Name: בדיקת מלכיט ירוק לגילוי מעכבי חלבון הלם חום 90 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: למדו את שיטת מלכיט ירוק לגילוי מעכבי חלבון הלם חום 90 בחלבוני ATPase. שיטה זו מאפשרת סינון רחב-היקף ואוטומציה לזיהוי מהיר של תרכובות מעכבות לטיפול בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מלגות המחקר של קוריאה (KRF), עמית פוסט-דוקטורט של קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF), במימון משרד המדע והתקשוב (NRF-2019H1D3A1A01102952). המחברים מודים למענק KIST ולמענק משרד האוקיינוסים והדיג מספר 2MRB130 על מתן סיוע כספי לפרויקט זה.

1. בדיקת מלכיט ירוק בקנה מידה מעבדתי
<ol><li>הכנת מאגר בדיקה<ol><li>הכינו את מאגר הבדיקה, בהתאם להרכב ולהכנה המוצגים בטבלה 1.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת תקני פוספט<ol><li>יש להשתמש בתקן פוספט 1 mM, המסופק בערכת בדיקת פוספט ירוק מלכיט (מאוחסן ב- 4 °C).</li>
		<li>פיפטה 40 μL של 1 mM פוספט סטנדרטי ב 960 μL של מים טהורים במיוחד כדי לקבל 40 מיקרומטר פוספט תמיסת (תמיסת premix). הוסף את תמיסת הפרה-ערבוב עם מים טהורים במיוחד, בהתאם להוראות היצרן, ליצירת דילול סדרתי של פוספט מ-0 עד 40 מיקרומטר.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת שמרים Hsp90<ol><li>יש להשתמש בשמרים Hsp90 עם ריכוז מלאי גליצרול של 0.66 מ"ג/מ"ל. יש להפשיר על קרח ממש לפני השימוש.</li>
		<li>יש להשתמש ב-8 μL (5.98 מיקרוגרם, 0.80 מיקרומטר) של שמרים Hsp90 לפעילות ATPase מדידה. בדוק כי הפרש הצפיפות האופטית לאחר הוספת מגיב ירוק מלכיט בין הבקרה הריקה והחיובית הוא לפחות 0.5 ופחות מ -1.0. כאן, הפרש הספיגה בין הבקרה הריקה (ללא Hsp90) לבין הבקרה החיובית (עם Hsp90) נמצא 0.510.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת ATP<ol><li>העבירו 1 מ"ג ATP לבקבוקון המכיל 453.39 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד כדי לקבל 4 מילימטר של תמיסת מלאי. בצע חישובי משקל המבוססים על ATP נטול מים (משקל מולקולרי [m.w.] = 551.14). הכינו ATP טרי, מכיוון שהוא יכול לבצע הידרוליזה ספונטנית לאורך זמן.</li>
		<li>הוסף 4 μL של תמיסת מלאי ATP לכל באר כדי לתת ריכוז באר סופי של 0.2 mM (נפח באר הבדיקה הכולל הסופי של 80 μL). הוסף ATP כמרכיב האחרון לתגובה, באמצעות פיפטה רב ערוצית כך שכל התגובות יתחילו בו זמנית.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת geldanamycin (GA)<ol><li>הכן מלאי של 10 mM של GA על ידי המסת 1 מ"ג ב 178.37 μL של DMSO (m.w. = 560.64). באמצעות פתרון המלאי, להכין 4 mM, 0.8 mM, 0.16 mM, 0.032 mM, 0.0064 mM, ו 0.00128 mM פתרון ב DMSO על ידי דילול טורי.</li>
		<li>הוסף 2 μL של פתרונות מלאי אלה לכל באר כדי לקבל ריכוז באר סופי של 0.1 mMM, 0.02 mM, 0.004 mM, 0.0008 mM, 0.00016 mM, ו 0.000032 mM, בהתאמה.</li>
		<li>הכינו את הבארות כמתואר בטבלה 2 ובטבלה 3, כאשר הבארות מכילות את החסר (חיץ + מים + DMSO) ואת הבקרה השלילית (Hsp90 בחיץ + מים + DMSO). הבארות המכילות GA (Hsp90 בחיץ + מים + GA) משמשות כבקרה חיובית.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת צלחות באר וסדר התוספות<ol><li>הכינו לוחות של 96 בארות עם הפריסה המוצגת בטבלה 2. עבור תרכובות המראות בליעה של 620 ננומטר, הכינו באר נפרדת לרישום הבליעה באורך גל זה. אין להכין באר נפרדת עבור GA, שכן GA אינו מראה ספיגה ב 620 ננומטר עבור הריכוז המשמש בבדיקה.</li>
		<li>הכינו לכל מרכיב את הנפח הכולל של כל מרכיב, כפי שמוצג בטבלה 3.</li>
		<li>הגדר בארות בדיקה על ידי הוספת מים טהורים במיוחד לכל באר. לאחר מכן, הוסף את הכמות הנדרשת של מאגר הבדיקה ותמיסה מורכבת (לדוגמה, פתרון GA).</li>
		<li>לאחר מכן, הוסיפו את Hsp90 לבארות המתאימות, ונערו את הצלחות במשך 2 דקות על שייקר צלחות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הוסף 4 μL של פתרון ATP באמצעות פיפטה רב ערוצית. עוטפים את הצלחת ברדיד אלומיניום ומנערים במשך 2 דקות על שייקר (200 סל"ד) בטמפרטורת החדר. לדגור על הצלחת ב 37 ° C במשך 3 שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנה והוספה של מגיב ירוק מלכיט<ol><li>מגיב ירוק מלכיט מורכב ריאגנטים A (אמוניום מוליבדט ב 3M HCl) ו- B (מלכיט ירוק ואלכוהול פוליוויניל). יש להביא את המגיב לטמפרטורת החדר לפני השימוש. מערבבים ריאגנטים A ו-B ביחס של 100:1 (1,000 μL:10 μL). הכינו אותו תוך 3 שעות לפני השימוש, מכיוון שהוא אינו יציב ומתחיל להתפרק לאחר 3 שעות.</li>
		<li>לאחר 3 שעות של שלב 1.6.5, לעצור את התגובה על ידי הוספת 20 μL של מגיב ירוק מלכיט, הוסיף באותו סדר כמו ATP, באמצעות פיפטה רב ערוצית.</li>
		<li>לאחר דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר, מדדו את ספיגת הצלחת ב-620 ננומטר בקורא לוחות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. סינון בתפוקה גבוהה של מעכבי Hsp90 על ידי בדיקת מלכיט ירוק
הערה: הפרוטוקול לסינון בתפוקה גבוהה דומה למתודולוגיה בקנה מידה של מעבדה. נפח הבאר הסופי בכל מקרה הוא 80 μL. עם זאת, יש הבדל קל בסדר של תוספת של ריאגנטים. בשיטה המבוססת על קנה מידה מעבדתי, ישנם חמישה שלבים של חיבור תמיסה (34 μL מים, 32 μL של חיץ, 2 μL תרכובת DMSO, 8 μL של Hsp90, ולבסוף 4 μL של תמיסת ATP). לעומת זאת, עם HTS ישנם שלושה שלבים של חיבור (40 μL של תמיסת חיץ המכילה שמרים Hsp90, 2 μL של DMSO ב 18 μL של מים המכילים את התרכובות, ולבסוף 20 μL של ATP מומס במים). הכמות המינימלית של תמיסה שניתן pipeted במדויק בהגדרת HTS הוא 20 μL. לפיכך, נצפה הבדל בצנרת בין קשקשי מעבדה ו- HTS.
