אסטרטגיה מבוססת CRISPR בצעד אחד לתיוג גנים אנדוגניים בדרוזופילה מלנוגסטר
26 בינואר 2024
כאן, אנו מציגים פרוטוקול תיוג גנים אנדוגני פשוט עבור דרוזופילה, המשתמש בטכניקה מבוססת PCR לזיהוי ללא סמנים של שינויים גנטיים מוצלחים, מה שמקל על פיתוח קווי דפיקה יציבים.
מטרת פרוטוקול זה היא ליצור קו זבוב ערוך אנדוגני. אנו מראים חלבון פלואורסצנטי כדוגמה, אבל זה יכול להיות מיושם גם על נוק-אין אחרים, נוקאאוט, כמו גם יצירת מוטציות. הפרוטוקול שלנו הוא שיטה מבוססת רקומבינציה הומולוגית CRISPR, כך שאין כמעט הגבלה על אתרי מוטציות.
יתר על כן, הפרוטוקול שלנו צמצם מאוד את הזמן והמאמץ הכרוכים בשלבי גנוטיפ. כדי להתחיל, פתחו את אתר Fly CRISPR כדי לעצב sgRNA עבור דרוזופילה, והזינו כ-100 רצפי זוגות בסיסים סביב מיקום הדפיקה הרצוי. בחרו יעדי CRISPR עם האפשרות 'חמש גואנין מובחרות'.
לחץ על הלחצן Find CRISPR targets כדי ליצור רשימה של רצפי sgRNA אפשריים. לאחר מכן לחץ על לחצן ההערכה עבור כל רצף, ובחר שני sgRNA שיש להם אפס מטרות מחוץ ליעד. מכיוון שרמות ביטוי החלבון הטבעיות הן בדרך כלל נמוכות בהרבה, בחרו תגים פלואורסצנטיים בהירים וניתנים לצילום, והתאימו למערך הניסוי.
לאחר מכן, עצבו מקשר כדי לקשר תגי אפיטופ לסמן הפלואורסצנטי לצורך ניתוח ביוכימי. השתמשו בפפטיד מקשר המכיל בין שתיים ל-20 חומצות אמינו, המכילות חומצות אמינו כמו גליצין וסרין. כדי לתכנן את וקטור התורם לדרוזופילה, ארגנו את רצף הדנ"א של הפפטיד המקשר ואת התג הפלואורסצנטי, וודאו רצפים הומולוגיים משני הקצוות.
שנה את כל רצפי PAM בתוך פלסמיד התורם כדי לשמור על רצף חומצות האמינו של החלבונים המתקבלים. לאחר מכן, מקם את קודוני ההתחלה והעצירה בהתאם למיקום התג. לתיוג פנימי, ודא שהתג הפלואורסצנטי נמצא במסגרת עם רצף הקידוד של גן היעד.
לתיוג N-terminus, מקם את התג הפלואורסצנטי אחרי קודון ההתחלה האנדוגני. לתיוג C-terminus, מקם את התג הפלואורסצנטי לפני קודון העצירה הטבעי. הקפד לשמור רק קודון התחלה אחד כדי למנוע בעיות תרגום פוטנציאליות.
השתמש בגישת השיבוט החלופית המבוססת על אנזים הגבלה כדי להכניס את רצף sgRNA לפלסמיד פלסמיד U6 Bbs1-chiRNA. לאחר יצירת פלסמיד sgRNA, הפוך את הפלסמיד ב- DH5-Alpha Escherichia coli בהתאם להוראות היצרן. אמת את השיבוטים המתקבלים באמצעות ריצוף Sanger, באמצעות פריימרים לריצוף סטנדרטי T3 או T7.
כדי ליצור את פלסמיד התורם, השתמש בדנ"א דו-גדילי עם הרצף הרצוי, ושלב אותו באתר השיבוט המרובים השלילי של פלסמיד Bluesript 2SK. רצף את פלסמיד התורם כדי להבטיח שרצפי sgRNA או PAM משתנים כראוי ואין SNPs נוכחים בפלסמיד. לאחר מכן, קח זבובי Cas9 המוזרקים עם gRNA בנוי פלסמידים תורם.
מרדימים את הזבובים בפחמן דו חמצני, ומפרידים בין זבובים זכרים לנקבות בתולות. כדי לבסס צלבי זבובים, זיווג כל זכר G zero עם לפחות שתי נקבות בתולות FM7L בבקבוקוני מזון CT צרים בודדים. הניחו בקבוקונים מוצלבים באינקובטור מאוורר הנשמר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ולחות של 60% עד שטיסות F1 נסגרות.
