Name: בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: למד שיטה לסינון מהיר של עריכות גרמליין בזרע דגי זברה באמצעות PCR, אנזימי הגבלה ואלקטרופורזה. שיטה זו מספקת חלופה נגישה וחסכונית לשיטות סינון מבוססות ריצוף.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לאנה הינדס מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון על מאמציה הראשוניים להשיג DNA גנומי זרע באיכות טובה בשיטת הזריקה החמה. עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס (R01AR072009 ל- R.S.G).

<ol><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li>
<li>Troutwine, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Reissner+fiber+is+highly+dynamic+in+vivo+and+controls+morphogenesis+of+the+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine.</a> Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).</li>
<li>Xu, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems%3A+Overview%2C+innovations+and+applications+in+human+disease+research+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).</li>
<li>Creaser, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+technic+of+handling+the+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29+for+the+production+of+eggs+which+are+favorable+for+embryological+research+and+are+available+at+any+specified+time+throughout+the+year%5BTitle%5D)+AND+%22Copeia%22%5BJournal%5D)">The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year.</a> Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).</li>
<li>Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservatin+and+in+vitro+fertilization+at+the+zebrafish+international+resource+center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axonemal+dynein+heavy+chain+10+gene+is+essential+for+monocilia+motility+and+spine+alignment+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish.</a> Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).</li>
<li>Gray, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+screen+for+mutations+affecting+spine+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).</li>
<li>Brocal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+identification+of+CRISPR%2FCas9-induced+insertions%2Fdeletions+by+direct+germline+screening+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish.</a> BMC Genomics. 17, 259(2016).</li>
<li>Davis, M. W., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApE%2C+A+Plasmid+Editor%3A+A+freely+available+DNA+manipulation+and+visualization+program%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program.</a> Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619(2022).</li>
<li>Labun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v3%3A+Expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li>
<li>Hill, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+Peak+Parser%3A+Method+and+software+for+identification+of+unknown+indels+using+sanger+sequencing+of+polymerase+chain+reaction+products%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).</li>
<li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-TOM%3A+A+platform+for+high-throughput+tracking+of+mutations+induced+by+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China.+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems.</a> Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).</li>
<li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+identification+of+CRISPR%2FCas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).</li>
<li>Draper, B. W., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+zebrafish+sperm+cryopreservation+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1395(2009).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
</ol>

פרוטוקול זה מתאר שיטה לאפיון מהיר של עריכות גנום משוערות או מוטציות ממוקדות באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas על ידי ניתוח ממוקד של גנומי זרע זכריים F0. פרוטוקול זה צריך להיות מקובל על מודלים אחרים של בעלי חיים שבהם הזרע זמין לדגימה ללא המתת חסד. שיטה זו תגדיל את תפוקת הסינון לעריכות רצויות והיא שימושית במיוחד לזיהוי אירועי דפיקה נדירים בתיווך HDR. גישה זו משמשת גם להפחתת מספר חיות הניסוי המשמשות למציאת עריכה יציבה של קו הנבט על ידי הקלה על סינון מהיר של אלפי גנומים פוטנציאליים בדגימת זרע אחת מנשא F0 משוער, בניגוד לגישות מסו...