<ol><li>הכנת חיץ בדיקה (pH 7.4)<ol><li>השתמש באותו מאגר ב- HTS כמו בבדיקת מלכיט ירוק בקנה מידה מעבדתי (טבלה 1).</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת שמרים Hsp90<ol><li>יש להשתמש בחלבון עם ריכוז מלאי גליצרול של 0.66 מ"ג/מ"ל. יש להפשיר על קרח ממש לפני השימוש.</li>
		<li>יש להשתמש ב-8 μL (5.98 מיקרוגרם, 0.80 מיקרומטר) של שמרים Hsp90 בכל באר, המספקים פעילות ATPase מדידה.</li>
		<li>לדלל את החלבון (8 μL) במאגר (32 μL) עבור כל באר. נפח העבודה הכולל הסופי עבור כל באר הוא 40 μL בנפח בדיקה כולל של 80 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנה של 0.8 mM ATP<ol><li>יש להמיס 1 מ"ג ATP ב-2,267 מיקרוליטר מים מזוקקים לקבלת תמיסה של 0.8 מילימול. נפח העבודה הכולל עבור כל באר הוא 20 μL בנפח בדיקה כולל של 80 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת geldanamycin (GA) / תרכובות בדיקה<ol><li>הכן מלאי של 0.8 mM של GA ב- DMSO, כמו בשלב 1.5. לדלל 10 μL של מלאי GA עם 90 μL של מים כדי לתת ריכוז סופי של 80 μM.</li>
		<li>השתמש ב- 20 μL של תמיסת GA של 80 μM בבארות בדיקה מתאימות (נפח באר הערכה כולל כולל = 80 μL), מה שנותן ריכוז באר סופי של 20 μM. זה משמש שליטה חיובית.</li>
		<li>עבור תרכובות בדיקה, להכין תמיסות DMSO לפי הריכוז הרצוי שלהם להערכה.</li>
		<li>הכינו 10 מיקרוליטר DMSO ב-90 מיקרוליטר מים לתוספת לבארות ריקות (חיץ + מים + DMSO) ובארות בקרה שליליות (Hsp90 בחיץ + מים + DMSO). הכינו את תרכובות הבדיקה באופן דומה בריכוז באר סופית של 100 מיקרומטר.</li>
	</ol></li>
	<li>עיצוב לוחות בדיקה וסדר התוספות<ol><li>השתמשו בארבע לוחיות עיקריות, צלחת מורכבת אחת וארבע לוחיות נוספות המכילות מלאי ריאגנטים כדי להגדיר את הבדיקה (איור 2 וטבלה 4).</li>
		<li>בנוסף, צלחת A, להוסיף 90 μL של חיץ assay בכל באר; בנוסף צלחת B, להוסיף 90 μL של חיץ עם Hsp90 בכל באר; בנוסף, לוחות C ו-D, מוסיפים 90 μL של ATP ו-90 μL של מגיב ירוק מלכיט, בהתאמה, בכל באר (טבלה 5 וטבלה 6).</li>
		<li>מצלחת חיבור A וצלחת B, להעביר 40 μL של פתרון מכל באר לצלחת הראשית 1 ו 2, 3 ו 4, בהתאמה, באמצעות מערכת ניפוק רב ערוצית אוטומטית. כאן נעשה שימוש בתחנת העבודה לאוטומציה של מעבדת Biomek(R) FXP (איור 2 וטבלה 6).</li>
		<li>מכל באר של הצלחת התרכובת העבירו 20 מיקרוליטר של התמיסה ללוחות הראשיים 1, 2, 3 ו-4 (איור 2). נערו את הצלחות במשך דקה אחת בשייקר (200 סל"ד).</li>
		<li>מכל באר של לוח C (ATP), העבירו 20 מיקרוליטר תמיסה ללוחות הראשיים 1, 2, 3 ו-4 (איור 2). נערו את הצלחות במשך דקה אחת בשייקר (200 סל"ד).</li>
		<li>לדגור את הצלחות במשך 3 שעות ב 37 ° C.</li>
		<li>הכינו את מגיב ירוק מלכיט לפי שלב 1.7. לאחר 3 שעות, העבירו 20 מיקרוליטר של מגיב ירוק מלכיט מלוח הוספה D לבארות של לוחות ראשיים 1,2, 3 ו-4 (איור 2).</li>
		<li>לאחר דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר, מודדים את ספיגת הצלחת ב-620 ננומטר בקורא לוחות.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+attack+on+multistep+oncogenesis+by+inhibiting+the+Hsp90+molecular+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone.</a> Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).</li>
<li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis%3A+emerging+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).</li>
<li>Mahalingam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HSP90+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting HSP90 for cancer therapy.</a> British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).</li>
<li>Dutta Gupta, S., Pan, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+update+on+discovery+and+development+of+Hsp90+inhibitors+as+senolytic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+HSP90+inhibitors+as+a+novel+class+of+senolytics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics.</a> Nature Communications. 8 (1), 422(2017).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90+inhibitors+as+senolytic+drugs+to+extend+healthy+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging.</a> Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).</li>
<li>Pearl, L. H., Prodromou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).</li>
<li>Park, H. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+full+potential+of+Hsp90+inhibitors+as+cancer+therapeutics+through+simultaneous+inactivation+of+Hsp90%2C+Grp94%2C+and+TRAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1.</a> Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).</li>
<li>Hoy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pimitespib%3A+first+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Pimitespib: first approval.</a> Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).</li>
<li>Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+heat+shock+protein+HSP90-pp60v-src+heteroprotein+complex+formation+by+benzoquinone+ansamycins%3A+essential+role+for+stress+proteins+in+oncogenic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).</li>
<li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