לאחר מכן הרדימו ואספו לפחות 10 צאצאים נקבות בתולות משני הצלבים הזכריים והנקביים של G zero. ודא שכל זבוב F1 מתויג עם פרטי ההורות שלו ומאוחסן בנפרד. כדי לסנן זבובים עבור PCR, תכננו פריימרים עם טמפרטורת התכה של כ-55 מעלות צלזיוס המקיפים את אתר העריכה של גן המטרה.
הכינו חיץ ליזיס לכל דגימת זבוב, ושחררו 10 מיקרוליטר לכל באר של צלחת PCR 96 באר. שמור על החיץ בטמפרטורה קרה במהלך תהליך דיסקציה של הרגל. לאחר מכן, להכין צינורות נימי זכוכית, מילוי קצה אחד עם מזון אגר סוכרוז.
מניחים צינורות אלה בצלחת באר עמוקה 96, המכונה מלון הזבוב. לדיסקציה של הרגליים, מקמו את משטח ההרדמה של פחמן דו חמצני מתחת למיקרוסקופ סטריאו. מרדימים זבוב מועמד, וכורתים את אחת מרגליו האמצעיות.
לאחר מכן, לטבול את הרגל לתוך חיץ ליזיס. החזיקו את כנף הזבוב בעזרת זוג מלקחיים עדינים ממתכת. העבירו את הזבוב למלון הזבובים, ואטמו מיד את הצינור בחוט.
אכלסו את מלון הזבובים באינקובטור מאוורר המתוחזק בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ו-60% לחות. השקיעו את הרגליים הכרותות בתמיסת חיץ הליזיס במחזור תרמי. ארגן את תגובת ה- PCR לפי הוראות היצרן, באמצעות 1.5 מיקרוליטר של רגל הזבוב ליזט כמקור ה- DNA.
יש להעביר את מוצרי ה-PCR לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, ולפרש את התוצאות על סמך גודל הרצועה. בהתבסס על תוצאות הג'ל, בחרו את הזבובים החיוביים ממלון הזבובים והצליבו אותם בנפרד עם זבובי איזון כדי לייצר את דור ה-F2. השתמש במניות הומוזיגוטיות לריצוף Sanger של אתר העריכה כדי להבטיח דיוק.
הצלבה אחורית של קווי זבובים מאומתים עם זבובים מסוג בר כדי להסיר מוטציות רקע. מסך כל דור באמצעות פרוטוקול PCR על רגל אחת. תמונות מיקרוסקופ קונפוקלי של מוחות דרוזופילה בוגרים הראו חלבון תקופתי מאורגן במוקדים גרעיניים דיסקרטיים לאורך שעות הלילה המאוחרות ושעות הבוקר המוקדמות.
בסך הכל, פרוטוקול זה חזק אם פריימרים PCR גנוטיפ שלך הם ספציפיים.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול מפושט לסימון גנים אנדוגניים ב-Drosophila, המשתמש בטכניקת PCR לזיהוי ללא סמנים של מודיפיקציות גנטיות מוצלחות. גישה זו מקלה על פיתוחם של קווי knock-in יציבים, כפי שהודגם באמצעות דוגמה של חלבון פלואורסצנטי, וניתן להתאימה למודיפיקציות גנטיות נוספות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- גנטיקה
- מחקר ב-Drosophila
רקע
- טכנולוגיות לעריכת גנים, כגון CRISPR, האיצו מודיפיקציות גנטיות באורגניזמי מודל.
- תיוג אנדוגני מאפשר התבוננות בהתנהגויות ואינטראקציות של חלבונים.
- שיטות גנוטיפינג יעילות הן חיוניות לאישור של מודיפיקציות מוצלחות.
מטרת המחקר
- לייעל את התהליך של יצירה ואישור של שושלות Drosophila שעברו שינוי גנטי.
- לספק פרוטוקול הממזער את הזמן הנדרש להליכי גנוטיפ.
- להרחיב את יישומן של טכניקות רקומבינציה הומולוגית באמצעות CRISPR.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- שימוש ברקומבינציה הומולוגית באמצעות CRISPR ב-Drosophila לצורך עריכה גנומית.
- ההתערבויות המרכזיות כללו תכנון של sgRNAs ובנייה של פלסמידי תורם.