מערכת CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas היא כלי רב עוצמה לביצוע מוטגנזה ספציפית ללוקי ועריכת גנום מדויקת במערכת מודל Danio rerio (דג זברה) 1,2,3,4. Cas-ribonucleoprotein (RNP) מורכב משני מרכיבים עיקריים: Cas endonuclease (בדרך כלל Cas9 או Cas12a) ו- RNA מדריך סינתטי ספציפי ללוקוס (sgRNA)5. יחד, Cas-RNP יוצר שבר דו-גדילי (DSB) במיקום הרצוי שניתן לתקן על ידי אחד משני מנגנוני תיקון פנימיים. מנגנון התיקון הלא הומולוגי של הצטרפות הקצה (NHEJ) מועד לשגיאות ולעתים קרובות גורם למגוון של הוספות או מחיקות (indels) סביב DSB. אינדלים אלה יכולים להיות מזיקים אם הם מציגים מוטציה frameshift או עצירה מוקדמת ברצף החלבונים המתקבל. לחלופין, מנגנון התיקון מונחה הומולוגיה (HDR) משתמש בתבנית תורם עם אזורי הומולוגיה המקיפים את אתר DSB כדי לתקן את הנזק. חוקרים יכולים לנצל את מערכת HDR כדי ליצור עריכות גנומיות מדויקות. באופן ספציפי, הם יכולים להזריק במשותף מבנה תורם DNA דו-גדילי המכיל את העריכות הרצויות, כמו גם אזורים של הומולוגיה הצמודים לאתר DSB בגנום. הגידול בכלכלת הגודל של רכיבי CRISPR המיוצרים באופן מסחרי צמצם מאוד את המחסומים לסינון אתרים מרובים ולהקמת מאמצים בקנה מידה גדול יותר לעריכה מדויקת של הגנום. עם זאת, במודלים של בעלי חיים המתרבים מינית, צוואר בקבוק עיקרי הוא זיהוי ובידוד של בעלי חיים מוטנטיים יציבי נבט.
מערכת מודל דגי הזברה מציגה מספר תכונות מפתח המשפרות את השימוש בה במחקרים גנטיים הפוכים. קל לגדל אותם במספרים גדולים עם ציוד דיור ימי בסיסי, והנקבות מפגינות פריון גבוה כל השנה6. יתר על כן, הטלת הביצים וההפריה החיצונית שלהם הופכות אותם למקובלים למיקרו-הזרקה של רכיבי CRISPR/Cas. ה- Cas-RNP מוזרק בדרך כלל לעוברים של דגי זברה בשלב חד תאי כדי ליצור DSBs/תיקון שהוא, בתיאוריה, בירושה על ידי כל תאי הבת. עם זאת, גנומים דיפלואידים דורשים שני אירועי DSB/תיקון כדי לבצע מוטגניזציה של שני הכרומוזומים ההומולוגיים. יתר על כן, למרות ש- Cas-RNP מוזרק בשלב התא האחד, ה- DSB/תיקון עשוי להתרחש רק בנקודות מאוחרות יותר בהתפתחות. יחד, גורמים אלה תורמים לאופי הפסיפס של דגים המוזרקים F0. נוהג נפוץ הוא לחצות דגים המוזרקים F0 ולסנן את צאצאי F1 עבור indels / עריכות ספציפיות. עם זאת, מכיוון שלא לכל הדגים המוזרקים F0 יש מוטציות בקו הנבט, נוהג זה גורם להצלבות לא פרודוקטיביות רבות שאינן מייצרות את העריכה הרצויה. סינון הרקמה הסומטית F0 במקום F1 מגדיל את ההסתברות לבידוד מערך הנבט הרצוי ומקטין את מספר בעלי החיים הדרושים בתהליך זה.
ניתן לאסוף זרע בקלות מדגי זברה המוזרקים F0 ללא צורך בהמתת חסד. תכונה זו מאפשרת שימור בהקפאה וגזירה מחדש של מלאי זרע קפוא7 אך ניתן גם לנצל אותה כדי לסנן, לזהות ולבודד במהירות את נשאי הנבט של מוטציות גנומיות רצויות 8,9. Brocal et al. (2016) תיארו בעבר שיטה מבוססת ריצוף לסינון עריכות קו הנבט בדגי זברה זכרים בהזרקת F010. למרות שהיא שימושית לזיהוי האללים המוטנטים הנמצאים בקו הנבט, גישה זו עלולה להיות יקרה בתפוקה גבוהה וייתכן שלא תהיה נגישה לכל המעבדות. לעומת זאת, הפרוטוקול הנוכחי מציע אסטרטגיה נגישה וחסכונית מבוססת אלקטרופורזה לזיהוי עריכות קו הנבט. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון ובידוד מוטציות של קו הנבט באתרים ספציפיים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ברזולוציה גבוהה. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה דומה לזיהוי שילוב מוצלח של מבנה תורם המכיל עריכות ספציפיות. כמו תמיד, אם יש צורך בעריכות ספציפיות, ניתן לבצע אסטרטגיות מבוססות רצף במקביל לפרוטוקול המתואר להלן. למרות שפרוטוקול זה הוא ספציפי למערכת מודל דגי הזברה, עקרונות אלה צריכים להיות ניתנים להתאמה לכל מודל שבו איסוף הזרע הוא הליך שגרתי. יחד, אסטרטגיות אלה יאפשרו זיהוי של זכרים עם הזרקת F0 עם indels/edits germline שניתן לפתור על ג'ל לאחר תגובת שרשרת פולימראז סטנדרטית (PCR) ו / או הגבלת digest.

