הערכת פעילויות אנטי-מיקרוביאליות של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים במבחנה

הפרוטוקולים מספקים שיטה לבחינת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים, החל מחקירות בשלב ראשוני ועד לבדיקות פני שטח מורכבות יותר. שלא כמו שיטות שתוארו קודם לכן שהביאו לנתונים שאין דומה להם במחקרים, שיטות אלה מניבות תוצאות עקביות וניתנות להשוואה בין חומרים ננו-חלקיקים שונים, חומרים ננו-מבניים ומיני מיקרובים. שמירה על התפלגות הומוגנית של ננו-חלקיקים בשיטות A ו-B יכולה להיות קשה.

ערבול יסודי של הדגימות יבטיח השעיה של ננו-חלקיקים, ופיפטוף שלוש עד ארבע פעמים בין אליציטוטים ישמור על תרחיפים התחל לאסוף חיידקים בתרבית על ידי ציטוט מיליליטר אחד של תרבית חיידקים שגדלה בן לילה לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר. לאחר יצירת מספר מספיק של aliquots, צנטריפוגות אותם כדי להגיע לצפיפות הישיבה הרצויה. אספו את הסופרנאטנט לכלי קיבול לאיסוף.

ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 0.5 מיליליטר של מדיום צמיחה טרי. שלב את המתלה משני צינורות, וחזור על הצנטריפוגליזציה. לאחר צנטריפוגליזציה, לתת שטיפה שנייה עם מדיום צמיחה טרי לחזור על שילוב של התוכן משני צינורות לאחד לפני צנטריפוגה הצינורות.

תן את השטיפה השלישית עם 0.33 מיליליטר של חיץ tris או hydroxyethyl aminomethane buffer. שלב את שלושת המתלים, כל אחד בנפח 0.33 מיליליטר, לצנטריפוגת מיקרו אחת של 1.5 מיליליטר. לאחר הצנטריפוגליזציה, הסר את הסופרנאטנט מהתאים הכדוריים, והשהה מחדש את כדורית התא במיליליטר אחד של חיץ טריס טרי אשר ייקרא תרחיף התא או תרבית זריעת חיידקים בשלב ההשהיה.

כדי ליצור את תרביות החיידקים והננו-חלקיקים, יש לרכז את שני המיליליטרים של תרבית הזריעה החיידקית בכל באר של צלחת פוליסטירן בת 12 בארות שאינן מטופלות ברקמות. עבור כל צינור מיקרו-צנטריפוגה של חמישה מיליליטר המכיל חלקיקי תחמוצת מגנזיום שנשקלו מראש, הוסיפו שלושה מיליליטר של תרבית הזריעה החיידקית. ולסובב את הצינור לזמן קצר כדי לערבב את חלקיקי תחמוצת המגנזיום עם החיידקים.

לאחר הערבוב, יש לחבר מיליליטר אחד של ננו-חלקיקי תחמוצת המגנזיום לשלוש בארות נפרדות כדי ליצור את הדגימות המשולשות של כל משקל שנמדד מראש של ננו-חלקיקי תחמוצת מגנזיום. דגרו על הדגימה במשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס וב-120 סל"ד. ולהעביר דגימה של שלושה מיליליטר לתוך צינור חרוטי בודד של 15 מיליליטר באמצעות פיפטה.

לאחר מכן בצע דילול טורי אחד עד 10 בצלחת באר 96 על ידי הוספת 180 מיקרוליטר של חיץ טריס לכל באר בשורה B לשורה G עבור מספר העמודות המתאים. מערבול קצר צינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל דגימות חיידקים, ולהוסיף 50 מיקרוליטר של דגימת חיידקים לבאר בודדת בשורה A.לאחר מכן, משורה A, להעביר 20 מיקרוליטר של דגימת חיידקים לתוך הבאר המתאימה של שורה B עם ערבוב קצר. בעזרת קצה פיפטה סטרילי, מעבירים 20 מיקרוליטר מהבאר בשורה B לבאר המתאימה בשורה C.ממשיכים בכך עד לשורה G כדי להשלים את הדילול הסדרתי מ-10 לשלילי בשורה B עד 10 לשש השלילי בשורה G.לאחר שסיימו, פיפטה 100 מיקרוליטר מכל באר לצלחת אגר גדילה מתאימה, ולפרוס על הצלחת כדי לפזר את תרבית התא.

