Name: ספרואידים של כבד אנושי מדם היקפי למחקרי מחלות כבד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: למד ליצור ספרואידים של כבד אנושי מתאים אוטולוגיים מדם היקפי לחקר טוקסיקולוגיה, סרטן וגילוי תרופות. שיטה זו פותרת את מחסור בתאי כבד אנושיים ראשוניים ומציעה פוטנציאל לרפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים אסירי תודה במיוחד על הסיוע הטכני שניתן על ידי אוקסנה וג'ון גרינאקר. עבודה זו נתמכה על ידי ACA CELL Biotech GmbH היידלברג, גרמניה.

התקבל אישור אתי (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) לביצוע ניסויים אלה והסכמה מדעת נחתמה על ידי כל התורמים לפני שאיבת הדם בהתאם להנחיות המוסדיות.
1. הכנת תאים חד-גרעיניים (MNCs) מדם היקפי אנושי (PB)
<ol><li>לחלץ 30 מ"ל דם מתורמים בריאים בעזרת צוות רפואי מיומן על פי הפרוטוקול הסטנדרטי.</li>
	<li>בודד PBMNCs באמצעות מדיה שיפוע צפיפות על פי הפרוטוקול שפורסם על ידי Becker-Kojić et al.13. בודדו, על ידי פיפטינג, את שכבת הביניים בין פלזמה ומדיה הדרגתית צפיפות והשתמשו במי מלח חיץ פוספט סטריליים (PBS) כדי לשטוף את התאים המבודדים.</li>
	<li>השתמש בתא ספירה וספור את מספר התאים בשיטות סטנדרטיות.</li>
</ol>2. דיפרנציאציה של MNCs עם הפעלה עם גליקופרוטאין מעוגן GPI אנושי
<ol><li>מניחים 6 x 106 תאים חד-גרעיניים באלבומין בסרום PBS / 1% בקר (BSA) בצינור פוליסטירן (15 מ"ל) ודגורים עם הנוגדן הספציפי למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על פי Becker-Kojić et al.13.</li>
	<li>צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר ולהחליף PBS / BSA עם מדיום Dulbecco של Iscove בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS).</li>
	<li>לגדל את התאים בצינורות פוליסטירן 15 מ"ל באינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C במשך 8-10 ימים כמתואר Becker-Kojić et al.13. ביום 5 (D5), הוסף 1-2 מ"ל של מדיום Iscove בתוספת 10% FBS לכל צינור 15 מ"ל.</li>
</ol>3. מיון של תאים חדשים שנוצרו dedifferentiated
<ol><li>תרחיף תאים בתרבית צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 300 x גרם ושואף עם פיפטה סטרילית את supernatant שנוצר על פי Becker-Kojić et al.13.</li>
	<li>גלולת השהיה המתקבלת על ידי צנטריפוגה ב-90 מיקרוליטר של חיץ PBS קר (PBS pH 7.2, 0.5% BSA ו-2 mM EDTA) ומוסיפים 10 μL של CD45 חרוזים מגנטיים חיוביים בגודל ננומטרי ודגרים על קרח למשך 15 דקות.</li>
	<li>שטפו את מתלה התא עם 2 מ"ל של חיץ PBS, צנטריפוגו אותו ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והוסיפו 500 μL של חיץ PBS לתאים והשהו מחדש ביסודיות.</li>
	<li>פיפטה 500 μL של חיץ PBS מקורר מראש לתוך העמוד כדי לשטוף ולמקם אותו בשדה המגנטי באמצעות מעמד מגנטי.</li>
	<li>שטפו את התאים שהונחו על העמודה, פעמיים עם 500 μL של חיץ PBS ואספו זרימה המכילה תאים שליליים CD45 בתווך של Iscove בתוספת 10% FBS.</li>
	<li>השתמש בתא ספירה כדי לקבוע את מספר התאים שתוכנתו מחדש.</li>
</ol>4. הכנת כיסויי זכוכית לדור הפטוציטים האנושיים
<ol><li>יש להפריד את כיסויי הזכוכית (14 מ"מ) ולדגור עליהם בחומר ניקוי לא יוני למשך 10 דקות. שטפו את כיסויי הזכוכית במים נטולי יונים, עד שלא יישארו בועות, ודגרו עליהם ב-1M HCl למשך 30 דקות (מעובד מ-Marchenko et al.14).</li>
	<li>יש לשטוף את כיסויי הזכוכית במים נטולי יונים, לפחות 3 פעמים ולייבש אותם למשך הלילה בטמפרטורת החדר. זכוכית מיובשת Autoclave מכסה במיכל מתאים.</li>
</ol>5. ציפוי לוחות תרבית תאים עם biolaminin עבור התמיינות כבד 2D של BD-PSCs
<ol><li>הניחו את כיסויי הזכוכית האוטומטיים עם זוג פינצטות סטריליות ב-4 צלחות באר והדליקו את אורות ה-UV למשך 30 דקות כדי להבטיח תנאים סטריליים.</li>
	<li>הפשירו אליציטוטים של ביולמינין והוסיפו 120 μL של 5 מיקרוגרם / מ"ל ביולמינין לכל החלקת כיסוי זכוכית. השאירו את כיסויי הזכוכית המצופים למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.</li>
	<li>הסר את עודף של biolaminin ולהוסיף 200 μL של מדיום התמיינות hepatocyte כמתואר להלן.</li>
</ol>6. הכנת מדיה הבחנה hepatocyte
<ol><li>ייצור 500 מ"ל של תחליפי סרום נוקאאוט הפטובלסטים (KSR)/דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בינוני המורכב מ-76.4% נוקאאוט DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0.5% L-גלוטמין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 0.1% β-מרקפטואתנול, 1% DMSO ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (Pen/Strep).</li>
	<li>הכינו 500 מ"ל של מדיום הבשלת הפטוציטים המכיל 1% L-גלוטמין, 10 מיקרומטר הידרוקורטיזון 21-המיסוקצינאט נתרן מלח (HCC) ו-1% עט/סטרפ.</li>
	<li>Aliquot בינוני מהמלאי ולהוסיף גורם גדילה הפטוציטים טרי (HGF) ו oncostatin M (OSM) בריכוזים סופיים של 10 ng / mL ו / או 20 ng / mL עבור כל שינוי בינוני. הערה: Oncostatin M הוא ציטוקין השייך לקבוצת הציטוקינים interleukin 6, חשוב להמטופויזיס כמו גם להתפתחות הכבד.</li>
</ol>7. גידול תאי כבד ממוינים מ- BD-PSCs
<ol><li>שים 3 x 105 תאי BD-PSCS לתוך כל באר של צלחת 4 באר מצופה biolaminin.</li>
	<li>מניחים את לוחות 4 בארות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2. תרבית את התאים במשך 5 ימים בתווך הפטובלסטים KSR/DMSO התומך בהתמיינות אנדודרמלית ושנה את המדיום כל יומיים.</li>
	<li>עברו למדיום הבשלת הפטוציטים ביום 5 ותרבו את התאים למשך 7-10 ימים נוספים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. שנה את המדיום כל 48 שעות.</li>
