ניתוח והדמיה של אוסטיאוציטים

משערים כי לחץ גזירה של זרימת נוזלים הוא ממריץ מכנו של אוסטיאוציטים. מכיוון שמדידה ישירה אינה אופציה, מודלים הנגזרים מתמונות קונפוקליות של אוסטיאוציטים הם כלי רב ערך לביצוע ניתוח חישובי של דינמיקת נוזלים כדי להעריך את הלחצים העצומים של זרימת הנוזלים על הממברנות הדנדריטיות של אוסטיאוציטים. חלק מהעבודה שנעשתה במעבדה שלנו תואמת את ההתפתחויות האחרונות בתחום שבו נעשה שימוש במורפולוגיה של לקונה אוסטיאוציטית בפועל, כולל פיתול וצפיפות הדנדריטים, יחד עם העצם והרשת הלאקונרית-קנאליקולרית על מנת לקבוע מספרית את זרימת הנוזל ואת המיקומים במבנה הדנדריטי של אוסטאוציטים שבהם הלחץ גבוה.

הטכנולוגיות הנוכחיות כוללות מודלים חישוביים שונים, כגון ניתוח אלמנטים סופיים, דינמיקת נוזלים חישובית, אינטראקציה עם מבנה זורם, מידול מבוסס תמונה, כולל רנטגן או מיקרוסקופ קונפוקלי למודלים תלת-ממדיים מדויקים ועל ידי מערכות בדיקה מכניות כדי לאמת את המודלים על ידי מדידת תגובות עצם כגון זנים בתנאי עומס בקרה. הממצאים שלנו מצביעים על כך שאובדן דנדריטים עקב הזדקנות או מחלת עצמות הוא גורם לכך שהעצמות נעשות פחות מגיבות לפעילות גופנית. חזינו כי אוסטיאוציטים מזהים עומסים מכניים באמצעות אזורי עקה גבוהים של זרימת נוזלים שהם דנדריטים.

ומתח גזירה של זרימת נוזלים מתואם למורפולוגיה לאקונרית, במיוחד שטח פנים. עם ביסוס פרוטוקול זה, אנו עובדים כעת על פרויקט NIH לחקר עקה של גזירת זרימת נוזלים בדנדריטים אוסטיאוציטים של עצמות עכברים משני גילאים ומינים שונים. מחקר זה יסייע לקבוע כיצד הזדקנות והבדלים בין המינים משפיעים על התמרה של מכנו בעצם עקב העמסה.

כדי להתחיל, לתקן את עצם הירך שנאסף מהעכבר בקור 4% paraformaldehyde במי מלח חוצצים פוספט במשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין. למחרת, שטפו את העצם ואת המלח החוצץ בפוספט והטמיעו אותו במהירות באקריליק פילמור מהיר. חותכים פרוסות רוחביות עבות של 300 מיקרומטר מעל הטרוכנטר השלישי.

בעזרת נייר זכוכית, מלטשים את חלקי העצם לעובי סופי של 90 עד 100 מיקרומטר. לאחר מכן שטפו את החלקים המלוטשים ב-70%95% ובאתנול 100% במשך חמש דקות כל אחד. הכתימו את החלקים ב-1% ב-1% אתנול למשך ארבע שעות בחושך עם רעד מתון.

לאחר מכן, לשטוף את החלקים ביסודיות 100% אתנול. וייבשו אותם באוויר למשך הלילה לפני שתניחו אותם בטיפת אמצעי הרכבה על מגלשת זכוכית. הרכיבו תלוש כיסוי על הדגימה.

במיקרוסקופ קונפוקלי הציבו לייזר של 488 ננומטר לעירור וחלון איסוף פליטות של 496 עד 596 ננומטר. ראשית, צלם תמונה בעוצמה נמוכה של כל קטע העצם באמצעות המטרה 5x. לאחר מכן צלם תמונות של שלושת אזורי העניין באמצעות המטרה 20x.

השתמש במטרה שמן עם מפתח צמצם מספרי של 100x 1.44 עם זום דיגיטלי של 1.7 וגודל צעד של 0.126 מיקרומטר כדי לאסוף ערימות Z מפורטות של מישורי Z של 400 Z ברזולוציה של 1024 על 1024 פיקסלים ורזולוציה של 0.089 מיקרומטר. למידול ממוחשב של אוסטיאוציטים של עכבר, פתח את תוכנת ImageJ לאחר ייבוא תמונות אוסף Z stack של עצם הירך של העכבר בתבנית TIFF, התאם את הסף בתפריט המקטעים כדי לשנות את מגבלות עוצמת הפיקסלים להכללה במסיכה. באמצעות פעולת מסיכת היבול, חתוך לקונה אחת עם הקנליקולי שלה כאזור העניין.