<li>Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+sulfonamide+drugs+inhibit+ATPase+activity+of+heat+shock+protein+90%3A+investigation+by+docking+simulation+and+experimental+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+and+pharmacophore+mapping+of+halogenated+pyridinium+derivatives+on+heat+shock+protein+90%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+and+Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90.</a> Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elaborate+ligand-based+modeling+reveals+new+nanomolar+heat+shock+protein+90%CE%B1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+exploration+of+new+pyridinium-based+HSP90%CE%B1+inhibitors+tailored+to+thiamine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure.</a> Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+docking-based+comparative+intermolecular+contacts+analysis+to+validate+Hsp90%CE%B1+docking+studies+and+subsequent+in+silico+screening+for+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Modeling%22%5BJournal%5D)">Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors.</a> Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).</li>
<li>Dutta Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C4-dihydroxy+benzaldehyde+derived+Schiff+bases+as+small+molecule+Hsp90+inhibitors%3A+rational+identification+of+a+new+anticancer+lead%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead.</a> Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+malachite+green+assay+of+phosphate%3A+mechanism+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).</li>
<li>Gupta, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+docking+study%2C+synthesis+and+biological+evaluation+of+Mannich+bases+as+Hsp90+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+established+drugs+as+SARS-CoV-2+PLpro+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors.</a> Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).</li>
<li>Giri, A. K., Ianevski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+drug+discovery+targeting+the+cancer+cell-microenvironment+interactions+in+hematological+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).</li>
<li>Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahapatra%2C+DK+%22Advanced+Studies+in+Experimental+and+Clinical%22">Advanced Studies in Experimental and Clinical</a>. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).</li>
<li>Jaeger, A. M., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90%3A+enabler+of+cancer+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90: enabler of cancer adaptation.</a> Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).</li>
<li>Yang, S., Xiao, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+heat+shock+proteins+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis%2C+metabolism+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074(2021).</li>
<li>Mishra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Hsp90%CE%B2-selective+inhibitors+to+overcome+detriments+associated+with+pan-Hsp90+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).</li>
<li>Khandelwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+design+of+an+Hsp90beta+N-terminal+isoform-selective+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor.</a> Nature Communications. 9 (1), 425(2018).</li>
<li>Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+selective+are+Hsp90+inhibitors+for+cancer+cells+over+normal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells.</a> ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).</li>
<li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li>
<li>Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+design+and+development+strategies+for+finding+Hsp90+inhibitors+and+their+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases.</a> Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747(2021).</li>
<li>Howes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+polarization+assay+for+inhibitors+of+Hsp90%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90.</a> Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).</li>
<li>Opalińska, M., Jańska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA+proteases%3A+guardians+of+mitochondrial+function+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis.</a> Cells. 7 (10), 163(2018).</li>
<li>Ambrose, A. J., Chapman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+therapeutic+potential%2C+and+inhibition+of+Hsp70+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).</li>
<li>Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+region+in+the+N-terminus+of+Escherichia+coli+Lon+that+affects+ATPase%2C+substrate+translocation+and+proteolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity.</a> Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).</li>
</ol>

אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Hsp90 הוא יעד משמעותי לגילוי מולקולות תרופות אנטי-סרטניות חדשניות. מאז התבססה יכולת הטיפול התרופתי שלה בשנת 1994,10, 18 מולקולות הגיעו לניסויים קליניים. כיום, שבע מולקולות נמצאות בשלבים שונים של ניסויים קליניים, לבדן או בשילוב22. כל המולקולות הקטנות הללו הן מעכבי קשירת ATP N-terminal. האמצעים האחרים לעיכוב המלווה (מעכבי C-terminal, מעכבי תחום אמצעי) לא התקדמו מהר כמו מעכבי N-terminal. לפיכך, תרכובות מעכבי הקישור N-terminal ATP עדיין טומנות בחובן הבטחה להתקדמות למולקולה הנית...

חלבון הלם חום 90 (Hsp90) הוא מלווה מולקולרי השומר על יציבות החלבונים האחראים להתפתחות והתקדמות סרטן. בנוסף, חלבונים האחראים על התפתחות עמידות לחומרים אנטינאופלסטיים הם גם לקוחות של Hsp901. Hsp90 מתבטא יתר על המידה בכל סוגי התאים הסרטניים (>90% מהחלבונים התאיים), בהשוואה לתאים רגילים שבהם הוא עשוי להוות פחות מ-2% מכלל החלבונים. יתר על כן, Hsp90 של תאים סרטניים שוכן בקומפלקס עם מלווים משותפים, בעוד שבתא רגיל הוא נמצא בעיקר במצב חופשי, לא מורכב 2,3. בשנים האחרונות, מספר מעכבי Hsp90 הוכחו כבעלי השפעות סנוליטיות במחקרי in vitro ו-in vivo, שם הם שיפרו באופן משמעותי את תוחלת החיים של עכברים 4,5,6. כל הממצאים הנ"ל מאששים את העובדה שמעכבי Hsp90 יכולים להיות יעילים במספר סוגי סרטן, עם פחות תופעות לוואי וסיכויים מופחתים לפתח עמידות. פונקציית הליווי של Hsp90 מושגת על ידי קשירת ATP בתחום N-terminal של Hsp90 והידרוליזה שלו ל-ADP ולפוספט חופשי7. מולקולות קטנות שנקשרות באופן תחרותי לכיס קשירת ה-ATP של Hsp90 נמצאו כמדכאות בהצלחה את השפעת הליווי של החלבון. נכון להיום, זו נותרה האסטרטגיה הטובה ביותר עבור עיכוב Hsp90, אשר נתמך על ידי העובדה כי מעכבים כאלה הגיעו לניסויים קליניים8. אחד מהם, Pimitespib, אושר ביפן לטיפול בגידול סטרומה במערכת העיכול (GIST) ביוני 20229. זהו מעכב Hsp90 הראשון שאושר מאז הוקמה יכולת הטיפול התרופתי של המלווה בשנת 199410.
בדיקת מלכיט ירוק היא הליך פשוט, רגיש, מהיר וזול לאיתור פוספט אנאורגני, המתאים לאוטומציה ולסינון תפוקה גבוהה (HTS) של תרכובות כנגד היעד הרצוי11. הבדיקה שימשה בהצלחה לסינון מעכבי Hsp90 בתצורות מעבדה קטנות, כמו גם ב- HTS 12,13,14,15,16,17. הבדיקה משתמשת בשיטה קולורימטרית הקובעת את הפוספט האי-אורגני החופשי שנוצר עקב פעילות ATPase של Hsp90. הבסיס לכימות הזה הוא היווצרות קומפלקס פוספוהומוליבדט בין פוספט חופשי למוליבדן, אשר לאחר מכן מגיב עם ירוק מלכיט ליצירת צבע ירוק (איור 1). היווצרות צבע מהירה זו נמדדת על ספקטרופוטומטר, או על קורא לוחות, בין 600-660 ננומטר18,19.
בפרוטוקול הנוכחי מתואר ההליך לביצוע בדיקה ירוקה מלכיט עם שמרים Hsp90 וזיהוי עוקב של מעכבים נגד המלווה. מולקולת המוצר הטבעית, geldanamycin (GA), שבה נקבעה לראשונה יכולת התרופה של Hsp90, נלקחה כמעכב אותנטי10. HTS הפך לחלק בלתי נפרד מתוכנית גילוי התרופות הנוכחית, בשל זמינותן של מספר רב של מולקולות לבדיקה. טכניקה זו קיבלה משמעות רבה יותר בשנתיים האחרונות בגלל הצורך הדחוף בייעוד מחדש של תרופות לטיפול בזיהום Covid-1920,21. לכן, מוצג מתווה מפורט ל-HTS של מולקולות כנגד חלבון שמרים Hsp90 על ידי אימוץ שיטת הבדיקה הירוקה מלכיט.