</ol>8.3D התמיינות כבדית ספרואידית
<ol><li>ספירת תאים באמצעות תא ספירה.</li>
	<li>צנטריפוגה BD-dedifferentiated תא השעיה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר supernatant והשהה מחדש תאים ללא התמיינות BD בתווך KSR/DMSO ב- 2 x 106 תאים/מ"ל.</li>
	<li>העבירו את התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להבטיח תרחיף חד-תאי ולהסיר פסולת נוספת.</li>
	<li>ספרו תאים באמצעות תא ספירה והכינו נפח מספיק לכל צפיפות זריעה של תא על מנת לחלק את הנפח הנדרש לכל באר. הכינו שיפוע עם זריעה עליונה של 1 x 106 תאים לצפיפות זריעה נמוכה של 4000 תאים.</li>
	<li>יש להוציא 100 μL של KSR/DMSO בינוני ב-96 לוחות חיבור נמוכים היטב ולהוסיף 100 μL של דילול זריעת תאים.</li>
	<li>מניחים צלחת חיבור נמוכה באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2 ו תרבית אותם במשך 5 ימים.</li>
	<li>שנה 50% מהתווך מימים 3-4 לאחר הזריעה כאשר הספרואידים קומפקטיים מספיק.</li>
	<li>ביום 5, לשנות את המדיום כדי hepatocyte התבגרות המדיום ואת תרבית התאים במשך 7-10 ימים נוספים להבשלה נוספת. החליפו את המדיום כל יומיים.</li>
</ol>9. ניתוח אימונופלואורסנציה של תרביות תאי כבד דו-ממדיות שנוצרו לאחרונה
<ol><li>תרבית את התאים בשיטת ההתמיינות שתוארה לעיל במשך 4, 8, 15 ו-24 ימים ותוציא מדיה.</li>
	<li>לדגור על תאים עם קיבוע שחומם מראש המורכב מ-4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 10 דקות. השליכו את הקיבוע ושטפו את התאים 2x עם PBS למשך 5 דקות כל אחד. הוסף מיד תמיסת טריטון X-100 0.1% וחדיר את התאים למשך 5 דקות. יש לשטוף פעמיים עם PBS.</li>
	<li>הוסף תמיסת חסימה העשויה PBS ו- 5% BSA והנח על צלחת נדנדה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דילול נוגדנים ראשוניים במאגר דילול 1% BSA/PBS כדלקמן: אלבומין (ALB) 1:50, חלבון עוברי אלפא-1 (AFP) 1:250, ציטוקרטין 18 (CK18) 1:50, פקטור גרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) 1:1000 וטרנסתירטין (TTR) 1:50. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר.</li>
	<li>לדגור על התאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השליכו את תמיסת הנוגדנים, שטפו את התאים במשך 5 דקות וחזרו על שלב השטיפה 3x.</li>
	<li>הכינו את הנוגדנים המשניים הבאים במאגר דילול: ארנב נגד עוף IgG (אדום טקסס) 1:1000, עיזים נגד עכבר IgG (488) 1:1000, ועז נגד ארנב (488) 1:500. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר לדגור את התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שטפו את התאים 3x עם PBS במשך 5 דקות כל אחד והרכיבו את הכיסויים עם מדיית הרכבה המכילה DAPI לניתוח מיקרוסקופי.</li>
</ol>10. צביעה חיה של ספרואידים חדשים שנוצרו בכבד
<ol><li>יש להשליך בזהירות את אמצעי התרבית מבלי לגעת בכדורים, להוסיף PBS טרי עם תמיסת 0.1% טריטון X-100, ולדגור במשך 5 דקות כדי לחדור לתאים.</li>
	<li>שטפו את הספרואידים עם המדיום על ידי פיפטינג איטי במשך 5 דקות, חזרו על הפעולה 2x.</li>
	<li>לדגור על הספרואידים עם הנוגדנים העיקריים ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) ו-CYP3A4 (1:200) שהוכנו ב-PBS עם 1% BSA למשך שעה אחת באינקובטור CO2 של 5% ב-37°C. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר.</li>
	<li>בזהירות להסיר את תמיסת נוגדנים עודף לשטוף את spheroids עם בינוני 3x.</li>
	<li>הכינו את הנוגדנים המשניים המתאימים IgG נגד עכבר (Cy3), IgG נגד עכבר עיזים (488), וארנב נגד עוף IgG (אדום טקסס) בדילול של 1:1000 ו-1:500 נגד ארנב עיזים (488) ב-PBS ב-1% BSA. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר לדגור במשך 20 דקות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2.</li>
	<li>בזהירות לשטוף 3x עם בינוני ולהשאיר את הצלחת במשך 30 דקות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2 לפני ביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
</ol>11. בדיקת ספרואידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי
<ol><li>הפעל את מקור האור הפלואורסצנטי 10 דקות לפני השימוש, הפעל את המחשב ופתח את תוכנת ההדמיה.</li>
	<li>השתמש במטרה עם הגדלה 4x, לחץ על כפתור 4x בסרגל הכלים כדי לבחור את סרגל קנה המידה הנכון, ולאחר מכן הנח את צלחת 96 באר על הצלחת במרכז הבמה.</li>
	<li>הפעל את מקור תאורת ה- LED, השתמש במסנן brightfield ומקם את הצלחת לבאר המעניינת באמצעות ידית הכוונון של שלב ציר x-y.</li>
	<li>שנה לנתיב תאורת המצלמה, לחץ על הלחצן Live in תוכנת הדמיה כדי להמחיש את התמונה על המסך, ולוודא שהספרואיד ממורכז באמצעות ידיות ציר ה-x ולהתמקד באמצעות ידית המיקוד הגס/עדין. הערה: צורת הספרואידים נשארת קבועה לאחר מריחת כתמים חיים.</li>
	<li>בחרו בשיטת Brightfield Observation בסרגל הכלים, העבירו את הגדרות החשיפה למצב אוטומטי ולחצו על הלחצן Snapshot בלוח הבקרה של המצלמה כדי לצלם תמונה. לאחר מכן שמור את התמונה כקובץ .vsi באמצעות השם המתאים בתיקיה המעניינת.</li>
	<li>הנח את לוח סיכוך תאורת הסביבה כדי לכבות את אור ה- LED, שנה למסנן עבור עירור B, בחר שיטת תצפית 488 בסרגל הכלים, פתח תריס, צלם תמונה על ידי לחיצה על לחצן תצלום בזק, סגור תריס ולאחר מכן שמור קובץ כמתואר לעיל.</li>
	<li>חזור על כך עם מסנן לעירור G באמצעות שיטת התצפית המתאימה (אדום טקסס או CY3). לאחר מכן חזור על כל ההליך עבור כל באר של עניין.</li>
	<li>להחזיר את הצלחת לאינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C ולתרבת אותו כמתואר לעיל.</li>
</ol>

