פלטפורמה מיקרופלואידית לחקר סתימה ביולוגית במדיה נקבובית

שיטה זו מאפשרת מחקר שיטתי של השפעת גודל הנקבוביות וקצב הזרימה על התפתחות ביופילם במדיה נקבובית טבעית כמו גם מלאכותית, ובכך ניתן לפענח מנגנון בסיסי של סתימת מדיה נקבובית. היתרונות העיקריים של הטכניקות הם הרזולוציה המרחבית והזמנית הגבוהה ביותר של השינוי, ויכולת ההתאמה של הפלטפורמה למגוון תנאים ודרישות ניסיוניות. התחילו בהפעלת אינקובטור הקופסה של המיקרוסקופ שלוש שעות לפני הניסוי כדי להבטיח טמפרטורה יציבה של 25 מעלות צלזיוס.

חבר את צינורות הכניסה והיציאה להתקן המיקרופלואידי. אבטח את החיבור בין הצינור למזרק על ידי החדרת מחט בקוטר חיצוני של 0.6 מילימטר לתוך צינור הכניסה. הניחו את המכשיר המיקרופלואידי, 30 מיליליטר מים שעברו דה-יוניזציה ו-30 מיליליטר של מדיום תרבית במייבש ואקום ונטרלו אותם למשך שעה לפחות.

לאחר שתסיים, משוך באיטיות את מדיום התרבית ואת המים שעברו דה-יוניזציה לשני מזרקים נפרדים של 30 מיליליטר. לאחר מכן, הרכיבו את המכשיר המיקרופלואידי על המיקרוסקופ והניחו את צינור היציאה במיכל פסולת. חברו את המזרק המלא במים שעברו דה-יוניזציה לתעלה המיקרופלואידית דרך הצינור המיקרופלואידי והזריקו את המים באיטיות עד שהם יוצאים ממוצא חיישן הלחץ.

מלאו את חיישן הלחץ במים ושטפו את כל הבועות מהצינור המחבר בין התעלה המיקרופלואידית לחיישן הלחץ. סגור את היציאה של חיישן הלחץ עם הברגים הייעודיים לחיישן הלחץ. מלאו את שאר התעלה המיקרופלואידית במים נטולי יונים.

לאחר מכן, הניחו מסנן של 1.2 מיקרומטר על מזרק המדיה לתרבית. הסר את מזרק המים וחבר בזהירות את המזרק לצינורות המיקרופלואידים הנכנסים. לאחר הרכבת המזרק על משאבת המזרק, שוטפים את התעלה בתווך התרבית בקצב זרימה של שני מיליליטר לשעה למשך שעה.

לאחר מכן, כוונו את משאבת המזרק לקצב הזרימה הרצוי במהלך הניסוי וכוונו את קריאת הלחץ של חיישני הלחץ לאפס. לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד של תרבית Bacillus subtilis NCIB 3610 של צפיפות אופטית של 0.1 באורך גל של 600 ננומטר בבקבוקון צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. כדי לטעון את תרבית החיידקים לתוך התעלה המיקרופלואידית, הכניסו את צינור היציאה לבקבוקון הצנטריפוגה והמתינו חמש דקות כדי להסיר בועות אוויר פוטנציאליות ממוצא הצינור.

לאחר שתסיים, משכו 150 מיקרוליטר של תמיסה חיידקית בקצב זרימה של מיליליטר לשעה עד שהתעלה המיקרופלואידית תתמלא בתרבית החיידקים. לאחר מכן, הסר בזהירות את מסנן מזרק המדיה לתרבות והנח את השקע במיכל הפסולת. השאירו את תאי החיידק בתנאי זרימה אפסית בתעלה המיקרופלואידית למשך שלוש שעות כדי לאפשר את התקשרותם לפני השטח בתווך הנקבובי.

כדי להתחיל את הניסוי, התחל את הזרימה על ידי הגדרת משאבת המזרק לקצב הזרימה הרצוי והתחל את קריאת הלחץ בהרץ אחד לפני קבלת התמונות של הביופילמים הגדלים במרווח הזמן הרצוי, תצורה אופטית והגדלה. תהליך היווצרות הביופילם הודגם באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, שבו תאי החיידק והביופילם הופיעו בתמונות כפיקסלים כהים יותר. במהלך ניסוי של 24 שעות, הביופילם שגדל בתחילה באופן אקראי התיישב כמעט בכל התווך הנקבובי.

כיסוי פני השטח של הביופילם התרחש 10% מהר יותר בגודל הנקבוביות הקטן ביותר מאשר בגודל הנקבוביות הגדול ביותר לאחר 20 שעות. הקורלציה של כיסוי פני השטח של הביופילם עם הצטברות הלחץ הראתה כי הסתימה בתעלה המיקרופלואידית בגודל הנקבוביות הקטנה יותר הובילה להפרש לחצים גבוה יותר בין הכניסה לשקע מאשר בגודל הנקבוביות הגדולות יותר. ההיבטים החשובים ביותר שיש לזכור הם להריץ את הניסוי בסביבה יציבה בטמפרטורה ולנטרל היטב את המכשיר המיקרופלואידי ואת התמיסות על מנת למנוע היווצרות בועות.

שיטה זו מאפשרת למחקרים שיטתיים לפענח מנגנונים בסיסיים של גידול ביופילם הן במדיה נקבובית תעשייתית והן במדיה נקבובית טבעית ביחס להשפעת קצב הזרימה וגודל הנקבוביות.