<table><tbody><tr><td>אבקת אגרוז&nbsp;</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>מיכלי גידול</td><td>קרולינה ביולוגית&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>161937 BstNI Restriction Enzyme</td><td>NEB</td><td>R0168S</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 Endonuclease</td><td>IDT</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>סולם DNA, 100 bp&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>FERSM0241</tr><tr><td>dnah10 מבנה תורם&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>DNA אוליגו בשפופרת; 0.025 ננומטר, טיהור מלח סטנדרטי, יבש. קשר פוספורותיואט על התורם בשלושת קשרי הפוספט הראשונים בשני הקצוות 5' ו-3' (5'-CCTCTCTCTTTCTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTCTTGCCT GGACCGAGTACCGTCGTGCCC AGTGATTACGTCACGC-3')</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 פריימר קדימה&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNA Oligo בשפופרת; 0.025 ננומטר, טיהור מלח סטנדרטי, יבש (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3')</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 פריימר הפוך&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNA Oligo בשפופרת; 0.025 ננומטר, טיהור מלח סטנדרטי, יבש ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3')&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 sgRNA סינתטי&nbsp;</td><td>סינתגו&nbsp;</td><td>sgRNA סינתטי, רצף מטרה: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'ספק</td><td></td></tr> <tr><td>כוח אלקטרופורזה</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>105ECA-115</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מסננים</td><td>Millipore</td><td>XX6200006P</td><td></td></tr><tr><td>Fish (מערכת) מים</td><td>גנרית</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורזה ג'ל (כולל מסגרת יציקה, מסרק ותא אלקטרופורזה)&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td>קופסת אור הדמיה <td>ג'ל B2</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Azure Biosystems</td><td>AZI200-01</td><td></td></tr><tr><td>כתם ג'ל, 10000X&nbsp;</td><td>קערת זכוכית Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>, 250 מ"ל&nbsp;</td>מיכלי בידוד <td>n/a</td><td></td> <td>גנריים</td></tr><tr><td>, 0.8 ליטר&nbsp;</td><td>Aquaneering</td><td>ZT080</td><td></td></tr><tr><td>צינור נימי Microcap עם נורה, 20 ומיקרו; L&nbsp;</td><td>Drummond</td><td>1-000-0020/CA</td><td></td></tr><tr><td>מיני-צנטריפוגה</td><td>ביו-ראד</td><td>12011919EDU</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטות, שונות עם טיפים מתאימים</td><td>גנרי&nbsp;</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוגל&nbsp;</td><td>גנרי&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>Promega</td><td>P119-C</td><td></td></tr><tr><td>מגבות נייר</td><td>גנריות</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PCR, 0.2 מ"ל</td><td>Bioexpress</td><td>T-3196-1</td><td></td></tr><tr><td>כף פלסטיק, עם חורים/חריצים קדוחים&nbsp;</td>פתרון <td>גנרי</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>KCl, 0.2 M RNAse Free</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 קדימה פריימר&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNA Oligo בשפופרת; 0.025 ננומטר, טיהור מלח סטנדרטי, יבש (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3')</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 פריימר הפוך</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNA Oligo בשפופרת; 0.025 ננומטר, טיהור מלח סטנדרטי, יבש (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3')&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 sgRNA סינתטי&nbsp;</td><td>סינתגו&nbsp;</td><td>sgRNA סינתטי, רצף מטרה: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'Restriction</td><td></td></tr> <tr><td>Enzyme 10X Buffer</td><td>NEB</td><td>B6003SVIAL</td><td></td></tr><tr><td>NaOH Solution, 50 mM&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td><td>S318; ספוג 424330010</td><td></td></tr><tr><td>, חיתוך בגודל 1 אינץ' x 1 אינץ' עם חריץ סגלגל קטן</td><td>כללי&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Taq פולימראז מאסטר מיקס, תרכיז חיץ 2X</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>TBE, 10X</td><td>VWR</td><td>E442</td><td></td></tr><tr><td>Thermal</td><td>Cycler Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>נייר טישו</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריקאין-מתאן-סולפונאט (Syncaine, MS-222), 0.016% במי דגים (pH 7.0&plusmn; 0.2)&nbsp;</td><td>Syndel</td><td>200-266</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base, 1M (חוצץ עם HCl ל-pH 8.0)&nbsp;</td><td>פרומגה</td><td>H5131</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

