Name: Concanavalin A מבוסס Sedimentation Assay למדידת קשירת המצע של פוספטאז גלוקני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: למדו שיטת שקיעה מבוססת Concanavalin A למדידת קשירת פוספטאזות גלוקן לסובסטרים שונים. השיטה מאפשרת זיהוי אינטראקציות חלבון-פחמימה בטווח מילימולרי ומאפיינת מוטנטים של SEX4.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי פרס הקרן הלאומית למדע MCB-2012074. המחברים מודים לד"ר קרייג וונדר קוי מהמחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת פלורידה על דיונים חשובים ותמיכה. המחברים מודים גם לד"ר מתיו ס. ג'נטרי מהמחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת פלורידה על תמיכתו. ברצוננו להודות לד"ר שרה לגלוואר, יו"ר התוכנית למדעי המוח במכללת סקידמור, שאפשרה לנו להשתמש בסורק הכתם בן הספרות C של LICOR עבור דימות כתמים מערביים.

1. הכנת חרוזי ConA-Sepharose
<ol><li>צור 250 מ"ל של מאגר מחייב המכיל 67 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 ו- 0.2 mM CaCl2. כוונן את רמת החומציות באמצעות תמיסת 1 M NaOH.</li>
	<li>פיפטה 250 μL של תרחיף חרוזי ConA-Sepharose לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. צנטריפוגה את התוכן ב 10,000 x גרם במשך 30 שניות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט. הערה: 250 μL של חרוזי ConA-Sepharose בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל נדרש עבור כל ריכוז עמילופקטין המשמש לבדיקה.</li>
	<li>הוסף 750 μL של חיץ הקישור לכל צינור המכיל 250 μL של חרוזי ConA-Sepharose. צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x גרם במשך 1 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant. חזור על שלב זה 2x כדי לוודא שהחרוזים נשטפים כראוי ומאוזנים עם מאגר הקשירה.</li>
</ol>2. הכנת פתרונות עמילופקטין
<ol><li>הפוך פתרון מלאי של 10 מ"ג / מ"ל עמילופקטין תפוחי אדמה. עמילופקטין אינו מסיס במים וניתן להמיס אותו בחום. כדי להמיס, להוסיף 0.1 גרם של עמילופקטין תפוחי אדמה ל 10 מ"ל של מים מזוקקים. מחממים את התרחיף באמבט מים ב 80 מעלות צלזיוס למשך שעה או עד שהפתרון כבר לא מעונן.</li>
	<li>אפשרו לתמיסה לחזור לטמפרטורת החדר (RT), עם מערבולות חוזרות ונשנות כדי למנוע היווצרות גושים.</li>
	<li>טיפול אלכוהול-אלקליין הוא שיטה חלופית למסיסים מצעי עמילופקטין. כדי להמיס בשיטה זו, בצע את השלבים הבאים.<ol><li>להשהות 0.5 גרם של מצע עמילופקטין ב 5 מ"ל של 20% אתנול ו 5 מ"ל של 2 M NaOH. ערבבו את התוכן במרץ במשך 15-20 דקות ב-RT.</li>
		<li>לאחר מכן, הוסף 10 מ"ל מים, והתאם את ה- pH של התמיסה ל -6.5 על ידי הוספת 2 M HCl. העלה את נפח התמיסה המתקבלת ל -50 מ"ל עם מים מזוקקים כדי ליצור תמיסת עמילופקטין 10 מ"ג / מ"ל.</li>
	</ol></li>
	<li>לדלל את תמיסת עמילופקטין מסיס 10 מ"ג / מ"ל כדי ליצור סדרה של 2 מ"ל של תמיסות עמילופקטין מדולל. לדוגמה, בצע חצי דילול של 10 מ"ג/מ"ל להכנת סדרה של ריכוזי עמילופקטין (5 מ"ג/מ"ל, 2.5 מ"ג/מ"ל, 1.25 מ"ג/מ"ל, 0.625 מ"ג/מ"ל, 0.3125 מ"ג/מ"ל, 0.156 מ"ג/מ"ל, 0.078 מ"ג/מ"ל, 0.039 מ"ג/מ"ל, 0.019 מ"ג/מ"ל ו-0 מ"ג/מ"ל).</li>
</ol>3. הכנת ConA-Sepharose: חרוזי עמילופקטין
<ol><li>הוסף 250 μL של כל תמיסת עמילופקטין מדוללת לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל המכילות 250 μL של חרוזי ConA-Sepharose שקולים מראש במאגר קשירה. מערבבים היטב את התכולה. תייגו את הצינורות עם ריכוז העמילופקטין המתאים.</li>
	<li>יש לדגור על התכולה על גלגל מסתובב בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות. הערה: אין שינוי בקומפלקס ConA-Sepharose:עמילופקטין לאורך זמן לאחר 20 דקות. זמן הדגירה של 30 דקות נבחר על ידי זמני דגירה משתנים מ-10 דקות עד שעה כדי להבטיח הגעה לשיווי משקל.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x גרם במשך 1 דקה. אספו את הסופרנאטנט בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל. שמור שברים סופרנטנטיים אלה כדי לבצע בדיקת גלוקוז D12 (הידרוליזה חומצית של עמילופקטין ואחריה קביעת UV של גלוקוז באמצעות בדיקה אנזימטית). שלב זה נחוץ כדי להבטיח שכל העמילופקטין קשור לחרוזים.</li>
	<li>הוסף 750 μL של חיץ קשירה לחרוזי ConA-Sepharose:amylopectin. צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x גרם במשך 1 דקה. השליכו את הסופרנאטנט כדי להסיר מולקולות עמילופקטין לא קשורות.</li>
