HPLC בשילוב עם טביעת אצבע כימית לזיהוי תבניות מרובות לזיהוי האותנטיות של קלמטידיס ארמנדי קאולי

פרוטוקול זה יכול לספק אסטרטגיה חדשה לזיהוי יעיל של החומרים המקוריים של קאולית Clematidis armandii וחומרי הניאוף שלה. שיטה זו יכולה לשמש במחקר איכות החומר הרפואי והיא מספקת התייחסות לחקר תקני האיכות של חומרים רפואיים סיניים אחרים. כדי להתחיל בהכנת הדגימה טוחנים את חומר הגלם לגודל חלקיקים אחיד על ידי העברתם דרך רשת ניילון בקוטר פנימי מתאים.

ההעברה שקלה במדויק שני גרם של חומר הגלם הטחון לתוך בקבוק חרוטי של 50 מיליליטר לפני הוספת 50 מיליליטר של מתנול לתוך הצלוחית. שים את הפקק על הבקבוק ב קולי מחומם ב 600 וואט ו 40 קילוהרץ במשך 30 דקות. בסוף הדגירה, מסננים את תמיסת התמצית הרפואית דרך נייר הסינון.

לאחר מאמץ, מעבירים ארבעה מיליליטר מתמיסת המתנול המכילה את התמציות הרפואיות לתוך בקבוק נפחי של 10 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים שישה מיליליטר מים אליו ומערבבים את הפתרון. אפשר את הפתרון להתיישב במשך 10 דקות.

לניתוח HPLC של הדגימות. התחל על ידי הכנת השלבים הניידים והגדר את תוכנית ההדרגה של HPLC כמתואר בכתב היד. סנן את הדגימה דרך קרום מסנן מיקרו-נקבובי בגודל 0.45 מיקרון והכפיף אותה לניתוח HPLC.

עבור כל מדגם, בצע ניתוח שש פעמים ביום. כדי להעריך את היציבות של תמיסת הדגימה, נתח את אותה תמיסת דגימה המאוחסנת בטמפרטורת החדר עבור 0, 2, 4, 6, 8, 12 ו- 24 שעות לאחר ההכנה. קח שישה עותקים משוכפלים של אותה דגימה וזהה את טביעת האצבע שלה ב-HPLC.

ייבא את הנתונים הרלוונטיים לתוכנה בשם מערכת הערכת דמיון של טביעות אצבע כרומטוגרפיות של רפואה סינית מסורתית או SESCF TCM גרסה 2012. ייבא את זמן השמירה ואזור השיא עבור כל 10 האצוות של דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות, כמו גם חמש אצוות של ניאוף לתוך SESCF TCM לניתוח. בתפריט הראשי, לחץ על ספקטרום הייחוס שנקבע ועבור לחלון הגדרות הפרמטרים כדי להגדיר את טביעת האצבע הכרומטוגרפית של המין האותנטי של Chuanmutong כהפניה.

לאחר מכן, הגדר את שיטת יצירת ספקטרום הבקרה כשיטה החציונית עם רוחב חלון הזמן של 0.5. לאחר מכן, לחץ על כיול מרובה נקודות בתפריט הראשי, בחר את הפסגות ולאחר מכן בחר באפשרות התאמת השיא כפסגות מסומנות. לבסוף, לחץ על חשב דמיון כדי לבצע ניתוח דמיון של הדגימות בהתבסס על טביעות האצבע הכרומטוגרמיות של צ'ואנמוטונג.

כדי לבצע ניתוח אשכולות מערכתי פתח תוכנת ניתוח סטטיסטית רלוונטית, ולחץ על הקובץ כדי לייבא את הנתונים של 10 אצוות של דגימות אותנטיות וחמש אצוות של ניאוף לתוך התוכנה. בתפריט, תחת הכרטיסיה סיווג עבור אל לחץ על ניתוח ואשכולות מערכת. בחר את אזורי השיא המשותפים של 10 אצוות של דגימות אותנטיות וחמש אצוות של ניאוף כמשתנים.