<table><tbody><tr><td>1M תמיסת מגנזיום כלוריד במים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>63069-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>1M תמיסת אשלגן כלורי במים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>60142-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות צלחת</td><td>SPL מדעי החיים</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט דיסודיום מלח הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>Biomek FX מעבדה תחנת עבודה אוטומציה</td><td>בקמן קולטר</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>תרכובות 3-96</td><td>לא ישים</td> לא <td>ישים</td><td>שמרים מתויגים Histidine Hsp90 הושג מד"ר כריסוסטומוס פרודרומו, בית הספר למדעי החיים, אוניברסיטת סאסקס, בריטניה, וחלבון התבטא במכון KIST Gangneung למוצרים טבעיים. לא ניתן לחשוף פרטים עקב בעיות הפרת פטנטים.</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>גלדנאמיצין, 99% (HPLC), אבקה</td><td>AK Scientific, Inc.</td><td>V2064</td><td></td></tr><tr><td>Invitroge UltraPure DNase/RNase מים מזוקקים ללא DNase/RNase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת פוספט ירוק מלכיט &nbsp; ערכת בדיקה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK307-1KT</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרו-פלטות רב זיהוי סינרגיה HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>קורא ריבוי לוחות Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חיץ Trizma hydrochloride, pH7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93313-1L</td><td></td></tr><tr><td>שמרים Hsp90</td><td>לא</td><td>ישים לא ישים</td><td>בית הספר למדעי החיים, אוניברסיטת סאסקס, בריטניה וחלבון התבטא במכון KIST Gangneung למוצרים טבעיים. מספר רישוי ראשי: P02829</td></tr></tbody></table>