	<li>חזור על שלב 3.4 כדי להבטיח שטיפה מספקת. כל צינור מכיל כעת חרוזי ConA-Sepharose הקשורים לכמויות משתנות של מצעי עמילופקטין.</li>
</ol>4. דגירה SEX4 עם ConA-Sepharose:חרוזי עמילופקטין
<ol><li>ערבבו 250 μL של ConA-Sepharose:חרוזי עמילופקטין עם 100 μL של מאגר הקישור הכולל 10 מיקרוגרם של חלבון SEX4, 10 mM dithiothreitol (DTT), וקוקטייל מעכב פרוטאז 10 μM (PIC). שים לב שהנפח הכולל בכל צינור הוא 350 μL. הערה: קוקטייל מעכב פרוטאז מתווסף כאמצעי זהירות כדי למנוע השפלה מיותרת של SEX4. זהו צעד אופציונלי. בבדיקה זו, חלבון רקומביננטי Arabidopsis thaliana SEX4 (AtSEX4) משמש. החלבון המטוהר מכיל תג היסטידין N-terminal הדרוש לזיהוי החלבון באמצעות כימילומינסנציה. מידע מפורט על טיהור פוספטאז גלוקן מתואר בפרסומים קודמים14,20,24.</li>
	<li>לדגור על החלבון ו- ConA-Sepharose:תרחיף חרוזי עמילופקטין ב 4 ° C למשך 45 דקות עם סיבוב עדין. הערה: זמן הדגירה של 45 דקות נבחר כדי להבטיח הגעה לשיווי משקל עבור המתחם.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x גרם במשך 1 דקה. פיפטה 50 μL של supernatant בזהירות באמצעות קצה העמסת ג'ל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל. הוסף 20 μL של צבע 4x SDS-PAGE ו 10 μL של מים לכל צינור המכיל 50 μL של שברים supernatant שנאספו. חממו את הדגימות בטמפרטורה של 95°C למשך 10 דקות. שמור דוגמאות אלה להפעלת ג'לים SDS-PAGE. ודא של-10 צינורות חדשים המסומנים כ"סופרנאטנט (S)" יש את ריכוזי המצע המתאימים.</li>
	<li>הוסף 750 μL של חיץ הקישור ל- ConA-Sepharose:amylopectin: SEX4 חרוזים כדי להסיר כל חלבון לא קשור מהחרוזים. צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x גרם במשך 1 דקה. חזור על שלב זה פעם נוספת כדי להבטיח כביסה נאותה. השליכו את הסופרנטנט.</li>
	<li>הוסף 20 μL של צבע 4x SDS-PAGE ו 80 μL של מים מזוקקים לתוך צינורות המכילים שטף ConA-Sepharose:amylopectin:SEX4 חרוזים. חממו את הדגימות בטמפרטורה של 95°C למשך 10 דקות ואת הצנטריפוגה בטמפרטורה של 10,000 x g למשך דקה אחת.</li>
	<li>השליכו את הגלולה ושמרו את הסופרנאטנט להפעלת ג'ל SDS-PAGE. פיפטה 80 μL של supernatant לתוך צינורות חדשים ולתייג אותם כמו "גלולה (P)".</li>
</ol>5. הפעלת ג'לים SDS-PAGE
<ol><li>טען 40 μL של דגימות חלבון לא קשורות (שנעשו בשלב 2.3, מסומן S) לתוך בארות ג'ל פוליאקרילאמיד precast 4%-12% מריכוז המצע הנמוך ביותר לגבוה ביותר, אך שמור על הנתיב הראשון פנוי כדי לטעון את סמן המשקל המולקולרי של החלבון. השתמש בג'ל שני כדי לטעון 10 דגימות חלבון קשורות שנעשו בשלב 2.5 (מסומן כ- P).</li>
	<li>הוסף מאגר ריצה 1x SDS-PAGE טרי שהוכן לשני תאי המנגנון. יש להפעיל את הג'ל במתח של 150 וולט למשך 35 דקות או עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל.</li>
	<li>מוציאים את ג'ל הריצה מהמכשיר ומסירים את הספייסרים וצלחות הזכוכית. השתמש בג'ל המופרד כדי לבצע ניתוח כתם מערבי.</li>
</ol>6. כתם מערבי לזיהוי כימילומינסנציה14,15
הערה: ניתן לשנות/להתאים שיטה זו בקלות בהתאם לציוד ההדבקה המערבי שיש למשתמשים במעבדות שלהם.
<ol><li>צור 1 ליטר של מאגר העברה המכיל 5.8 גרם בסיס טריס, 2.9 גרם גליצין, 0.37 גרם SDS ו-200 מ"ל מתנול.</li>
	<li>העבירו את החלבונים המופרדים בגודל מג'ל הפוליאקרילאמיד לקרום ניטרוצלולוז. הרכיבו בקצרה את הספוגים, ניירות הסינון, הג'ל וקרום הניטרוצלולוז על פי פרוטוקול העברה מערבי14,15. הפעל ב 70 V במשך 1 שעות.</li>
	<li>כדי למנוע קשירת חלבונים לא ספציפית, דגרו על קרום הניטרוצלולוז המכיל את תמיסת החלבון של אלבומין בסרום בקר (BSA) 1%-5% או חלבון חלב במאגר TBST של 50 מ"ל (20 mM Tris [pH 7.5], 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20) למשך שעה אחת. שטפו את הממברנה 3x באמצעות מאגר TBST כדי להסיר כל פתרון חסימה לא מאוגד.</li>
	<li>יש לדגור על הממברנה עם נוגדן פרוקסידז (HRP) ספציפי לחלבון המתויג על ידי חזרת למשך שעה אחת. שטפו את הממברנה 3x במאגר TBST כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. יש להשתמש בדילול נוגדנים ביחס של 1:2,000 ל-TBST לשחזור ורגישות מיטביים.</li>