<ol><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1620(2019).</li>
<li>Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+liver+disease+-+A+practical+approach+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Animal models for liver disease - A practical approach for translational research.</a> Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).</li>
<li>Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+human+liver+spheroids+for+translational+pharmacology+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+and+Clinical+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+extracellular+matrix%2C+scaffolds%2C+and+signalling%3A+tissue+architecture+regulates+development%2C+homeostasis%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).</li>
<li>Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhanna%2C+S+%22Animal+Biotechnology+%28Second+Edition%29%22">Animal Biotechnology (Second Edition)</a>. , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+hepatocyte+spheroids+as+an+in+vitro+tool+for+investigating+drug+compounds+with+low+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+metabolism+and+disposition%3A+The+Biological+Fate+of+Chemicals%22%5BJournal%5D)">Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance.</a> Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+stem+cells+into+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Genetic+Engineering+Reviews%22%5BJournal%5D)">Differentiating stem cells into liver.</a> Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).</li>
<li>Hurrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+spheroids+as+a+model+to+study+aetiology+and+treatment+of+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis.</a> Cells. 9 (4), 964(2020).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+spheroids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+in+bio-artificial+liver+rescue+porcine+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure.</a> Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+enzymes+and+drug+metabolism+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808(2021).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-Free+generation+of+blood-derived+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">GM-Free generation of blood-derived neuronal cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (168), e61634(2021).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry%3A+Human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry: Human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e267(2007).</li>
<li>Crandall, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-fetoprotein%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Clinical+Laboratory+Sciences%22%5BJournal%5D)">Alpha-fetoprotein: a review.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).</li>
<li>Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+transthyretin+in+cell+biology%3A+impact+on+human+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+2021%22%5BJournal%5D)">The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).</li>
<li>Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+nuclear+factor+4+alpha+activation+is+essential+for+termination+of+liver+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice.</a> Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).</li>
<li>Korver, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+cytokeratin-18+as+a+biomarker+for+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury.</a> Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).</li>
<li>Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CYP3A+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">The role of CYP3A in health and disease.</a> Biomedicines. 10 (11), 2686(2022).</li>
<li>Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+expression+of+cytochrome+P450+3A+isoforms+and+toxicological+effects%3A+endo-+and+exogenous+substances+as+regulatory+factors+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates.</a> Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).</li>
<li>Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2D6+and+CYP3A4+involvement+in+the+primary+oxidative+metabolism+of+hydrocodone+by+human+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).</li>
<li>Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+liver+diseases+in+the+world%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Burden of liver diseases in the world.</a> Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).</li>
<li>Kammerer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+liver+culture+systems+to+maintain+primary+hepatic+properties+for+toxicological+analysis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214(2021).</li>
</ol>

המחברת המקבילה מצהירה כי היא בעלת פטנט הקשור לחלבון מקושר GPI אנושי חדש. היא ייסדה ועובדת עם ACA CELL Biotech GmbH. המחברים האחרים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

הכבד הוא איבר מרכזי בגוף האדם עם פונקציות ביולוגיות חיוניות רבות, כגון ניקוי רעלים של מטבוליטים. בשל אי ספיקת כבד חמורה כמו שחמת הכבד ו / או דלקת כבד ויראלית, ישנם כמעט 2 מיליון מקרי מוות בשנה ברחבי העולם. השתלות כבד מדורגות במקום השני בהשתלות איברים מוצקים ברחבי העולם, אך רק כ-10% מהצורך הנוכחי מסופק22.
הפטוציטים אנושיים ראשוניים (PHH) משמשים לעתים קרובות לחקר רעילות הכבד. תאים אלה יכולים להישמר בתרבית לזמן קצר תוך שמירה על תפקודיהם הספציפיים. כמו כן, מספר התאים הזמיני...