בדיקת מלכיט ירוק לגילוי מעכבי חלבון הלם חום 90

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

חלבון הלם חום 90 (Hsp90) הוא מטרה אנטי-סרטנית מבטיחה בגלל השפעתו הנלווית על חלבונים אונקוגניים מרובים. הפעילות של Hsp90 תלויה ביכולתו לבצע הידרוליזה של אדנוזין טריפוספט (ATP) לאדנוזין דיפוספט (ADP) ולפוספט חופשי. פעילות ATPase של Hsp90 קשורה לפונקציית הליווי שלו; ATP נקשר לתחום N-terminal של Hsp90, ושיבוש הקשירה שלו נמצא כאסטרטגיה המוצלחת ביותר בדיכוי פונקציית Hsp90. ניתן למדוד את פעילות ה-ATPase על ידי בדיקת מלכיט ירוק קולורימטרי, הקובעת את כמות הפוספט החופשי שנוצר על ידי הידרוליזה של ATP. כאן מתואר הליך לקביעת פעילות ATPase של שמרים Hsp90 באמצעות ערכת בדיקת פוספט ירוק מלכיט. יתר על כן, הוראות מפורטות לגילוי מעכבי Hsp90 על ידי נטילת geldanamycin כמעכב אותנטי מסופק. לבסוף, נדון היישום של פרוטוקול בדיקה זה באמצעות סינון בתפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות מעכבות כנגד שמרים Hsp90.