- התהליך כלל סריקת PCR של קווים שעברו מודיפיקציה כדי לאמת את הצלחת העריכות.
- שלבים קריטיים כללו דיסקציה של הרגליים לצורך איסוף דגימות והגברה ב-PCR באמצעות פריימרים ספציפיים.
תוצאות עיקריות
- המחקר הדגימה בהצלחה שיטה יעילה ליצירת knock-ins של חלבון פלורסצנטי ב-Drosophila.
- הודגשה הפחתה בזמן הגנוטיפינג ודיוק מוגבר באישור עריכות גנטיות.
- קווי הזבובים שהתקבלו הראו דפוסי לוקליזציה רצויים של החלבון, הנחוצים למחקרים ביולוגיים נוספים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מפשט באופן משמעותי את היצירה והתיקוף של שושלות Drosophila שעברו שינוי גנטי.
- הוא משפר את יכולתם של חוקרים להשתמש במודלים של Drosophila למגוון מחקרים גנטיים.
- היעילות והגמישות של השיטה עשויות לקדם את ההבנה של תפקוד חלבונים ואינטראקציות בין גנים in vivo.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
סימון יעיל של גנים אנדוגניים ב-Drosophila melanogaster מאיץ את התיקוף של תפקוד וחלק חלבונים, ובכך תומך בגילוי מוקדם ובצמצום סיכונים מכניסטיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה. הפרוטוקול החד-שלבי המבוסס על CRISPR, הכולל סריקה מבוססת PCR, מבטל את התלות בסמנים נראים ומייעל את היצירה של קווים יציבים המהונדסים גנטית. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי ואת תעדוף הפורטפוליו על ידי מתן אפשרות לאישור מהיר, ללא סמנים, של שינויים גנטיים במערכות מודל הרלוונטיות למחלות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של לוקליזציית חלבונים ותפקודם in vivo לצורך תיקוף המטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לסימון אנדוגני מדויק ללא סמנים אקסוגניים.
- מקל על יצירה מהירה של קווים מוגדרים גנטית למחקרים מונחי-השערה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק מערכות ביולוגיות מתוקתקות ללא סמנים (marker-free) עבור סריקת פנוטיפ המשכית.
- משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות גנוטיפ מבוסס PCR.
- מאפשר ייצור בר-הרחבה של קווים מהונדסים להערכה חסונה של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תואם לפיתוח מודלים רלוונטיים למחלה על ידי תמיכה במחקרי in vivo של דינמיקה של חלבונים.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מאגרים יציבים ומאופיינים גנטית.
- מפחית עמימות ביולוגית במחקר תרגומי על ידי אישור עריכות גנטיות מדויקות.
שילוב זרימת עבודה וקו עיבוד
פרוטוקול תיוג CRISPR בצעד אחד זה משתלב ברצף הגילוי המוקדם וזיהוי המוליכים, ומספק תשתית לסריקות המשך ולמחקרים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של תגליות: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי אפשור ויזואליזציה בזמן אמת של התנהגות חלבונים.
- סריקה: מספקת שורות הניתנות לשחזור וללא סמנים, המתאימות לבדיקות פנוטיפיות כמותיות.
- אנליטיקה: עושה שימוש בטיפוס גנטי (genotyping) מבוסס PCR ובריצוף סנגר (Sanger sequencing) לאישור חסון של שינויים גנטיים.
- מחקר תרגומי: מקלה על ההתאמה למודלים של מחלות על ידי אפשור מעקב אחר חלבונים in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מקימה זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר עבור יישומים מגוונים של עריכה ותיוג גנים ב-Drosophila.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרה.
- ערך תפעולי: מייעל את הגנוטיפינג, משפר את השחזוריות ותומך ביצירת קווים ניתנים להרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפרויקט (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי האצת תיקוף המודל.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודף מותאם סיכון וקידום של מודלים בהנדסה גנטית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון CRISPR, בניית פלסמידים וגנטיקה של Drosophila.
- דורש גישה לתשתיות PCR, ריצוף סנגר (Sanger) ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הגנוטיפיקה והסריקה.
- ניתן להתוומה למטרות גנים ואסטרטגיות תיוג שונות בתוך מודלים של Drosophila.
- תלוי בספציפיות של תכנון ה-sgRNA ובבחירת הפריימרים ל-PCR לצורך קבלת תוצאות חסונות.