בשנים האחרונות מערכות תרבית ספרואידים תלת-ממדיות (3D) הפכו לכלי חשוב לחקר תחומים שונים של חקר סרטן, גילוי תרופות וטוקסיקולוגיה. תרביות כאלה מעוררות עניין רב משום שהן מגשרות על הפער בין חד-שכבות דו-ממדיות (2D) של תרביות תאים לבין איברים מורכבים1.
בהיעדר משטח דביק, בהשוואה לתרבית תאים דו-ממדית, היווצרות הספרואידים מבוססת על הזיקה הטבעית של תאים אלה להתקבץ בצורה תלת-ממדית. תאים אלה מתארגנים לקבוצות המורכבות מסוג אחד או יותר של תאים בוגרים. ללא חומרים זרים, תאים אלה מתקשרים זה עם זה כמו במיקרו-סביבה המקורית שלהם. התאים בתרבית תלת-ממדית קרובים הרבה יותר ובעלי אוריינטציה נכונה זה כלפי זה, עם ייצור מטריצה חוץ-תאית גבוה יותר מאשר תרביות דו-ממדיות, ומהווים סביבה טבעית קרובה 2.
מודלים של בעלי חיים שימשו במשך זמן רב לחקר ביולוגיה אנושית ומחלות3. בהקשר זה, ישנם הבדלים מהותיים בין בני אדם לבעלי חיים, מה שהופך מודלים אלה לא לגמרי מתאים למחקרים אקסטרפולטיביים. ספרואידים ואורגנואידים בתרבית תלת-ממדית מהווים כלי מבטיח לחקר ארכיטקטורה דמוית רקמה, אינטראקציה והצלבה בין סוגי תאים שונים המתרחשים in vivo ויכולים לתרום להפחתה או אפילו להחלפה של מודלים של בעלי חיים. הם מעניינים במיוחד לחקר הפתוגנזה של מחלות כבד, כמו גם פלטפורמות סינון תרופות4.
תרבית ספרואידים תלת-ממדית היא בעלת חשיבות מיוחדת לחקר הסרטן מכיוון שהיא יכולה לחסל את חוסר הרציפות בין התאים לסביבתם על ידי הפחתת הצורך בטריפסיניזציה או בטיפול בקולגנאז הדרוש להכנת חד-שכבות תאי הגידול לתרביות דו-ממדיות. ספרואידים סרטניים מאפשרים לחקור כיצד תאים נורמליים לעומת תאים ממאירים מקבלים ומגיבים לאותות מסביבתם5 והם חלק חשוב בלימודי ביולוגיה של גידולים.
בהשוואה לחד-שכבתיות, תרביות תלת-ממדיות המורכבות מסוגי תאים שונים דומות לרקמות הגידול בתכונותיהן המבניות והתפקודיות ולכן מתאימות לחקר גרורות ופלישה של תאי גידול. זו הסיבה שמודלים ספרואידים כאלה תורמים להאצת חקר הסרטן6.
ספרואידים גם עוזרים לפתח את הטכנולוגיה ליצירת אורגנואידים אנושיים מכיוון שביולוגיה של רקמות ואיברים מאתגרת מאוד למחקר, במיוחד בבני אדם. התקדמות בתרבית תאי גזע מאפשרת לפתח תרביות תלת ממדיות כמו אורגנואידים המורכבים מתאי גזע ואבות רקמות, כמו גם סוגים שונים של תאים בוגרים (רקמות) מאיבר עם כמה מאפיינים פונקציונליים כמו איבר אמיתי שניתן להשתמש בו כדי למדל התפתחות איברים, מחלות, אבל הם גם יכולים להיחשב שימושיים ברפואה רגנרטיבית7.
הפטוציטים אנושיים ראשוניים משמשים בדרך כלל לחקר ביולוגיה חוץ גופית של הפטוציטים אנושיים, תפקוד כבד ורעילות הנגרמת על ידי תרופות. לתרביות של הפטוציטים אנושיים יש שני חסרונות עיקריים, ראשית, הזמינות המוגבלת של רקמה ראשונית כמו הפטוציטים אנושיים, ושנית, הנטייה של הפטוציטים להתמיין במהירות בתרבית דו-ממדית ובכך לאבד את פונקציית הפטוציטים הספציפית שלהם8. תרביות כבד תלת-ממדיות הן טובות יותר בהקשר זה, ולאחרונה נוצרו מתאי גזע עובריים אנושיים ממוינים (hESCs) או מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs)9. ספרואידים תלת-ממדיים מהונדסים ביולוגית בכבד מעניינים במיוחד בחקר התפתחות, רעילות, מחלות גנטיות וזיהומיות של הכבד, כמו גם בגילוי תרופות לטיפול במחלות כבד10. לבסוף, יש להם גם פוטנציאל לשימוש קליני, בידיעה שלמחלות כבד חריפות יש שיעור תמותה של כמעט 80%, כבד ביו-מלאכותי ו / או ספרואידים בכבד יכולים להציל חולים אלה על ידי מתן תפקוד כבד חלקי עד שניתן למצוא תורם מתאים11.
קבענו פרוטוקול ליצירת ספרואידים אנושיים בכבד באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בדם (BD-PSCs) להכנת ספרואידים בגדלים שונים המכילים 4000 עד 1 x 106 תאים וניתחנו אותם באמצעות מיקרוסקופ אור ואימונופלואורסנציה. בדקנו גם את היכולת של תפקוד ספציפי לכבד, והערכנו את הביטוי של אנזימי ציטוכרום P450 3A4 (CYP3A4) ו-2E1 (CYP2E1) השייכים למשפחת הציטוכרום P450 שיש להם תפקידים חשובים במטבוליזם של תאים ותרופות באמצעות תהליך של ניקוי רעלים12.