תוצאות הבדיקה מפורשות במונחים של ספיגה עקב ריכוז יוני פוספט חופשי. ספיגה על ידי פוספט חופשי עקב הידרוליזה ATP על ידי שמרים Hsp90 ב 620 ננומטר נחשב 100% פעילות ATPase, או אפס אחוז עיכוב חלבון. עיכוב החלבון מוביל להפסקת הידרוליזה של ATP (פחות פוספט חופשי). אשר באה לידי ביטוי במונחים של ירידה בספיגה ב 620 ננומטר.
תוצאות בדיקת מלכיט ירוק בקנה מידה מעבדתי הגרף הסטנדרטי של תקן הפוספט מתואר באיור 3. הפעילות של Hsp90 נמדדת במונחים של יכולתו הידרוליזה A...

פרוטוקול הבדיקה הירוק של מלכיט הוא שיטה פשוטה וחסכונית לגילוי מדכאי חלבון הלם חום 90 (Hsp90), כמו גם תרכובות מעכבות אחרות נגד אנזימים תלויי ATP.

Heat shock protein 90 (Hsp90) is a promising anticancer target because of its chaperoning effect on multiple oncogenic proteins. The activity of Hsp90 is ...

פרוטוקול זה יסייע בקביעת הפעילות של חלבוני ATPase על ידי מדידת הפוספט החופשי הנובע מהידרוליזה של ATP על ידי החלבונים. בדיקת מלכיט ירוק היא הליך פשוט, רגיש, מהיר וזול לאיתור פוספט אנאורגני. הוא מתאים לאוטומציה ולסינון בתפוקה גבוהה של תרכובות כנגד מטרתו.טכניקה זו תמלא תפקיד חשוב בגילוי מהיר של מעכבים נגד חלבון Hsp90, שהוא מטרה אנטי סרטנית חשובה. כדי להתחיל, פיפטה 40 מיקרוליטר של תקן פוספט מילימולרי אחד ב 960 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד כדי לקבל תמיסת פוספט 40 מיקרומולרית. הוסף פתרון זה בהתאם להוראות היצרן כדי ליצור דילול סדרתי של פוספט מ 0-עד 40-micromolar.לאחר מכן, השתמשו בשמונה מיקרוליטרים של שמרים Hsp90 לפעילות ATPase מדידה. הוסף מגיב ירוק מלכיט לבקרה הריקה ולבקרה החיובית, ובדוק את הפרש הצפיפות האופטית בין הבקרה הריקה לבקרה החיובית לאחר שהתוספת היא לפחות 0.5 וקטנה מ- 1. כדי להכין ATP, להעביר מיליגרם אחד של ATP לבקבוקון המכיל 453.39 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד כדי לקבל תמיסת מלאי ארבעה מילימולרי.הכינו את ה-ATP טרי, מכיוון שהוא יכול לבצע הידרוליזה ספונטנית לאורך זמן. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת מלאי ATP לכל באר כדי לתת ריכוז באר סופי של 0.2 מילימולר. הוסף ATP כמרכיב האחרון לתגובה באמצעות פיפטה רב ערוצית כך שכל התגובות יתחילו בו זמנית.לאחר מכן, להכין מלאי 10 מילימולרי של ge

malachite-green-assay-for-discovery-heat-shock-protein-90

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בפרוטוקול בשיטה זו כדי למדוד refolding חלבון תאיים לאחר הלם החום מתואר. שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד foldases כמו מלווים המולקולרית שלהם שיתוף גורמים או תרכובות מסוגל להשפיע על פעילותם. פעילות גחלילית בלוציפראז משמש ככתב למדוד refolding פעילות המלווה.

שב וקיפל תאיים Assay

אנו מציגים וריאציה של (immunoprecipitation כמותיים בשילוב עם מציאה) הגישה המהירה שהוצגה בעבר להבחין בין אמת ושקר אינטראקציות בין חלבונים. הגישה שלנו מבוססת...

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

בסרטון זה, אנו מדגימים את המבחן ההומוגני של הקרבה הזוהרת המוגברת – בדיקת קרבה מבוססת חרוזים. הוא משתמש בחרוזי קבלה ותורם בגודל הומוגני, משותקים עם שני חלבונים הנוטים לקיים אינטראקציה כדי לסנן מולקולות קטנות פוטנציאליות המעכבות אינטראקציות חלבון.