הכניסו את צלחות הבאר לשייקר אינקובטור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ודגרו על צלחות האגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. בחנו את הצלחת, וספרו את הצלחות שיש בהן כ-25 עד 300 מושבות. במידת האפשר, בחר צלחות באותו ערך דילול.

כדי שכל חומר ייבדק, דללו את דגימות החיידקים במהלך הלילה על ידי הוספת שלוש אליציטוטים של 200 מיקרוליטר למדיום הגידול לשלוש בארות, ושלושה אליציטוטים של 200 מיקרוליטר של תרבית החיידקים לבארות נוספות. הכניסו את צלחת 96 הבאר לקורא הצלחות וסרקו אותה. במידת הצורך, המשיכו להוסיף ציר או תרבית חיידקים למשך הלילה עד שהצפיפות האופטית של 600 ננומטר, או OD 600, תגיע לכ-0.01.

כדי להכין תרחיפים של ננו-חלקיקים חיידקיים ותרחיפים של ננו-חלקיקי מדיה סטריליים, הסר מיליליטר אחד של תרבית חיידקים או מדיום מקבוצה משולשת של צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר. והוסיפו אותו לצינור צנטריפוגה של חמישה מיליליטר המכיל ננו-חלקיקים שנמדדו מראש. מערבלים את הצינורות כדי לערבב את התמיסה.

פיזור הננו-חלקיקים בצורה הומוגנית על ידי העברת אליציטוטים של מיליליטר אחד מצינור הצנטריפוגה של חמישה מיליליטר לצינור החרוטי של 15 מיליליטר. לאחר שתסיים, aliquot 200 מיקרוליטר של כל דגימה לתוך בארות בודדות של צלחת באר 96. לאחר קביעת צפיפות הישיבה שתוארה קודם לכן, הוסף את הדגימות והבקרה לבארות הבודדות של צלחת פוליסטירן 48 באר שאינה מטופלת ברקמות.

לאחר מכן, aliquot 0.75 מיליליטר של השעיית התא לתוך כל באר המכילה את הדגימות ואת הפקדים. הכניסו את צלחת הבאר 48 לשייקר אינקובטור למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, עם טלטול ב-120 סל"ד. לאחר הדגירה, אספו שתי דגימות מכל קבוצה, והעבירו אותן בנפרד לצינורות מיקרו צנטריפוגות של חמישה מיליליטר.

הוסף שני מיליליטר של נוזל גוף מדומה מתוקן, או RSBF, לכל צינור. הכינו ניירות תאית חנקנית מעוקרים על ידי קיצוצם לקוטר של סנטימטר אחד. מניחים את נייר הניטרוצלולוז החתוך על צלחת אגר המכילה את המדיום המתאים.

לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של תרבית חיידקים מדוללת על נייר הסינון לפני הוספת 50 מיקרוליטר של מדיום מתאים למרכז כל משטח דגימה. בעזרת פינצטה מעוקרת, להרים את נייר cellose חנקן מפני השטח של auger. הפוך בזהירות את נייר התאית החנקתית והנח אותו על משטח הדגימה, כך שהחיידקים יהיו במגע עם 50 מיקרוליטר של מדיום, ואת פני השטח ננו-מובנים של עניין.

אם הדגימה מתכלה בתרבית, הניחו מחזיק מתחתיה כדי להרים אותה כדי למנוע מגע עם חיץ התריס. שמור על הלחות על ידי הוספת מיליליטר אחד של חיץ tris לדגימה המכילה היטב. לאחר הדגירה של הלילה, אספו את נייר הניטרוצלולוז מכל משטח דגימה והכניסו אותו לחמישה מיליליטר של חיץ תריס.