<table><tbody><tr><td>נוגדן אלבומין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500217</td><td>מיוצר בעוף</td></tr><tr><td>Albumin Fraction V</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-1 Fetoprotein</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>14550-1-AP</td><td>ארנב פוליקלונלי IgG</td></tr><tr><td>Biolaminin 111 LN</td><td>BioLamina&nbsp;</td><td>LN111-02</td><td>אנושי רקומביננטי</td></tr><tr><td>CD45 מיקרו-חרוזים</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>חרוזים מגנטיים בגודל ננו</td></tr><tr><td>מסננת תאים</td><td>pluriSelect</td><td>43-10040-40</td><td></td></tr><tr><td>CellSens&nbsp;</td><td>תוכנת הדמיה</td> <td>אולימפוס</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל&nbsp;</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>CEROplate 96 באר</td><td>OLS OMNI מדעי החיים</td><td>2800-109-96</td><td></td></tr><tr><td>CKX53&nbsp;</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומר ניקוי זמין מסחרית</td><td>פרוקטר & Gamble</td><td></td><td>חומר ניקוי לא יוני</td></tr><tr><td>נוגדן ספציפי CYP2E1</td><td>Proteintech גרמניה GmbH</td><td>19937-1-AP</td><td>נוגדן רב-שבטי ארנב</td></tr><tr><td>IgG CYP3A4&nbsp;</td><td>Proteintech גרמניה GmbH</td><td>67110-1-lg</td><td>נוגדן חד שבטי לעכבר IgG1</td></tr><tr><td>Cytokeratin 18</td><td>DakoCytomation</td><td>M7010</td><td>נוגדן חד שבטי לעכבר IgG1</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>הופסק. זמין תחת: TMS-013-B</td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית מחליק 14 מ"מ</td><td>R. Langenbrinck</td><td>01-0014/1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>L-גלוטמין</td></tr><tr><td>גלוטראלדהיד 25%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G588.2-50ML</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG Cy3</td><td>נוגדנים מקוונים</td><td>ABIN1673767</td><td>עיזים פוליקלונליים</td></tr><tr><td>נגד עכבר IgG DyLight 488</td><td>נוגדנים מקוונים</td><td>ABIN1889284</td><td>עיזים רב-שבטיים</td></tr><tr><td>נגד ארנב IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1LGL</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17705021</td><td>מדיום התבגרות הפטוציטים</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0324</td><td>רקומביננטי אנושי</td></tr><tr><td>HNF4 ואלפא; נוגדן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1457-25UL</td><td>שיבוט 4C19 ZooMAb Rbmono</td></tr><tr><td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate (מלח נתרן)</td> <td>Biomol</td><td>Cay18226-100</td><td></td></tr><tr><td>החלפת סרום נוק אאוט - Multi Species Gibco</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A3181501</td><td>KSR</td></tr><tr><td>נוקאאוט DMEM/F-12</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>12660012</td><td>הופסק. זמין תחת קטלוג מס' 10-828-010</td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td>מעמד מגנטי</td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31350010</td><td>50mM</td></tr><tr><td>MiniMACS עמודות</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multidish</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789</td><td>4 צלחות</td></tr><tr><td>באר Oncostatin M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC5015</td><td>רקומביננטי</td></tr><tr><td>אנושי Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS סטרילי</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Biochrom GmbH</td><td>A2213</td><td>10000 U / ml</td></tr><tr><td>PS 15 מ"ל צינורות סטריליים</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188171</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי עוף IgG טקסס נוגדנים אדומים</td><td>באינטרנט</td><td>ABIN637943</td><td></td></tr><tr><td>Roti Cell Iscoves MDM</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9033.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Mount FluorCare DAPI</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>HP20.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Sep 1077 אנושי</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן טרנסתירטין&nbsp;</td><td>SAB3500378 סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td>מיוצר בעוף</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HFH10</td><td>1%</td></tr></tbody></table>

