההתפתחותי המתאים לביטוי טרנסגנים פלואורסצנטיים וסנן תחת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי. סינון עבור טרנסגנים שאינם פלואורסצנטיים על ידי סינון עבור סמנים טרנסגניים פלואורסצנטיים כגון GFP מונע על ידי מקדם ספציפי ללב עבור הגן Cmlc2.כאשר העוברים החיוביים להחדרה טרנסגנית מתפתחים למבוגרים ומגיעים לגיל הרבייה, מסננים אותם בנפרד להעברת קו הנבט ואקספרסיביות טרנסגנית על ידי הרבאתם לדגי זברה מסוג בר. לדוגמה, מושבות חיידקים המתקבלות מהטרנספורמציה של רקומבינציית LR מוצגות. מושבות שקופות הכילו מוצר רקומבינציה LR נכון יותר מ-85% מהזמן, בעוד שמושבות אטומות מעולם לא הכילו מוצר רקומבינציה נכון.עיכול אבחוני של שלוש המושבות מטרנספורמציה של תוצרי רקומבינציה LR הראה כי המושבה האטומה היחידה לא הכילה פלסמיד, בעוד ששתי המושבות השקופות הכילו רצועה אחת בזוג בסיס 9, 544. Transposase mRNA ב 1, 950 זוג בסיס מוצג כאן. ביטוי EGFP-CAAX של אנדודרם פסיפס נצפה ב-75% מהעוברים שהוזרקו.ביטוי סמן מהונדס של Cmlc2 EGFP בלב המתפתח נצפה 24 שעות לאחר ההפריה. לדגי זברה בוגרים הייתה העברת קו נבט של עוברים פלואורסצנטיים שנוצרו על ידי sox17:EGFP-CAAX כאשר האנדודרם מסומן במלואו עם EGFP-CAAX. הן האורך הקדמי-אחורי של האנדודרם והן האורך הגבי-גחוני של כל כיס משקיות אחת עד חמש נמדדו בעוברים מוטנטיים מסוג BMP שטופלו באתנול.אורכו הכולל של האנדודרם לא הושפע מגנוטיפ או טיפול. עם זאת, שקיות 1 ו-3 הראו עלייה משמעותית באורך השקית בין עוברים פראיים שלא טופלו לעוברים מסוג בר שטופלו באתנול, אך ירידה משמעותית באורכם בין מוטציות BMP שלא טופלו לבין מוטציות BMP שטופלו באתנול. פאוץ' 2 הראה עלייה משמעותית בגודל השקית בין קבוצות הבר שלא טופלו וטופלו באתנול ומוטציות BMP בהתאמה.כאשר מנסים הליך זה, קריטי להיות מדויקים בצנרת ודילול של מערכת Tol2, כמו גם פגיעה בגוף התא במהלך הזרקת העובר.

the-zebrafish-tol2-system-modular-flexible-gateway-based-transgenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מדגימים את הגישה שלנו למציאת פוטנציאל משפר אלמנטים מן הגנים מוסדר מבחינה התפתחותית והערכה תפקידם דרך transgenesis דג הזברה פסיפס.

דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer

בסרטון זה, אנו מדגימים הליך ליצירת קו טרנסגני יציב של דג זברה המבטא באופן מכונן חלבון מחוון מתח פלואורסצנטי בעקבות הזרקה משותפת של מערכת טרנספוזון Tol2 הכוללת את mRNA טרנספוזאז ומבנה טרנספוזון Tol2 המקודד את מחוון המתח הפלואורסצנטי.

Tol2 Transposon-mediated Zebrafish Transgenesis: הליך ליצירת דגי זברה טרנסגניים בעקבות הזרקה משותפת של מערכת Tol2 לעוברים מופרים של דגי זברה

פרוטוקול זה מתאר השיטה של ​​mutagenesis insertional מלכודת הגן באמצעות Gal4-VP16 ככתב הראשי וה-GFP / RFP ככתבים משניים בדג זברה. בערך אחד מעשרה צאצאי מלכודת גן תשואת דגי F0-להביע גבוה שיתוף להביע GFP וRFP. הליך המיון וניתן לשנות בקלות כדי להתאים לגודל של המעבדה מבצעת את מסך mutagenesis insertional.

גן השמנה באמצעות Gal4 בדג הזברה

מתקן דג זברה המתאים לגידול ומחקר in vivo בנוי בצורה קלה ומשתלמת. התחזוקה מינימלית. מתקן זה אידיאלי למעורבות סטודנטים ולמחקר עצמאי.

הקמת מתקן דג הזברה בנייה קלה למשתלם ו

מטרת מחקר זה היא להדגים כיצד ניתן להשתמש באסטרטגיית טרנסגנזה של פסיפס בדגי זברה כדי להעריך במהירות וביעילות את התרומות היחסיות של אונקוגנים מרובים בהתחלת הגידול והתקדמותו in vivo.

פסיפס דג הזברה Transgenesis לניתוח הגנום פונקציונלי של גנים שיתופיים מועמד בפתוגנזה גידול

כאן אנו מתארים את זרימת העבודה לשימוש במערכת TetON להשגת ביטוי גנים ספציפי לרקמה בסנפיר הזנב המתחדש של דג הזברה הבוגר.

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

מניפולציות מהונדסות ועריכה הגנום הן קריטיים עבור תפקודית בדיקות התפקידים של גנים ואלמנטים רגולטורית cis. הנה פרוטוקול microinjection מפורט עבור הדור של שינויים גנומיים (כולל מבנים transgene כתב ניאון בתיווך Tol2, TALENs, ו CRISPRs) מוצג לגבי דגים המודל המתהווה, עוקצן threespine.

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

כאן, אנו מראים את התהליך של יצירת קו דג זברה כתב מתח חשמלי הסלולר להמחיש את התפתחות, תנועה, דגים גידול תאים ויוו.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

אנו מתארים גישות על המניפולציה של גנים במערכת המודל האבולוציוני Astyanax mexicanus. שלוש טכניקות שונות מתוארים: בתיווך Tol2 transgenesis, יישוב מניפולציה של הגנום באמצעות CRISPR/Cas9, ואת נוקאאוט של הביטוי תוך שימוש morpholinos. כלים אלה צריך לאפשר חקירה ישירה של גנים שבבסיס וריאציית בין פני השטח - ואת מערת המגורים טפסים.

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימון חלבונים עם תג חלבון פלואורסצנטי בזחלי דג הזברה, מערכת in vivo שפותחה לאחרונה ושונתה שימושית במיוחד להדמיית חלבונים בשפע נמוך בדג הזברה.

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

חקור את מערכת Tol2 לטרנסגנזה מודולרית בדגי זברה לחקר פיתוח עוברים ומחלות כמו FASD. שיטה זו מאפשרת יצירה מהירה של זברות טרנסגניות ללא עיצוב מחדש של רכיבי ערכה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

גלה סרטונים נוספים