	<li>הנוגדן המקושר לאנזים HRP נקשר באופן ספציפי לתג ההיסטידין של חלבון SEX4, אשר מניב רצועה בנוכחות ריאגנטים כימילומינסננציים. עבור הדמיה דיגיטלית, לעשות פתרון של חלקים שווים של תמיסות מצע chemiluminescent (750 μL כל אחד) בצינור 1.5 מ"ל. לדגור על הממברנה לפחות 5 דקות בתמיסה.</li>
	<li>הניחו את חלבון הממברנה על סורק הכתם והריצו את תוכנת הרכישה כדי לכמת את החלבון הן בשבר הכדורי והן בשבר הסופרנאטנטי.</li>
</ol>7. ניתוח נתונים
<ol><li>בצע את מדידות האות הכמותיות באמצעות תוכנת הרכישה עם סורק הכתם. נרמלו את כל המדידות הכמותיות בשברי הסופרנאטנט והגלולה לסך החלבון הטעון. הערה: התוכנה מאפשרת לכמת את העוצמה של כל רצועת חלבון בשברים supernatant ו pellet.</li>
	<li>בניסוי הקישור הרווי, שרטט את אחוז ריכוז החלבון לעומת ריכוז העמילופקטין (amylopectin). התאם את הנתונים ל- Y = Bmax x X/(K D + X), באמצעות תוכנת ניתוח נתונים לחישוב KD. הערה: Bmax הוא הקישור הספציפי המקסימלי, ציר Y הוא אחוז החלבון הקשורים, ציר X הוא ריכוז העמילופקטין .</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64700/64700fig01.jpg"> איור 1: סקירה כללית של זרימת העבודה של בדיקת שיקוע ConA-Sepharose. (A) הכנת חרוזי ConA-Sepharose. (B) דגירה עם מצע עמילופקטין. (C) דגירה עם חלבון SEX4. (D) הפרדה של שברי חלבונים קשורים ולא קשורים באמצעות צנטריפוגה. (E) הפרדת חלבון באמצעות SDS-PAGE. (F) ניתוח כתם מערבי. (G) זיהוי כימילומינסנציה של חלבון SEX4 המתויג שלו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64700/64700fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<ol><li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li>
<li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li>
<li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laforin%2C+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li>
<li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138(2009).</li>
<li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li>
<li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li>
<li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+phosphatase%2C+LSF1%2C+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li>
<li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+For+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li>
<li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan%2C+water+dikinase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li>
<li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laforin+is+a+glycogen+phosphatase%2C+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li>
<li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li>
<li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li>
<li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li>
<li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li>
<li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li>
<li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li>
<li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li>
<li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch%3A+A+flexible%2C+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li>
<li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorus+in+rice+and+other+starches%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Foods+World%22%5BJournal%5D)">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li>
<li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li>
<li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+the+53%2C000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li>
<li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53%2C000+dalton+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li>
<li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li>
<li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li>
<li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+%CE%B1-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Plant α-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li>
<li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li>
<li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