הופעתן של טכנולוגיות נוקלאז CRISPR-Cas ממוקדות חוללה מהפכה ביכולת לבצע עריכת גנום מדויקת במערכות מודל מבוססות ומתפתחות כאחד. מערכות עריכת הגנום של CRISPR-Cas משתמשות ב-RNA מנחה סינתטי (sgRNA) כדי לכוון אנדונוקלאז הקשור לקריספר (Cas) ל-DNA loci גנומי ספציפי, שבו אנדונוקלאז Cas יוצר שבר דו-גדילי. תיקון שברים דו-גדיליים על ידי מנגנונים המועדים לטעויות מהותיות מוביל להחדרות ו/או מחיקות, המשבשות את הלוקוס. לחלופין, הכללתם של תורמי DNA דו-גדיליים או אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים של DNA בתהליך זה יכולה לעורר הכללת עריכות גנום מדויקות החל מפולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים ועד תגים אימונולוגיים קטנים או אפילו מבנים חלבוניים פלואורסצנטיים גדולים. עם זאת, צוואר בקבוק משמעותי בהליך זה יכול להיות מציאת ובידוד העריכה הרצויה בקו הנבט. פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון ובידוד מוטציות של תאי נבט במוקדים ספציפיים בדגי זברה ( Danio rerio ); עם זאת, עקרונות אלה עשויים להיות ניתנים להתאמה בכל מודל שבו איסוף זרע in vivo אפשרי.

הגישות הניסיוניות המתוארות בפרוטוקול זה מאפשרות זיהוי מהיר יותר של עריכות גנום או אללים מזיקים לכאורה על ידי התמקדות בניתוח אלפי גנומים הנגזרים מאוסף הזרע הגברי המוזרק F0. איור 2 מדגיש כיצד לפרש את התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול זה.
כדי ליצור מוטציות בלוקוס p2ry12, הוזרקו לעוברים של דגי זברה בשלב חד-תאי Cas9 אנדונוקלאז ו-sgRNA ספציפי ל-p2ry12 (איור 2B, אור אפור). דגים בהזרקת F0 הוכנסו למערכת עד לבגרות מינית, וזרע...

טכנולוגיות CRISPR-Cas חוללו מהפכה בתחום עריכת הגנום. עם זאת, מציאת ובידוד עריכת קו הנבט הרצויה נותרה צוואר בקבוק משמעותי. לכן, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון מהיר של זרע דג זברה מוזרק F0 CRISPR לעריכות קו הנבט באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות, תקציר הגבלה ואלקטרופורזה בג'ל.

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה לסינון מהיר של אלפי גנומים באמצעות זרע של דג זברה בהזרקת F0 CRISPR. טכניקה זו היא יתרון בנגישות שלה. במקום גישות יקרות ומיוחדות המבוססות על ריצוף, השיטה שלנו משתמשת באנזימי הגבלת PCR ואלקטרופורזה בג'ל כדי לסנן נשאי F0 זכרים עבור indels או עריכות גנום ספציפיות.החלק הקשה ביותר של הליך זה הוא פשוט לקבל את הזרע במהירות, אבל זה הופך להיות טכניקה טובה עבור הפריה חוץ גופית אם אנחנו עובדים עם הרבה דגים דיסמורפיים, ולכן זו דרך קלה עבורנו לחצות דגים שעושים לנו צרות. התחילו בהקמת מיכלי רבייה הן לדגי הבר והן לדגיית F0 ודגרו על המכלים למשך הלילה. לאחר הרדמת הדג הזכר למחרת, השתמשו בכף מחוררת כדי להעביר אותו לערימה של מגבות נייר נקיות.גלגלו בעדינות את הדג כדי להסיר עודפי מים. יש להסיר את כל המים על ידי ייבוש עם רקמה נקייה ומקופלת. בעזרת הכפית המחוררת, מעבירים את הדג לספוג המוכן.הניחו את צד הגחון של הדג כלפי מעלה וכתם בעדינות את האזור סביב סנפירי פי הטבעת עם נייר טישו מקופל ונקי. כדי לאסוף את הזרע, השתמש בצינור נימי כדי להזיז בעדינות את סנפירי האגן מקו האמצע, לחשוף את cloaca. מניחים את צינור הנימים ליד cloaca.בעזרת האצבעות או זוג מלקחיים פילטר, סחטו בעדינות את דפנות הדג מהזימים כלפי מטה. באמצעות פעולה נימית, לאסוף את הזרע בצינור ולמקם אותו בצינור PCR המכיל 40 מיקרוליטר של 50

screening-sperm-for-the-rapid-isolation-of-germline-edits-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