בדיקה הומוגנית של קרבה זוהרת מוגברת: בדיקת קרבה מבוססת חרוזים לסינון מולקולות קטנות המעכבות אינטראקציות חלבון-חלבון

אחד התנאים המאתגרים ביותר מתח כי אורגניזמים נתקלים במהלך חייהם כרוכה ההצטברות של חמצון. במהלך סטרס חמצוני, תאים בכבדות להסתמך על מלווים מולקולרית. כאן, אנו מציגים שיטות השתמשו כדי לחקור את מוסדר חמצון-חיזור צבירת נגד הפעילות, כמו גם כדי לעקוב אחר שינויים מבניים המסדירים את הפונקציה המלווה באמצעות HDX-MS.

הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

באמצעות שיטת הסריקה (NADH)-ביחד התאמה ATPase הותאמה הקרנה חצי תפוקה גבוהה של מולקולה קטנה רירן מעכבי. זה שיטת הקינטי מופעל בפורמט 384-היטב אימונולוגיה עם כמויות התגובה הכולל של רק 20 μl לכל טוב. הפלטפורמה צריכה להיות ישימה כמעט כל הפקת האנזים.

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

היכולת להעריך מעורבות היעד על ידי מעכבי מועמד בתאים שלמים היא קריטית לגילוי סמים. פרוטוקול זה מתאר 384 גם פורמט התא סלולרי תרמי shift assay כי אמין מזהה מעורבות היעד הסלולרי של מעכבים מיקוד SHP2 מסוג פראי או גרסאות oncogenic שלה.

הערכת מעורבות יעד סלולרי על ידי SHP2 (PTPN11) מעכבי פוספטאז

SAMHD1 הוא deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase עם תפקידים קריטיים בבריאות האדם ובמחלות. כאן אנו מציגים בדיקת פעילות רב-תכליתית של SAMHD1 מצומדת אנזימים, הפרוסה בפורמט מיקרו-צלחות של 384 בארות, המאפשרת הערכה של מולקולות קטנות ואנלוגים של נוקלאוטידים כסובסטרטים, מפעילים ומעכבים של SAMHD1.

בדיקת פעילות מצומדת אנזימים בתפוקה גבוהה לבדיקת אינטראקציה של מולקולות קטנות עם dNTPase SAMHD1

פרוטוקול זה מציג טכניקה לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות חרוזי תורם הקשורים גלוטתיון עם מלווים שותפים TPR-מוטיב מותך GST וחרוזים מקובלים יחד עם פפטיד שמקורו Hsp90. השתמשנו בטכניקה זו כדי לסנן מולקולות קטנות כדי לשבש Hsp90-FKBP51 או Hsp90-FKBP52 אינטראקציות וזיהינו מעכבי אינטראקציה Hsp90-FKBP51 חזקים וסלקטיביים.

מחקרים של אינטראקציות מלווה-Cochaperone באמצעות אסאי הומוגני מבוסס חרוזים

פרוטוקול זה מדגים את פעילות המלווה של חלבון הלם חום 70 (Hsp70). תאי E. coli dnaK756 משמשים כמודל לבדיקה מכיוון שהם מכילים Hsp70 ילידי ולקוי תפקודית, מה שהופך אותם רגישים ללחץ חום. המבוא ההטרולוגי של Hsp70 פונקציונלי מציל את חוסר הצמיחה של התאים.

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיית סקר פלואורומטרית המותאמת לזיהוי מעכבי מוצר טבעי/מולקולות קטנות של סינתזת חלבונים. הפרקטיות שלו הופכת אותה למתאימה הן להוראה לתואר ראשון בטכניקות גילוי תרופות והן ליישום בקמפיינים של כימיה רפואית.

פרוטוקול מבוסס פלואורסצנציה לסינון ראשוני של מעכבי סינתזת חלבונים ממקורות טבעיים

למדו את שיטת מלכיט ירוק לגילוי מעכבי חלבון הלם חום 90 בחלבוני ATPase. שיטה זו מאפשרת סינון רחב-היקף ואוטומציה לזיהוי מהיר של תרכובות מעכבות לטיפול בסרטן.

בדיקת מלכיט ירוק לגילוי מעכבי חלבון הלם חום 90

גלה סרטונים נוספים