מחקר זה מדגים את הפיתוח המוצלח של בדיקת שיקוע חוץ גופית חדשנית המאפשרת לקבוע את הזיקה הקושרת של אינטראקציות פוספטאז גלוקן-גלוקן. תכנון הבדיקה מנצל את הקישור הספציפי של לקטין ConA לגלוקנים באמצעות שאריות הידרוקסיל של גלוקוז כדי ללכוד בעקיפין מצעי פחמימות מסיסים על חרוזי ספארוז. זה מאפשר הפרדה של שברי חלבון קשורים ולא קשורים באמצעות צנטריפוגה וקביעת זיקה קשירה של מצעי גלוקן מסיסים ופוספטזות גלוקן. כל הפוספטזות הגלוקניות שנבדקו נמצאו כקשורות באופן ספציפי לעמילופקטין, ללא קשירה ניתנת לזיהוי לחרוזי ...

פוספטזות גלוקניות שייכות לתת-משפחה מגוונת מבחינה תפקודית של פוספטזות ספציפיות כפולה (DSPs) בתוך משפחת העל של החלבון טירוזין פוספטאז (PTP)1. הם נמצאו ברוב צורות החיים, כולל אורגניזמים פוטוסינתטיים שונים מאוד, בני אדם, בעלי חוליות, וכמה חסרי חוליות ופרוטיסטים 2,3,4. צמחים מכילים שלושה פוספטזים גלוקניים ידועים: עודפי עמילן4 (SEX4), כמו מין ארבע1 (LSF1), וכמו מין ארבע2 (LSF2)5,6,7. צמחים חסרי פוספטאז גלוקני מציגים שיעורים מופחתים של פירוק עמילן חולף והצטברות של עמילן בעלים 8,9. Laforin הוא החבר המייסד של משפחת phosphatase גלוקן כי dephosphorylates גליקוגן בחולייתנים ובני אדם 3,10. המוטציות של לאפורין גורמות למחלת לפורה נוירודגנרטיבית, צורה אוטוזומלית רצסיבית קטלנית של אפילפסיה11. פוספטזות גלוקן נחוצות למטבוליזם של גליקוגן ועמילן, והתגלו כאנזימים חשובים לוויסות תכולת העמילן בצמחים ולטיפול במחלת לפורה ניוונית12,13. מחקרי קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן שנערכו לאחרונה על פוספטזות גלוקניות עם מצעי גלוקן מודל שפכו אור על קשירת המצע והמנגנון הקטליטי של זרחן גלוקני14,15,16,17. עם זאת, ההבנה הנוכחית של האופן שבו פוספטזים גלוקניים נקשרים למצעים הפיזיולוגיים שלהם אינה שלמה.
עמילן הוא פולימר בלתי מסיס של גלוקוז העשוי מ-80%-90% עמילופקטין ו-10%-20% עמילוז18. המצע לפוספטזות גלוקן צמחיות הוא מולקולות פחמימות זרחניות, כגון גרגרי גליקוגן ועמילן. שאריות הגלוקוזיל הזרחניות נמצאות ביחס שאריות פוספט:גלוקוזיל של 1:600. מעניין, פוספטים נמצאים רק על מולקולות עמילופקטין19. הצמח העיקרי גלוקן phosphatase SEX4 פועל על גרגיר עמילן כדי dephosphorylate עמילופקטין מולקולות. המבנה הגבישי של קרני רנטגן של SEX4 בשילוב עם מחקרי מוטגנזה מונחי מבנה הדגימו את ייחודיות המצע הייחודי של SEX4 עבור מיקומים שונים בתוך מבנה גלוקן15. לאחרונה הראינו כי ניתן לצפות בפעילות הרלוונטית ביולוגית של SEX4 רק כאשר פועלים על מצעי העמילופקטין המסיסים שלו20. עם זאת, הבנת אינטראקציות גלוקן-SEX4 הוכחה כקשה בשל המורכבות המבנית של המצע, ספציפיות קישור רחבה יותר וזיקות קישור נמוכות בין החלבון למצעים שלו. בעיות אלה פגעו ביכולת להשתמש בשיטות הנפוצות באינטראקציות חלבון-ליגנד, כגון קלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC), ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ובדיקות מבוססות אנזימים מקושרים לאימונוסורבנט (ELISA).
באופן מעניין, חלק גדול מההבנה שלנו של אינטראקציות בין פחמימות לחלבונים הגיע ממחקר של לקטינים. Concanavalin A (ConA) היא משפחת קטניות לקטין של חלבונים שהופקו במקור משעועית הג'ק. ConA קושר פחמימות עם ספציפיות גבוהה, וזה יתרון לשימוש בו ביישומי מיקוד סמים ומשלוח. הקישור של ConA למגוון מצעים המכילים α-D-מנוסיל ו-α-D-גלוקוזיל לא מפחיתים נחקר בהרחבה19,20. חרוזי ספרוז הקשורים ל- ConA זמינים באופן מסחרי משמשים בדרך כלל לטיהור גליקופרוטאינים וגליקוליפידים21. ConA נקשר לגלוקנים אלה באמצעות קבוצות הידרוקסיל C3, C4 ו-C6 של שאריות הגלוקוז. חרוזי ConA-Sepharose שימשו בהצלחה גם למדידת הקישור של אינטראקציות גליקוגן-חלבון ועמילן-חלבון22,23. במחקר זה השתמשנו בחרוזי ConA-Sepharose כדי לפתח בדיקת קישור למדידת תכונות הקישור של אינטראקציות גלוקן פוספטאז-עמילופקטין.
בעבר, נעשה שימוש בבדיקת שיקוע מבוססת ConA כדי להעריך את יכולת הקישור של מצע גלוקן פוספטאז 14,20,24. במחקר זה, אותה אסטרטגיה שימשה לפיתוח שיטה חדשנית לקביעת הזיקה הקושרת של אינטראקציות גלוקן-גלוקן פוספטאז ופחמימות. לשיטה זו יש גם יתרון בחקירת אינטראקציות שונות של פחמימות-חלבונים מסיסים.