עטפו את הלקונה בקובייה דמיונית גדולה יותר עם אורכי צד של 21, 14 ו-19 מיקרומטר. בצע פעולת הגדלת אזור כדי לבחור את אזורי הפיקסלים המחוברים כדי ליצור רשת לאקונרית-תעלה אחידה או LCN. לאחר מכן, באמצעות פעולת החלק המחושב, להמיר את מסיכת lacunar-canalicular לתוך אובייקט.

הפחת את נפח LCN באמצעות פעולת ההחלקה לבניית האוסטיוציטים והקרומים הדנדריטיים. לאחר מכן יצא את האובייקטים. שלב שני משטחים של הממברנות הדנדריטיות LCN ואוסטיאוציטים למשטח אחד.

כעת, השתמש בפעולת remesh כדי ליצור מודל נפחי של החלל התעלה הלאקונרית. יצא את המודל כקובץ STL והתאם את קנה המידה של האובייקטים למיקרומטרים. בתוכנת עיבוד תלת-ממדית מבוססת תמונה, בחר את המודל הנפחי של המרחב הלאקונרי-קנליקולרי של העכבר כמודל הבסיס לבניית מודלים אוסטיאוציטים נפרדים.

בחרו סף נמוך יותר כדי להפחית את עוצמת האור של התמונה ולקבל לאקונה עם פחות קנאליקולי. לאחר מכן, לפתח מודלים אוסטיאוציטים עם עובי חלל lacunar-canalicular שונים או קוטר תעלת דנדריט. בנה מודלים גדולים או קטנים יותר של אוסטיאוציטים באמצעות פעולות עטיפה או החלקה בהתאמה.

כדי ליצור זרימה זורמת בתוכנת הסימולציה, ייבא את הגיאומטריות מבוססות התמונה הקונפוקלית שפותחה לתוכנת CFX. הגדר את מידות היחידה לננומטרים. לאחר מכן, לחץ על חיסור כדי להשיג גוף אחד של שטח קניקולרי לאקונרי.

לחץ לחיצה ימנית על הפאה שנוצרה והמיר אותה מפאות לתחום מוצק מבלי למזג פרצופים. לחץ על רשת ולבחור אלמנטים טטרהדרליים ליניאריים עם גודל אלמנט של 0.06 מיקרומטר. עדכנו את רשת השינוי בעזרת מחקר התכנסות רשת.

כעת, בחרו את פני השטח ובחרו את הקנליקולי בצד העליון של הקובייה הדמיונית כפתחי נוזל. באמצעות תיבה, בחר את canaliculi על חמשת הפאות האחרות כמו שקעי נוזל. לאחר מכן יצאו את רשת השינוי.

לאחר יצירת זרימה נוספת, ייבאו את רשת השינוי השוטפת לאזור ההתקנה של CFX. בעזרת האפשרות 'הוסף גבול', הגדירו שני תנאי גבול של כניסות ושקעים למשטחים. הפעל לחץ כניסת נוזל של 300 ואפס פסקל על הכניסות והשקעים בהתאמה.

התייחסו למשטחים הנותרים כאל קירות במצב מונע החלקה. מספריית החומרים, התייחסו לנוזל הלמינרי האינטרסטיציאלי כמים. הגדר את מקטעי העברת החום, הבעירה והקרינה התרמית על ללא.

בחר מערבולות כמאפיין הנוזל ב- LCN. לאחר מכן, הפעל את התוכנה באמצעות דיוק כפול והתחלה ישירה כסוג ההגשה. הוסף מיתאר חדש במקטע התוצאות של תוכנת CFD.

צור מתח גזירה של זרימת נוזל או מתאר FFSS על ידי בחירת גזירת הקיר על הממברנות הדנדריטיות של אוסטיאוציטים כמשתנה בתחום. לאחר מכן, הכנס קו מתאר מייעל מהירות בתוך תחום הלאקונרי-קנליקולרי החל מהמפרצונים. ממוצע ה-FFSS על אוסטיאוציטים וקרומים דנדריטיים במודל האוסטיאוציטים הצעיר היה 0.42 פסקל, שהיה גבוה משמעותית מ-0.13 פסקל במודל האוסטיאוציטים המיושנים.

FFSS גדל באוסטיאוציטים עם מרחב תעלה לאקונרי גדול יותר, כפי שניתן לראות במודל שבע ובמודל שמונה, כאשר מודל שמונה הציג את ה-FFSS הגבוה ביותר. ערכי ה-FFSS הנמוכים ביותר של 0.19 פסקל ו-0.13 פסקל נצפו במודל השני ובמודל הרביעי בהתאמה עם צפיפות התעלה הנמוכה ביותר. לא נצפה שינוי משמעותי ב-FFSS עם הגדלת קוטר הדנדריט כפי שניתן לראות במודלים חמש ושש.