זוהי שיטה להפקת דיפלואידי gynogenetic עוברי דג הזברה (אשר עוברים רק תרומה גנטית מגיע מהאם) על ידי חסימת חלוקת meiotic מחרה מחזיק אחריה מיד לאחר ההפריה עם זרע אור אולטרה סגול מומת. עוברים EP אינם הומוזיגוטים במלואה עקב רקומבינציה במהלך החלוקה meiotic הראשון, אולם הם הומוזיגוטים בכלל לוקוסים שלא היה מופרד centromere שלהם על ידי רקומבינציה.

ביצוע דיפלואידי דג הזברה Gynogenetic על ידי לחץ מוקדמת

PCR בשילוב עם ניתוח ברזולוציה גבוהה להמיס (HRMA) הוא הוכיח כשיטת מהירה ויעילה לגנוטיפ דג הזברה.

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

דג הזברה הוא מערכת מודל רבת עוצמה לביולוגיה התפתחותית וחקר מחלות אנושיות בשל הדמיון הגנטי שלהם עם בעלי חוליות גבוהים יותר. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ליצירת עוברי דג זברה הפלואידים שניתן להשתמש בהם לאסטרטגיות מסך קדימה לזיהוי מוטציות רצסיביות בגנים החיוניים לאמבריוגנזה מוקדמת.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

פרוטוקול שונה עבור מניפולציה ploidy משתמשת הלם החום להשפיע על דוכן אחד-מחזור ב cytokinesis בעובר המוקדם. פרוטוקול זה מודגם דג הזברה אבל עשוי לחול על מינים אחרים.

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

המטרה של פרוטוקול זה היא לשנות את penetrance של פנוטיפים קטלני השלד מוטציה בדג זברה באמצעות ברירה מלאכותית. מוטציות קטלני זין לבגרות וגדלתי עצמם, לכן פרוטוקול זה מתאר שיטת מעקב ובחירה penetrance לאורך הדורות מרובים על-ידי רומא בדיקות.

הסטה דג זברה קטלני השלד Penetrance מוטציה על ידי רומא בדיקות

דג זברה שימשו מודל גנטי אמין האורגניזמים במחקר ביו-רפואי, במיוחד עם כניסתו של טכנולוגיות לעריכת ג'ין. כאשר הזחל פנוטיפים צפויים, זיהוי ה-DNA החילוץ, גנוטיפ יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מתארים הליך genotyping יעיל עבור הזחלים דג זברה, מאת הזנב מסיכה, מוקדם ככל 72-h שלאחר ההפריה.

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות, אשר לקויים במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, וזה גורם לחוסר היכולת של השריר להתחדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

פרוטוקול זה מתאר גישה המאפשרת עריכות מדויקות של דגי זברה באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. צינור פנוטיפ מוצג כדי להדגים את הישימות של טכניקות אלה כדי לדגום וריאנט גן הקשור לתסמונת QT ארוכה.

CRISPR-Cas9-עריכות מדויקות בתיווך בלבבות דגי זברה

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע עריכה יעילה של בסיס אדנין ללא הגבלת PAM כדי לבנות מודל מדויק של מחלת דגי זברה באמצעות zSpRY-ABE8e.

עריכת בסיס יעילה ללא PAM עבור דגי זברה מידול של מחלות גנטיות אנושיות עם zSpRY-ABE8e

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מוטציה אימהית המצמיד קו נוק-אין יציב של zpc:cas9 עם מסירה בתיווך Tol2 של קלטות ביטוי sgRNA.

דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

למד שיטה לסינון מהיר של עריכות גרמליין בזרע דגי זברה באמצעות PCR, אנזימי הגבלה ואלקטרופורזה. שיטה זו מספקת חלופה נגישה וחסכונית לשיטות סינון מבוססות ריצוף.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

גלה סרטונים נוספים