<table><tbody><tr><td>6x-נוגדן חד שבטי His Tag (HIS. H8), HRP</td><td>Therm Fisher Scientific</td><td>MA1-21315-HRP</td><td></td></tr><tr><td>Biorad ג'ל אלקטרופורזה וערכת כתמים מערביים</td><td>Biorad&nbsp;</td><td></td><td></td>1703930</tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>208291</td><td></td></tr><tr><td>סורק כתמים C ספרתי</td><td>LICOR</td><td>3600-00</td><td>סורק כתמים</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז שלם</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A-sepharose חרוזים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9017</td><td>מוצר זה מכיל&nbsp; במאגר אצטט 0.1 M, pH 6, המכיל 1 M NaCl, 1 מ"מ CaCl2, 1 mM MnCl2, ו-1 mM MgCl2 ב-20% אתנול&nbsp;</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>אפנדורף&nbsp;</td><td>5425R</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>פישר מדעי</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad פריזמה 8.0 תוכנה</td><td>GraphPad&nbsp;</td><td>גרסה 8.0</td><td>תוכנה לניתוח נתונים&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8651</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LICOR</td><td>3600-501</td><td>תוכנת רכישה</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>פישר Scientific</td><td>PI28312</td><td></td></tr><tr><td>תפוחי אדמה עמילופקטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A8515</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל SDSPAGE טרומי</td><td>Genscript</td><td>M00653S</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP1TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Westernsure מצע כימילומינסנציה פרימיום&nbsp;</td><td>לי-קור</td><td>&nbsp; 926-95000</td><td></td></tr></tbody></table>

concanavalin a מבוסס sedimentation assay למדידת קשירת המצע של פוספטאז גלוקני

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

פוספטזות גלוקניות שייכות למשפחה הגדולה יותר של פוספטזות בעלות סגוליות כפולה (DSP) אשר מנטרלות מצעי גלוקן, כגון גליקוגן בבעלי חיים ועמילן בצמחים. המבנים הגבישיים של פוספטאז גלוקן עם מצעי גלוקן מודל חושפים ממשקים קושרי גלוקן נפרדים העשויים מתחומי DSP וקשירת פחמימות. עם זאת, מדידות כמותיות של אינטראקציות גלוקן-גלוקן פוספטאז עם מצעים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית הן בסיסיות להבנה הביולוגית של משפחת האנזימים גלוקן פוספטאז ולוויסות חילוף החומרים של אנרגיה. כתב יד זה מדווח על בדיקת שיקוע חוץ גופית מבוססת Concanavalin A (ConA) שנועדה לזהות את זיקת קשירת המצע של פוספטזות גלוקניות כנגד מצעים גלוקניים שונים. כהוכחת היתכנות, נקבע קבוע הדיסוציאציה (KD) של גלוקן פוספטאז Arabidopsis thaliana עמילן עודף4 (SEX4) ועמילופקטין נקבע. האפיון של מוטנטים SEX4 וחברים אחרים במשפחת האנזימים גלוקן פוספטאז מדגים עוד יותר את התועלת של בדיקה זו כדי להעריך את הקישור הדיפרנציאלי של אינטראקציות חלבון-פחמימות. נתונים אלה מדגימים את התאמתו של מחקר זה לאפיון מגוון רחב של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם עמילן וגליקוגן.

אחד המאפיינים העיקריים של משפחת החלבונים גלוקן פוספטאז הוא יכולתם להיקשר למצעים גלוקניים. ראשית, יכולת הקישור של SEX4 לחרוזי ConA-Sepharose:amylopectin נותחה באמצעות SDS-PAGE (איור 2A). אלבומין בסרום בקר (BSA) שימש כבקרה שלילית לזיהוי כל קשירה לא ספציפית של חלבונים לחרוזי ConA-Sepharose:amylopectin. ניתוח SDS-PAGE של חלבונים הראה נוכחות של חלבון SEX4 בחלק הכדורי ו- BSA בחלק הסופרנאטנטי. W278A, מוטנט SEX4 ידוע עם יכולת קשירה גלוקנית מופחתת משמעותית, נכלל גם הוא בבדיקה. מוטנט W278A הופיע בחלק ...