מערבול את ניירות הסינון שנאספו ודגימות חומר ננו-משטח במשך חמש שניות. אספו את מתלי חיץ התריס מהדגימה והניחו אותם בצינורות איסוף טריים נפרדים. ההשפעות האנטי-מיקרוביאליות באמצעות שיטה A זיהו ריכוז מינימלי ומעכב, או MIC, של מיליגרם אחד למיליליטר של ננו-חלקיקי תחמוצת מגנזיום, וריכוזי חיידקים מינימליים, או MBC 99.9, של 1.0 ו-1.6 מיליגרם למיליליטר של ננו-חלקיקי תחמוצת מגנזיום עבור Escherichia coli ו-pseudomonas aeruginosa שליליים בהתאמה.

סטפילוקוקוס אפידרמיס גראם-חיובי, S.Aureus, וסטפילוקוקוס אאורוס עמיד למתיצילין, או MRSA, הדגימו את ערכי המיקרופון של 0.5, 0.7 ומיליגרם אחד למיליליטר תחמוצת מגנזיום חלקיקים בהתאמה. NBC 99.99 ערכים של 1.6 ו 1.2 מיליגרם למיליליטר זוהו עבור S.epidermis ו S.aureus בהתאמה. בעוד MRSA לא צומצם מעבר NBC 90.

MICs של 1.2 ומיליגרם אחד למיליליטר זוהו בזני קנדידה רגישים לתרופות ועמידים לתרופות, C albicans, ו- C albicans fluconazole resistant, או FR בהתאמה. לעומת זאת, ננו-חלקיקים של תחמוצת מגנזיום הדגימו ערכי MIC של מיליגרם אחד ו-0.7 מיליגרם למיליליטר, או C.glabrata ו-C glabrata echinocandin עמידים, או ER בהתאמה. כל מין מועמד הגיע ל-NBC 90 של 0.7 עד 1.2 מיליגרם למיליליטר, אך רק C.glabrata ER הופחת ל-NBC 99.9 ב-1.2 מיליגרם למיליליטר.

בשיטה B, MRSA שנחשף לננו-חלקיקים גדל באופן אקספוננציאלי ל-OD של 0.85. חשיפה ל-1.2 מיליגרם למיליליטר של ננו-חלקיקים של תחמוצת מגנזיום ו-6.25 מיליגרם למיליליטר של טרימטופריים הביאה לירידה של 80.2% ו-81.6% בצמיחת חיידקים בהתאמה. באופן דומה, 2.9 מיליגרם למיליליטר של ננו-חלקיקי מגנזיום הידרוקסיד הפחיתו את צמיחת החיידקים ל-70.3%. חשיפה למיקרוליטר אחד למיליליטר של ונקומיצין הביאה לירידה של 99.99% בגדילה של MRSA, מה שמרמז על הפעילות הבקטריוסטטית של ננו-חלקיקי תחמוצת מגנזיום ומגנזיום הידרוקסיד.

שיטה C לא הראתה עיכוב של צמיחת חיידקים עם מגע עקיף. התוצאות הצביעו על כך של-ZC21 הייתה הפעילות האנטיבקטריאלית החזקה ביותר נגד הידבקות וצמיחה של MRSA, עבור כל הדגימות שנבדקו. בשיטה D, לא זוהה staph aureus בר-קיימא בדגימות 1.9A, 1.9 AA ו-EPD, או בניירות הסינון המשויכים שלהן.

עם זאת, חשיפה לדגימות EPD לאחר כריעה הפחיתה את צמיחת החיידקים למספר תאים על פני השטח הננו-מובנים ונייר הסינון המנומר. זיהוי פעילויות אנטי-מיקרוביאליות של ננו-חלקיקים ופני שטח ננו-מובנים הוביל לחקירות נוספות ביישומי ביו-הנדסה, כולל אלה הקשורים לפצעים כרוניים וזיהומים הקשורים לשתלים.