Concanavalin A מבוסס Sedimentation Assay למדידת קשירת המצע של פוספטאז גלוקני

בדיקת שיקוע חוץ גופית מבוססת A זו של concanavalin נועדה למדוד זיקה קשירה של פוספטזות גלוקניות כנגד מצעי STA שונים. המידע שאנו מקבלים משיטה זו הוא בסיסי להבנתנו את משפחת האנזימים גלוקן פוספטאז. אינטראקציות חלבון פחמימות הן חלשות יחסית, ולכן השיטות הנוכחיות אינן יכולות לזהות אינטראקציות גלוקן פוספטאז וגלוקן.

בדיקת הקוסדמנטציה מבוססת הלקטין שלנו יכולה לזהות זיקה קושרת בטווח המילימולרי. האפיון של מוטנטים SEX4 כמו גם חברים אחרים במשפחת האנזימים גלוקן פוספטאז מדגים את היכולת של בדיקה זו לכמת אינטראקציות פחמימות חלבוניות. אחד החלקים המאתגרים ביותר בבדיקה הוא לייעל את טווח הריכוז של המצע.

אנו ממליצים להתחיל עם טווח רחב יותר כדי לקבל מושג ולאחר מכן לצמצם לטווח ספציפי. כדי להתחיל, פיפטה 250 מיקרוליטר של חרוזי ConA-sepharose תרחיף לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את התוכן ב 10, 000 G במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר השלכת הסופרנטנט, הוסף 750 מיקרוליטר של חיץ הקישור לכל צינור המכיל 250 מיקרוליטר של חרוזי ConA-sepharose. צנטריפוגות את הצינורות ב 10, 000 G במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. לאחר מכן, להכין דילולים כפולים של פתרון עמילופקטין מסיס לעשות סדרה של שני מיליליטר פתרונות עמילופקטין מדולל.

כדי להכין את חרוזי העמילופקטין ConA-sepharose, הוסף 250 מיקרוליטר של כל תמיסת עמילופקטין מדוללת לצינורות המכילים 250 מיקרוליטר של חרוזי ConA-sepharose מאוזן מראש ומאגר קשירה. מערבבים היטב את התוכן ותייגו את הצינורות עם ריכוז העמילופקטין המתאים. לדגור על תוכן הצינור על גלגל מסתובב בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות וצנטריפוגה את הצינורות ב 10, 000 G למשך דקה אחת.

ערבבו 250 מיקרוליטר של חרוזי עמילופקטין ConA-sepharose עם 100 מיקרוליטר של חיץ הקישור המכיל 10 מיקרוגרם של עודפי עמילן ארבעה, או חלבון SEX4, 10 מילימולר של dithiothreitol, ו 10 מיקרומולר של קוקטייל מעכב פרוטאז. דוגרים על התוכן בארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות בסיבוב עדין. ואז צנטריפוגה את הצינורות ב 10, 000 G במשך דקה אחת בזהירות פיפטה 50 מיקרוליטר של supernatant לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר.

הוסף 20 מיקרוליטר של צבע דף 4X SDS ו -10 מיקרוליטר של מים מזוקקים לכל צינור המכיל 50 מיקרוליטר של שברי supernatant שנאספו ותייג אותם כ- S.באופן דומה, הוסף 20 מיקרוליטר של צבע דף 4X SDS ו- 80 מיקרוליטר של מים מזוקקים לצינורות המכילים חרוזי ConA-sepharose amylopectin SEX4 שטופים. לאחר הוספת צבע ומים, מחממים את כל הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ברגע שחרוזי עמילופקטין SEX4 של ConA-sepharose עוברים צנטריפוגה של 10, 000 גרם למשך דקה אחת, שמרו את הסופרנאטנט ותייגו אותו כ-P.Load 40 מיקרוליטר של דגימות החלבון הלא מאוגדות המסומנות כ-S לבארות ג'ל פוליאקרילאמיד פריקאסט של 4 עד 12% מריכוז המצע הנמוך ביותר לגבוה ביותר, תוך שמירת הנתיב הראשון לסמן משקל מולקולרי חלבוני.

השתמש בג'ל שני כדי לטעון את דגימות החלבון הקשורות לגלוקן המסומנות P.Add דף SDS טרי מוכן חיץ ריצה לשני התאים של המכשיר ולהפעיל את הג'ל ב 150 וולט במשך 35 דקות או עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל. לאחר מכן קח את קלטת הג'ל מהמנגנון והסר את הספייסרים וצלחות הזכוכית כדי להפריד את הג'ל לניתוח כתמים מערביים. הפוך ליטר אחד של מאגר העברה המכיל 5.8 גרם של בסיס tris, 2.9 גרם של גליצין, 0.37 גרם של SDS, ו 200 מיליליטר של מתנול.