שיטה זו מתארת בדיקת שיקוע חוץ גופית מבוססת לקטין כדי לכמת את זיקת הקישור של פוספטאז גלוקן ועמילופקטין. בדיקת שקיעה משותפת זו אמינה למדידת קשירת מצע גלוקן פוספטאז וניתן ליישם אותה על מצעים גלוקניים מסיסים שונים.

Concanavalin A מבוסס Sedimentation Assay למדידת קשירת המצע של פוספטאז גלוקני

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

בדיקת שיקוע חוץ גופית מבוססת A זו של concanavalin נועדה למדוד זיקה קשירה של פוספטזות גלוקניות כנגד מצעי STA שונים. המידע שאנו מקבלים משיטה זו הוא בסיסי להבנתנו את משפחת האנזימים גלוקן פוספטאז. אינטראקציות חלבון פחמימות הן חלשות יחסית, ולכן השיטות הנוכחיות אינן יכולות לזהות אינטראקציות גלוקן פוספטאז וגלוקן.בדיקת הקוסדמנטציה מבוססת הלקטין שלנו יכולה לזהות זיקה קושרת בטווח המילימולרי. האפיון של מוטנטים SEX4 כמו גם חברים אחרים במשפחת האנזימים גלוקן פוספטאז מדגים את היכולת של בדיקה זו לכמת אינטראקציות פחמימות חלבוניות. אחד החלקים המאתגרים ביותר בבדיקה הוא לייעל את טווח הריכוז של המצע.אנו ממליצים להתחיל עם טווח רחב יותר כדי לקבל מושג ולאחר מכן לצמצם לטווח ספציפי. כדי להתחיל, פיפטה 250 מיקרוליטר של חרוזי ConA-sepharose תרחיף לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את התוכן ב 10, 000 G במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר השלכת הסופרנטנט, הוסף 750 מיקרוליטר של חיץ הקישור לכל צינור המכיל 250 מיקרוליטר של חרוזי ConA-sepharose. צנטריפוגות את הצינורות ב 10, 000 G במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. לאחר מכן, להכין דילולים כפולים של פתרון עמילופקטין מסיס לעשות סדרה של שני מיליליטר פתרונות עמילופקטין מדולל.כדי להכין את חרוזי העמילופקטין ConA-sepharose, הוסף 250 מיקרוליטר של כל תמיסת עמילופקטין מדוללת לצינורות המכילים 250 מיקרוליטר של חרוזי ConA-sepharose מאוזן מראש ומאגר קשירה. מערבבים היטב את התוכן ותייגו את הצינורות עם ריכוז העמילופקטין המתאים. לדגור על תוכן הצינור על גלגל מסתובב בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות וצנטריפוגה את הצינורות ב 10, 000 G למשך דקה אחת.ערבבו 250 מיקרוליטר של חרוזי עמילופקטין ConA-sepharose עם 100 מיקרוליטר של חיץ הקישור המכיל 10 מיקרוגרם של עודפי עמילן ארבעה, או חלבון SEX4, 10 מילימולר של dithiothreitol, ו 10 מיקרומולר של קוקטייל מעכב פרוטאז. דוגרים על התוכן בארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות בסיבוב עדין. ואז צנטריפוגה את הצינורות ב 10, 000 G במשך דקה אחת בזהירות פיפטה 50 מיקרוליטר של supernatant לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר.הוסף 20 מיקרוליטר של צבע דף 4X SDS ו -10 מיקרוליטר של מים מזוקקים לכל צינור המכיל 50 מיקרוליטר של שברי supernatant שנאספו ותייג אותם כ- S.באופן דומה, הוסף 20 מיקרוליטר של צבע דף 4X SDS ו- 80 מיקרוליטר של מים מזוקקים לצינורות המכילים חרוזי ConA-sepharose amylopectin SEX4 שטופים. לאחר הוספת צבע ומים, מחממים את כל הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ברגע שחרוזי עמילופקטין SEX4 של ConA-sepharose עוברים צנטריפוגה של 10, 000 גרם למשך דקה אחת, שמרו את הסופרנאטנט ותייגו אותו כ-P.Load 40 מיקרוליטר של דגימות החלבון הלא מאוגדות המסומנות כ-S לבארות ג'ל פוליאקרילאמיד פריקאסט של 4 עד 12% מריכוז המצע הנמוך ביותר לגבוה ביותר, תוך שמירת הנתיב הראשון לסמן משקל מולקולרי חלבוני.