ספרואידים של כבד אנושי מדם היקפי למחקרי מחלות כבד

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

תאי כבד אנושיים יכולים ליצור מבנה תלת ממדי (3D) המסוגל לגדול בתרבית במשך כמה שבועות, תוך שמירה על יכולתם התפקודית. בשל טבעם להתקבץ בתרבית צלחות בעלות תכונות דבק נמוכות או ללא תכונות דבק, הם יוצרים צברים של תאי כבד מרובים הנקראים ספרואידים של כבד אנושי. היווצרותם של ספרואידים תלת-ממדיים בכבד מסתמכת על הנטייה הטבעית של תאי הכבד להצטבר בהיעדר מצע דביק. למבנים תלת-ממדיים אלה יש תגובות פיזיולוגיות טובות יותר מאשר לתאים, הקרובים יותר לסביבה in vivo . לשימוש בתרביות הפטוציטים תלת-ממדיות יש יתרונות רבים בהשוואה לתרביות דו-ממדיות (2D) קלאסיות, כולל מיקרו-סביבה רלוונטית יותר מבחינה ביולוגית, מורפולוגיה אדריכלית המרכיבה מחדש איברים טבעיים, כמו גם חיזוי טוב יותר לגבי מצב המחלה ותגובות דמויות in vivo לתרופות. מקורות שונים יכולים לשמש ליצירת ספרואידים, כמו רקמת כבד ראשונית או קווי תאים אימורטליים. ניתן להנדס את רקמת הכבד התלת-ממדית גם באמצעות תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) או תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs) כדי להפיק הפטוציטים. השגנו ספרואידים אנושיים בכבד באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בדם (BD-PSCs) המופקים מדם היקפי ללא מניפולציה על ידי הפעלת חלבון הקשור לקרום אנושי הקשור ל- GPI ומובחן להפטוציטים אנושיים. תאי כבד אנושיים שמקורם ב-BD-PSCs וספרואידים של כבד אנושי נותחו במיקרוסקופ אור ואימונופנוטיפ באמצעות סמני כבד אנושיים.

הבחנו בהצלחה BD-PSCs אנושיים לתאי אב אנדודרם / כבד והפטוציטים על ידי יישום פרוטוקול דו-שלבי. שינויים מורפולוגיים במהלך תהליך התמיינות הכבד מוצגים באיור 1. BD-PSCs מתמיינים להפטוציטים שעוברים שלושה שלבים שונים. השלב הראשון מייצג את ההתמיינות לתאים אנדודרמליים L4, השני, התמיינות לתאי אב כבדיים (הפטובלסט) L8, המציגים מורפולוגיה מצולעת טיפוסית, והשלישי, הבשלה להפטוציטים L15-L24.
ניתוח אימונופלואורסנציה בוצע כדי לאשר את התמיינות הכבד של BD-PSCs כפי שמוצג <strong class=...

כאן אנו מציגים שיטה לא גנטית ליצירת ספרואידים אוטולוגיים אנושיים בכבד באמצעות תאים חד-גרעיניים שבודדו מדם היקפי במצב יציב.