כדי להעביר את החלבונים המופרדים בגודל מג'ל הפוליאקרילאמיד לקרום ניטרוצלולוז, הרכיבו את הספוגים, ניירות הסינון, הג'ל וקרום הניטרוצלולוז בהתאם לפרוטוקול ההעברה המערבי ופעלו במתח של 70 וולט למשך שעה. לאחר הפעלת הג'ל, יש לדגור על קרום הניטרוצלולוז בתמיסת חלבון של אלבומין בסרום בקר אחד עד 5% או חלבון חלב במאגר TBST של 50 מיליליטר למשך שעה אחת כדי למנוע קשירת חלבון לא ספציפית. שטפו את הממברנה שלוש פעמים באמצעות מאגר TBST כדי להסיר כל תמיסת חסימה לא מאוגדת.

לאחר מכן, לדגור על הממברנה במשך שעה אחת עם נוגדן מדולל חזרת peroxidase מקושר ספציפי עבור חלבון מתויג היסטידין. לאחר מכן שטפו את הממברנה שלוש פעמים במאגר TBST כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. עבור הדמיה דיגיטלית, לעשות פתרון של חלקים שווים של פתרונות מצע chemiluminescent, 750 מיקרוליטר כל אחד בצינור 1.5 מיליליטר, לדגור את הממברנה לפחות חמש דקות בתמיסה.

הניחו את צד חלבון הממברנה על סורק הכתם והריצו את תוכנת הרכישה כדי לכמת את החלבון הן בשבר הכדורי והן בשבר הסופרנאטנטי. כדי להשיג את הנתונים, התחל את מדידות האות הכמותיות באמצעות תוכנת הרכישה עם סורק הכתם. נרמלו את כל המדידות הכמותיות בשברי הסופרנאטנט והגלולה לסך החלבון הטעון.

בניסוי הקישור הרווי, התווה את אחוז החלבון הקשור לעומת ריכוז העמילופקטין והתאים את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח נתונים לחישוב קבוע הדיסוציאציה, Kd.יכולת הקישור של SEX4 לחרוזי עמילופקטין ConA-sepharose נותחה באמצעות דף SDS. נצפתה נוכחות של חלבון SEX4 בחלק הכדורי ואלבומין בסרום בקר בחלק הסופרנאטנטי. W278A, מוטנט SEX4 ידוע עם יכולת קשירה גלוקנית מופחתת באופן משמעותי, הופיע בחלק הסופרנאטנטי, מה שמצביע על התועלת והספציפיות של בדיקה זו.

ניתוח הכתמים המערבי גילה עלייה משמעותית בזיהוי SEX4 והשיטה ספציפית לאיתור פוספטים גלוקניים עם תג היסטידין סופי. בדיקת השקיעה נבדקה בשלושה ריכוזי SEX4 שונים. בעוד ששני מיקרוגרם של SEX4 מספיקים כדי להמחיש באמצעות זיהוי כימילומינסנציה, שימוש בחמישה או 10 מיקרוגרם של SEX4 מאפשר זיהוי מדויק יותר.

כמו כן, נצפתה קשירת SEX4 מוגברת עם ריכוז עמילופקטין מוגבר. נקבעת זיקת הקישור של עמילופקטין וחלבון מסוג SEX4 פראי בריכוזים שונים, ואחוז הנתונים הקשורים לחלבון למודל הקישור הספציפי של אתר אחד נתן Kd של כ-1.03 מיליגרם למיליליטר. נבדקה תחולתה של שיטה זו למדידת קשירת לפורין, LSF2, תירס SEX4 ותפוח אדמה SEX4 כנגד עמילופקטין תפוחי אדמה.

התוצאות הראו כי החלבונים שנבדקו מגידולים בעלי חשיבות אגרונומית קשורים באופן דיפרנציאלי גם לעמילופקטין. חשוב לזכור את הנורמליזציה של כל המדידות הכמותיות בשברים הכדוריים והסופרנטנטיים לסך כל החלבון הטעון. כדי להבטיח שכל העמילופקטין קשור לחרוזים, שמור את שברי הסופרנאטנט כדי לבצע את בדיקת הגלוקוז העמוק מאוחר יותר.

גלוקן פוספטאז משמש מנגנונים נפרדים כדי לקשור, לאתר, dephosphorylate פחמימות. שיטה זו מאפשרת לחקור את הקישור של פוספטאז גלוקני לתחומים מבניים שונים בתוך קומפלקסים פולימריים גדולים לדפוספורילציה ספציפית למיקום.