השתמש בג'ל שני כדי לטעון את דגימות החלבון הקשורות לגלוקן המסומנות P.Add דף SDS טרי מוכן חיץ ריצה לשני התאים של המכשיר ולהפעיל את הג'ל ב 150 וולט במשך 35 דקות או עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל. לאחר מכן קח את קלטת הג'ל מהמנגנון והסר את הספייסרים וצלחות הזכוכית כדי להפריד את הג'ל לניתוח כתמים מערביים. הפוך ליטר אחד של מאגר העברה המכיל 5.8 גרם של בסיס tris, 2.9 גרם של גליצין, 0.37 גרם של SDS, ו 200 מיליליטר של מתנול.כדי להעביר את החלבונים המופרדים בגודל מג'ל הפוליאקרילאמיד לקרום ניטרוצלולוז, הרכיבו את הספוגים, ניירות הסינון, הג'ל וקרום הניטרוצלולוז בהתאם לפרוטוקול ההעברה המערבי ופעלו במתח של 70 וולט למשך שעה. לאחר הפעלת הג'ל, יש לדגור על קרום הניטרוצלולוז בתמיסת חלבון של אלבומין בסרום בקר אחד עד 5% או חלבון חלב במאגר TBST של 50 מיליליטר למשך שעה אחת כדי למנוע קשירת חלבון לא ספציפית. שטפו את הממברנה שלוש פעמים באמצעות מאגר TBST כדי להסיר כל תמיסת חסימה לא מאוגדת.לאחר מכן, לדגור על הממברנה במשך שעה אחת עם נוגדן מדולל חזרת peroxidase מקושר ספציפי עבור חלבון מתויג היסטידין. לאחר מכן שטפו את הממברנה שלוש פעמים במאגר TBST כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. עבור הדמיה דיגיטלית, לעשות פתרון של חלקים שווים של פתרונות מצע chemiluminescent, 750 מיקרוליטר כל אחד בצינור 1.5 מיליליטר, לדגור את הממברנה לפחות חמש דקות בתמיסה.הניחו את צד חלבון הממברנה על סורק הכתם והריצו את תוכנת הרכישה כדי לכמת את החלבון הן בשבר הכדורי והן בשבר הסופרנאטנטי. כדי להשיג את הנתונים, התחל את מדידות האות הכמותיות באמצעות תוכנת הרכישה עם סורק הכתם. נרמלו את כל המדידות הכמותיות בשברי הסופרנאטנט והגלולה לסך החלבון הטעון.בניסוי הקישור הרווי, התווה את אחוז החלבון הקשור לעומת ריכוז העמילופקטין והתאים את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח נתונים לחישוב קבוע הדיסוציאציה, Kd.יכולת הקישור של SEX4 לחרוזי עמילופקטין ConA-sepharose נותחה באמצעות דף SDS. נצפתה נוכחות של חלבון SEX4 בחלק הכדורי ואלבומין בסרום בקר בחלק הסופרנאטנטי. W278A, מוטנט SEX4 ידוע עם יכולת קשירה גלוקנית מופחתת באופן משמעותי, הופיע בחלק הסופרנאטנטי, מה שמצביע על התועלת והספציפיות של בדיקה זו.ניתוח הכתמים המערבי גילה עלייה משמעותית בזיהוי SEX4 והשיטה ספציפית לאיתור פוספטים גלוקניים עם תג היסטידין סופי. בדיקת השקיעה נבדקה בשלושה ריכוזי SEX4 שונים. בעוד ששני מיקרוגרם של SEX4 מספיקים כדי להמחיש באמצעות זיהוי כימילומינסנציה, שימוש בחמישה או 10 מיקרוגרם של SEX4 מאפשר זיהוי מדויק יותר.כמו כן, נצפתה קשירת SEX4 מוגברת עם ריכוז עמילופקטין מוגבר. נקבעת זיקת הקישור של עמילופקטין וחלבון מסוג SEX4 פראי בריכוזים שונים, ואחוז הנתונים הקשורים לחלבון למודל הקישור הספציפי של אתר אחד נתן Kd של כ-1.03 מיליגרם למיליליטר. נבדקה תחולתה של שיטה זו למדידת קשירת לפורין, LSF2, תירס SEX4 ותפוח אדמה SEX4 כנגד עמילופקטין תפוחי אדמה.התוצאות הראו כי החלבונים שנבדקו מגידולים בעלי חשיבות אגרונומית קשורים באופן דיפרנציאלי גם לעמילופקטין. חשוב לזכור את הנורמליזציה של כל המדידות הכמותיות בשברים הכדוריים והסופרנטנטיים לסך כל החלבון הטעון. כדי להבטיח שכל העמילופקטין קשור לחרוזים, שמור את שברי הסופרנאטנט כדי לבצע את בדיקת הגלוקוז העמוק מאוחר יותר.גלוקן פוספטאז משמש מנגנונים נפרדים כדי לקשור, לאתר, dephosphorylate פחמימות. שיטה זו מאפשרת לחקור את הקישור של פוספטאז גלוקני לתחומים מבניים שונים בתוך קומפלקסים פולימריים גדולים לדפוספורילציה ספציפית למיקום.

concanavalin-based-sedimentation-assay-to-measure-substrate-binding

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מתארים עלות נמוכה, גבוה שיטת התפוקה למסך לפעילות endoglucanase פטרייתי...