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

יצירת ספרואידים בכבד אנושי באמצעות מקורות אוטולוגיים יכולה לתרום לתחומי מחקר שונים כמו טוקסיקולוגיה, סרטן וגילוי תרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא להשתמש בהפטוציטים אנושיים שמקורם ב- BDPC כדי להנדס ספרואידים של כבד אנושי, תוך עקיפת המחסור בהפטוציטים אנושיים ראשוניים או PHH. ניתן להרחיב ספרואידים אנושיים אוטולוגיים לרפואה רגנרטיבית וטיפול, במיוחד בחולים עם אי ספיקת כבד חריפה.מי שתדגים את ההליך תהיה ד"ר אן-קתרין שוט, מובילת הפרויקט במעבדה שלי. התחל על ידי הכנת 500 מיליליטר של hepatoblast KnockOut החלפת סרום dimethyl sulfoxide או KSR DMSO בינוני ו hepatocyte התבגרות בינוני. Aliquot את המדיום מן המלאי ולהוסיף גורם גדילה hepatocyte טרי או HGF ו oncostatin M או OCM בריכוזים סופיים של 10 או 20 ננוגרם למיליליטר עבור כל שינוי בינוני.מעבירים שלוש פעמים 10 לתאי גזע פלוריפוטנטיים חמישיים שמקורם בדם או תאי BD-PSCs לצלחת ארבע בארות מצופות ביולמינין ודגרים על הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% במשך חמישה ימים. כדי לתמוך בהתמיינות האנדודרמלית, תרבית את התאים במשך חמישה ימים בתווך KSR DMSO hepatoblast ושנה את המדיום כל 48 שעות. ביום החמישי, מוסיפים מדיום הבשלת הפטוציטים ומגדלים את התאים למשך שבעה עד 10 ימים נוספים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5%, מה שמבטיח שינוי של התווך כל 48 שעות.ספירת תאים באמצעות תא ספירה וצנטריפוגה BD de-differentiated cell suspension ב 300 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת הסופר-נטנט, יש להשהות מחדש את תאי ה-BD המתמיינים בתווך KSR DMSO פי שניים 10 מתוך ששת התאים למיליליטר. לאחר הבטחת השעיית התא הבודד, הסר כל לכלוך נוסף על ידי העברת התאים דרך מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר.שוב, ספרו את התאים באמצעות תא ספירה והכינו נפח מספיק של צפיפות הזריעה של כל תא כדי לחלק את הנפח הנדרש לכל באר. הכינו שיפוע עם זריעה עליונה של מיליון תאים לצפיפות זריעה נמוכה של 4, 000 תאים. לאחר מכן, להוציא 100 מיקרוליטר של KSR DMSO בינוני ב 96-טוב לוחות חיבור נמוך ולהוסיף 100 מיקרוליטר של דילול זריעת תאים.דוגרים על צלחת החיבור הנמוכה במשך חמישה ימים. החליפו 50% מהתווך ביום השלישי או הרביעי לאחר הזריעה, כאשר הספרואידים קומפקטיים מספיק. ביום החמישי, לשנות את המדיום להבשלת הפטוציטים ותרבית את התאים בו במשך שבעה עד 10 ימים נוספים, לשנות את המדיום כל 48 שעות.לאחר תרבית התאים במשך 4, 8, 15 ו-24 ימים בשיטת ההתמיינות שתוארה קודם לכן, הסר את המדיה. לדגור על התאים עם קיבועים שחוממו מראש המכילים 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 10 דקות. לאחר מכן, להשליך את הקיבוע ולשטוף את התאים עם PBS פעמיים במשך חמש דקות כל אחד.יש להוסיף מיד תמיסת Triton X-100 של 0.1% ולחדור לתאים למשך חמש דקות לפני שתי שטיפות של PBS. הוסיפו תמיסת חסימה העשויה PBS ואלבומין בסרום בקר 5% או BSA לפני שתניחו את התאים על צלחת נדנדה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לדלל נוגדנים ראשוניים במאגר דילול 1%BSA PBS ולהוסיף 50 מיקרוליטר של דילול הנוגדנים לכל באר.יש להשליך את תמיסת הנוגדנים לאחר דגירה של שעה בטמפרטורת החדר ולתת שלוש שטיפות של חמש דקות כל אחת באמצעות PBS. מוסיפים 50 מיקרוליטר נוגדנים משניים מדוללים בחיץ דילול בכל באר ודגרים על התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות כל אחד, הרכיבו את הכיסויים עם מדיית הרכבה המכילה DAPI לניתוח מיקרוסקופי.יש להשליך בזהירות את אמצעי התרבית מבלי לגעת בכדורים, להוסיף PBS טרי עם תמיסת טריטון X-100 0.1% ולדגור במשך חמש דקות כדי לחדור לתאים. שטפו את הספרואידים פעמיים עם המדיום על ידי פיפטציה איטית של המדיום. לאחר מכן, לדגור את הספרואידים עם 50 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים במשך שעה אחת.לאחר שנעשה, בזהירות להסיר את הפתרון נוגדנים עודף ולתת שלוש שטיפות של בינוני. הכינו את הנוגדנים המשניים המתאימים כמו IgG Cy3 נגד עכבר עיזים, IgG 488 נגד עכבר עזים וארנב נגד עוף IgG Texas Red ב- PBS עם 1% BSA והוסיפו 50 מיקרוליטר של דילול נוגדנים לכל באר לפני 20 דקות של דגירה באינקובטור פחמן דו חמצני. שוב, לשטוף שלוש פעמים עם המדיום לפני 30 דקות של דגירה באינקובטור.יש להדליק את מקור האור הפלואורסצנטי 10 דקות לפני השימוש. הפעל את המחשב ופתח את תוכנת ההדמיה. השתמש במטרה הגדלה 4X על ידי לחיצה על כפתור 4X בסרגל הכלים כדי לבחור את סרגל קנה המידה הנכון.לאחר מכן הניחו את הצלחת בת 96 הבארות על הצלחת המרכזית של הבמה. הפעל את מקור אור ה- LED, השתמש במסנן brightfield ומקם את הצלחת לבאר העניין באמצעות ידית הכוונון של שלב ציר XY. שנה לנתיב תאורת המצלמה ולחץ על הלחצן החי בתוכנת ההדמיה כדי להציג את התמונה על המסך.ודא שהספרואיד ממורכז באמצעות ידיות ציר XY והתמקד באמצעות ידית המיקוד הגסה או העדינה. לאחר מכן, בחר את שיטת התצפית brightfield בסרגל הכלים, שים את הגדרות החשיפה לאוטומטיות ולחץ על לחצן התמונה בלוח הבקרה של המצלמה כדי לצלם תמונה. לאחר מכן שמור את התמונה כקובץ vsi באמצעות השם המתאים בתיקיית העניין.הניחו את לוחית סיכוך תאורת הסביבה כדי לכבות את נורית ה-LED ולהחליף את המסנן לעירור B. לאחר מכן בחר שיטת תצפית 488. פתח את הצמצם, צלם תמונה על-ידי לחיצה על לחצן התמונה וסגור את הצמצם ושמור את הקובץ כ- vsi.חזור על התהליך עם מסנן עבור עירור G כדי לחזור על התהליך עבור כל באר מעניינת. שינויים מורפולוגיים במהלך תהליך התמיינות הכבד הראו כי BD-PSCs התמינו להפטוציטים באמצעות שלושה שלבים. השלב הראשון ייצג את ההתמיינות לתאים אנדודרמליים.ההתמיינות השנייה לתאי אב כבדיים המציגים מורפולוגיה מצולעת טיפוסית. והשלישי, ההתבגרות להפטוציטים. ניתוח אימונופלואורסנציה הראה את הביטוי החזק של סמני אב של הכבד האנושי כמו חלבון עוברי אלפא או APF וטרנסתירטין או TTR בתאים בשלב הראשון של תהליך התמיינות הכבד ביום L4 עד L8.עם זאת, הביטוי שלהם ירד ביום L15. הביטוי של אלבומין או ALB ופקטור גרעיני הפטוציטים ארבע אלפא או HNF4 אלפא הופיע לראשונה ב-L4, גדל לאורך זמן ההתמיינות L4 ל-L15, והגיע לביטוי חזק ויציב בזמן ההבשלה L15 עד L24. צבירה ספונטנית של תאים נצפתה בלוחות התקשרות נמוכים המכילים אינדוקציה של הפטוציטים או התבגרות בינונית יזומה היווצרות ספרואידים.נצפה מתאם עקבי בין סטרואידים ספרואידים לבין מספר התאים המשתנה. הספרואידים שנוצרו והתמיינו ב-L14 וחיים מוכתמים בנוגדנים חשפו את הפעילות התפקודית הפוטנציאלית בכבד של ספרואידים שמקורם ב-BD-PSCs. הכנת תאים מונוגרעיניים לתכנות מחדש היא הצעד החשוב ביותר בהליך זה.יצירת ספרואידים בכבד האנושי היא הצעד הראשון ליצירת אורגנואידים במבחנה גרסה פשוטה של האיבר בתלת-ממד עם מיקרו אנטומיה דומה לזו in vivo. אורגנואידים שנוצרו במעבדה משמשים לחקר אורגנוגנזה, התפתחות מחלות וחומרים מזינים.

human-liver-spheroids-from-peripheral-blood-for-liver-disease-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת מודל עכבר כפול אנושי עם מערכת חיסון אנושית ותאי כבד. היא כרוכה בהשתלת תאי כבד אנושיים ותאי גזע ואב המטופויטיים בעכבר מהונדס מדוכאי חיסון באמצעות הזרקה תוך ספלנית, מה שמוביל לקליטת תאי כבד והתפתחות תאי חיסון אנושיים.