הגדר את מספר האשכולות לארבעה. לאחר מכן, לחץ על שיטה כדי לבחור את שיטת האשכולות כחיבור בין קבוצות. בחר את מרווח המדידה כמתאם פירסון והשתמש בכרטיסיה בסדר כדי לצייר את מפת ניתוח האשכולות.

לניתוח רכיבים עקרוניים או PCA, פתח את תוכנת ניתוח הנתונים. לחץ על קובץ בתפריט, וצור פרויקט רגיל חדש. יבא את אזור השיא של 12 פסגות נפוצות בגיליון אלקטרוני של Excel או בגיליון אלקטרוני דומה ממערכת HPLC.

הכה את סיום כפתור להשלמת ייבוא הנתונים. כדי להגדיר את סוג הדגם עם PCA, לחץ על חדש כדי ליצור מודל חדש ולאחר מכן התאם את הנתונים באמצעות התאמה אוטומטית והוסף כרטיסיות. עבור אל ציונים כדי לקבל את מפת ציוני PCA.

כדי להשתמש בניתוח האפליה של ריבועים לפחות חלקיים אורתוגונליים או OPLSDA. צור את מפת ציוני ה- PCA כפי שהודגם קודם לכן. הגדר את סוג המודל עם OPLSDA על-ידי לחיצה על חדש וחדש כמודל אחד לפני שתעבור לקנה מידה בבחירת par עבור כולם, ולאחר מכן לחץ על התאמה אוטומטית בניקוד כדי ליצור את מפת התוצאות של OPLSDA.

כדי להעריך את החשיבות המשתנה ואת ההקרנה, עבור לתפריט תוכנת ניתוח הנתונים ועבור אל נתח ולאחר מכן הגדר את המספר ל-200 מתחת לכל מוטציה. קבל את הערכים הריבועיים R ו- Q מציון OPLSDA ולחץ על חיזוי VIP ו- VIP כדי לקבל את מפת ה- VIP. טביעות אצבע HPLC של 10 דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות הראו 12 פסגות משותפות נפרדות, מתוכן הגדולות יחסית ונפתרו היטב.

שיא מספר 10 שימש כשיא הייחוס כדי להעריך את זמני השמירה היחסיים של פסגות השאר. הדגימות האותנטיות הדגימו דרגות דמיון קרובות מאוד לאחת מהן המרמזות על דמיון גבוה בעקביות טובה. עם זאת, דרגות הדמיון בין חמש קבוצות הניאוף לבין צ'ואנמוטונג הבקרה היו נמוכות למדי.

טביעות האצבע של HPLC של חמשת הנואפים נצפו כשונות מהדגימות האותנטיות, בעיקר באזור בעל זמני שמירה הנעים בין 28 ל -55 דקות. PCA הראה דמיון ברור בין הזנים האותנטיים לבין ההבדל ביניהם לבין הניאוף CC.תוצאות דומות התקבלו גם מניתוח אשכולות כאשר מרחק הסיווג היה 20. מטריצת הניקוד שנוצרה מ- OPLSDA לא הצביעה על שום צומת בין נקודות הדגימה של דגימות אותנטיות לבין הניאוף.

שוב, CC נואף דומה לזנים האותנטיים יותר משאר הניאוף. על פי מפת ה-VIP, פסגות בעלות ערכים גדולים מאחד זוהו כמרכיבי הסמן העיקריים הגורמים להבדל בין דגימות אותנטיות לבין הניאוף. התוכן של בטא-סיטוסטרול, מרכיב פעיל שנמצא בצ'ואנמוטונג זוהה בכל חמש הקבוצות של ניאוף, אך התוכן השתנה מאוד.

פרוטוקול זה קובע שיטות ניתוח שונות כדי לשקף את כל המידע על חומרים רפואיים מזוויות רבות ובכל רחבי הדרך כדי להעריך את האותנטיות של חומרים רפואיים Chuanmutong.