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

צמחי טבק ששימשו להפקת cellulase פטרייתי, TrCel5A, באמצעות מערכת ביטוי חולפת. הביטוי יכול להיות במעקב באמצעות חלבון היתוך ניאון, ופעילות החלבון התאפיינה הודעה ביטוי.

ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ<em&gt; Reesei Trichoderma</em&gt; בצמחים טבק

פלואורימטריית סריקה דיפרנציאלית היא שיטה בשימוש נרחב לסינון ספריות של מולקולות קטנות לאינטראקציות עם חלבונים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה להרחבת ניתוחים אלה כדי לספק אומדן של קבוע הדיסוציאציה בין מולקולה קטנה לשותף החלבון שלה.

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

מתואר מבחן תפוקה גבוהה לבדיקת אנזימים. ערכת בדיקה מוכנה לשימוש מרובה זו מורכבת ממצעי Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) שנבחרו מראש ומצעי Chromogenic B iomass (ICB) מורכביםI בלתי מסיסים. אנזימי המטרה הם אנדו-אנזימים ופרוטאזות מפרקים רב-סוכרים.

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

זיהומי ביופילם מראים סבילות גבוהה לכימותרפיה. אין בדיקה אחת שתופסת את המורכבות של ביופילמים. במקום זאת, יש צורך בבדיקות משלימות. אנו מציגים פלטפורמת סינון (שפותחה עבור S. aureus) המשלבת מבחני כדאיות, ביומסה ומטריצת ביופילם. זה מאפשר גילוי תרופות אנטי-ביופילם, כולל הערכה של השפעות כימותרפיות ארוכות טווח.

פלטפורמה של מבחנים אנטי biofilm המתאים לחקירת ספריות תרכובת טבעיות

כאן, אנו מתארים שיטה לטיהור מתויג היסטידין pyrophosphokinase אנזימים וניצול כרומטוגרפיה שכבה דקה של סובסטרטים radiolabelled ומוצרים כדי assay עבור פעילות אנזימטי בתוך חוץ גופית. וזמינותו פעילות האנזים ישימה בהרחבה על כל קינאז, נוקלאוטיד cyclase או התגובה פוספור-העברת מנגנון אשר כולל נוקלאוטיד טריפוספט הידרוליזה.

ב חוץ גופית Assay פעילות עבור ppGpp (p) המעביר מ Clostridium difficile וטיהור

מוצג כאן היא שיטה פשוטה למדוד פעילות chitinase בנוזלים ביולוגיים כגון שאיפה ברונבשיים או סרום.

מדידת פעילות השינואז בדגימות ביולוגיות

הפעולה הרדיאלית הרדיאלית של Ligand Assay (DRaCALA) יכולה לשמש לזיהוי חלבונים קטנים מחייבים ליגנד של אורגניזם באמצעות ספריית ORFeome.

זיהוי החלבונים המחייבים של ליגנדים קטנים עם הפעולה הרדיאלית הרדיאלית הדיפרנציאלית של ליגנד אסאי (DRaCALA)

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליכים המשמשים לחקר ואפיון אנזימים הקשורים לדופן התא, בעיקר β-1,3-גלוקנה ופרוקסידז, בצמחי חיטה. רמות הפעילות שלהם עולות במהלך אינטראקציה חיטה-RWA והם מעורבים בתגובת ההגנה של הצמח באמצעות חיזוק דופן התא, אשר מרתיע הזנת כנימות.

הבהרת #946;-1,3-גלוקנאז ופרוקסידז תכונות פיסיקוכימיות של מנגנון ההגנה על דופן תא החיטה מפני התפשטות Diuraphis noxia

אנו מדווחים ומדגימים בדיקת קשירת ניטרוצלולוז אופטימלית שניתן להשתמש בה כדי לכמת זרחון עצמי של היסטידין קינאזות חיידקיות מטוהרות. לשיטה שלנו מספר יתרונות על פני טכניקות מסורתיות מבוססות SDS-PAGE, המספקות אלטרנטיבה חשובה לאפיון חלבונים חשובים אלה.

כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

למדו שיטת שקיעה מבוססת Concanavalin A למדידת קשירת פוספטאזות גלוקן לסובסטרים שונים. השיטה מאפשרת זיהוי אינטראקציות חלבון-פחמימה בטווח מילימולרי ומאפיינת מוטנטים של SEX4.

Concanavalin A מבוסס Sedimentation Assay למדידת קשירת המצע של פוספטאז גלוקני

גלה סרטונים נוספים