פיתוח מודל עכבר אנושי עם תאי כבד אנושיים ותאי חיסון

מתוארת טכניקה לבידוד הפטוציטים אנושיים ותאי כבד לא פרנכימליים מאותו תורם. סוגי תאי הכבד השונים בונים את הבסיס למודלים תפקודיים של כבד והנדסת רקמות. שיטה חדשה זו שואפת לבודד תאי כבד בתפוקה גבוהה ובכדאיות.

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק מדריך צעד אחר צעד כדי לבצע ניסויים זיהום "כבד-על-שבב" תלת-ממדי עם הנגיף הפטיטיס B.

"כבד-על-שבב" תרבויות של ראשי Hepatocytes ותאים Kupffer על זיהום בנגיף הפטיטיס B

פרוטוקול זה מתאר גישה להפקת hepatospheres של תאי גזע האדם בעלי עוצמה באמצעות מערכת התרבות המוגדרת הרכבה עצמית תא. פרוטוקול זה מתוכנת במספר קווי תאים, העלות האפקטיבית ומאפשרת ייצור של כדורי גוף האדם יציבים עבור יישומים ביו-רפואיים.

סרום חינם הפקת מימדים תלת-ממדיים של האדם בתאי גזע חזקים

חשפנו מערכת מיקרופיזיולוגית (MPS) עם אורגנואידים במעי וכבד פרצטמול (APAP). מאמר זה מתאר את השיטות לייצור אורגנואידים והערכות רכוש פרמקוקינטי וטוקסיקולוגי APAP ב MPS. הוא גם מתאר את ניתוחי פונקציונליות הרקמה הדרושים כדי לאמת את התוצאות.

מערכת מיקרופיזיולוגית מעיים/כבד להערכת תרופות פרמקוקנטיות וטוקסיקולוגיות

הליך זה הוקם כדי לשמש לפיתוח תרבויות חזה 3D מתקדמות במבחנה, אשר יכול לספק הערכה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית של הסיכונים genotoxic הקשורים חשיפות ננו חומריים על פני משטרי מינון חריפה או ארוכת טווח, חוזרים ונשנים.

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

מודלים מקיפים במבחנה המשיבים נאמנה את המחלה האנושית הרלוונטית חסרים. המחקר הנוכחי מציג יצירה ותרבות תלת מימדית של גידול תלת מימדי(תלת-ממדי), כלי הפריה אמין לחקר האינטראקציה בין הגידול לסטרומלי בקרצינומה הפטוקולרית האנושית.

מודל ספרואידי תלת מימדי לחקר האינטראקציה בין גידולים סרטניים בקרצינומה הפטוקולרית

כאן אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר (LSEC). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן בכבד, טיהור תאים לא-פרנצ'ימליים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. אנו גם מנצלים את הפנוטיפ ומאפיינים את ה-LSECs המבודדים הללו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

פגיעה בכבד הנגרמת על-ידי תרופות (DILI) היא הגורם העיקרי לכשל תרופתי. פותח פרוטוקול לחיזוי מדויק של אחריות DILI של תרכובת באמצעות מערכת מיקרופיזיולוגית של הכבד (MPS). מודל הכבד משתמש בקוקולטורה של תאי כבד ראשוניים ובנקודות קצה רלוונטיות לתרגום כדי להעריך את תגובות התאים לטיפול.

מערכת מיקרופיזיולוגית של הכבד האנושי להערכת רעילות כבד הנגרמת על ידי תרופות במבחנה

אורגנואידים מחוללים מהפכה במידול רקמות מותאם אישית לפיתוח איברים, גילוי תרופות וחקר מחלות. הנדסת אורגנואידים מתקדמת ליצירת רקמות סינתטיות מורכבות. המטרה היא לשלב מורפוגנזה, טכנולוגיית אסמבלואידים וביומטריצות כדי לקדם את הנדסת הרקמות. פרוטוקול זה מסייע במידול אורגנוגנזה בכבד ובקביעת הנחיות לבניית רקמות סינתטיות.

טכניקות גידול במבחנה למידול אורגנוגנזה של כבד, בניית מכלולים ותכנון רקמות סינתטיות באמצעות קווי תאים אנושיים

כאן אנו מתארים פלטפורמה המאפשרת הדמיה לא פולשנית in vivo של ספרואידים בכבד המושתלים בחדר הקדמי של עין העכבר. תהליך העבודה משתרע מיצירת ספרואידים מתאי כבד ראשוניים להשתלה בעין העכבר והדמיית in vivo ברזולוציה תאית במיקרוסקופ קונפוקלי.

In Vivo הדמיה של כדורי כבד המושתלים בחדר הקדמי של עין העכבר

למד ליצור ספרואידים של כבד אנושי מתאים אוטולוגיים מדם היקפי לחקר טוקסיקולוגיה, סרטן וגילוי תרופות. שיטה זו פותרת את מחסור בתאי כבד אנושיים ראשוניים ומציעה פוטנציאל לרפואה רגנרטיבית.

ספרואידים של כבד אנושי מדם היקפי למחקרי מחלות כבד

גלה סרטונים נוספים