Name: העברה מאומצת של מקרופאגים מעוררי IL-33 למודלים של עכברים הנגרמים על ידי בלומיצין כדי לחקור את השפעתם על פיברוזיס ריאתי אידיופתי in vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: חקור העברה מאומצת של מקרופאגים ריאתיים מעוררי IL-33 במודל עכברים עם בלומיצין לחקר פיברוזיס ריאתי אידיופתי. שיטה זו מאפשרת לבודד מקרופאגים ולחקור את תפקידם במחלות ריאה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים בנושא המיוחד של ניהול מעבדה באוניברסיטת ג'יאנגנאן: בניית ספריית פרוסה דיגיטלית המבוססת על דגימות פתולוגיות (JDSYS202223) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81800065).

כל הניסויים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה הניסויית לרווחת בעלי חיים באוניברסיטת ג'יאנגנאן (JN No. 20211130m1720615[501]).
הערה: במחקר זה נעשה שימוש בסך הכל ב-10 עכברים זכרים מסוג C57BL/6 בגילאי 6-8 שבועות ובמשקל 20-25 גרם. שלוש קבוצות הניסוי במחקר כללו שלושה עכברים מושתלים כל אחד, ועכבר מארח אחד שימש לבידוד הודעות מיידיות.
1. דלדול מקרופאגים ריאתיים של עכברים
<ol><li>הוציאו את בקבוקון הליפוזומים של קלודרונט (ראו טבלת חומרים) מהמקרר 30 דקות מראש, חממו אותו לטמפרטורת החדר והפכו אותו מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב אחיד. הערה: Clodronate liposomes לעטוף את מולקולות הידרופילי dichloromethylene bisphosphonate. כאשר ליפוזומים אלה נצרכים על ידי המקרופאגים, הקלודרונאט משתחרר בהדרגה על ידי פעולת הפוספטאז הליזוזום, והצטברותו גורמת כתוצאה מכך לאפופטוזיס של התא ולדלדול המקרופאגים7.</li>
	<li>מרדימים עכברים עם 3% איזופלורן. בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטת רגל אחת כדי לבדוק את ההכרה. יש למרוח משחה וטרינרית על שתי העיניים למניעת יובש בהרדמה.</li>
	<li>שאפו 60 μL של ליפוזומים קלודרונט באמצעות פיפטה עם קצה יניקה סטרילי. לתת את התרופה טיפה לתוך חלל האף של העכבר מורדם, כך שכאשר העכבר שואף, התרופה נשאפת לתוך קנה הנשימה. לאחר כל טיפה, ודא שהעכבר שואף את התרופה לחלוטין ונושם באופן שווה. מתן ליפוזומים המכילים PBS בלבד כבקרה8 (איור 2).</li>
	<li>הניחו את העכברים על טבלת טמפרטורה קבועה של 38 מעלות צלזיוס להתחממות מחדש כדי להאיץ את התאוששותם. עקוב אחר העכברים עד שהם מתעוררים. לאחר שהעכברים מתאוששים היטב ומשיגים שכיבה עצם החזה, העבירו אותם לכלוב.</li>
	<li>השתמש בעכברים עם מקרופאגים מכתשית מדולדלים יומיים לאחר הטיפול בליפוזומים קלודרונט כעכברים המקבלים לניסוי ההעברה. הערה: במחקר זה, הידלדלות המקרופאגים בנאדיות אושרה על-ידי בדיקת הביטוי של סמני מקרופאגים כפי שתואר קודם לכן 8,9 לאחר מתן ליפוזומים קלודרונאטים בשאיפה (ראו איור משלים 1).</li>
</ol>2. בידוד ותרבות של הודעות מיידיות
<ol><li>מרדימים את העכבר המארח בהזרקה תוך צפקית של קטמין (120 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (16 מ"ג/ק"ג). אשר את עומק ההרדמה באמצעות אובדן רפלקס צביטת הבוהן. יש למרוח משחה וטרינרית על שתי העיניים למניעת יובש בהרדמה. לאחר מכן, לחטא את העור של העכבר מורדם עם 75% אלכוהול ויוד. השתמש מספריים לחתוך דרך העור ולחשוף את רקמת הלב ריאה</li>
	<li>שאפו 10 מ"ל של 1x PBS במזרק עם מחט 20 G והכניסו את קצה המחט לאטריום הימני של העכבר (איור 3A). חותכים את הווריד הנבוב התחתון של העכבר עם מספריים כירורגיים, ולאחר מכן ידנית לחורר את העכבר עם PBS במהירות קבועה (10-20 מ"ל / דקה) עד שרקמת הריאה הופכת לבנה. מוציאים את רקמת הריאה ומעבירים אותה ל-PBS קר כקרח בצלחת תרבית (איור 3B).</li>
	<li>חותכים את רקמת הריאה לשברים של כ 2 מ"מ x 2 מ"מ x 2 מ"מ. לאחר מכן, הוסף 15 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 1% collagenase A לרקמת הריאה כדי לבודד את המקרופאגים. יש לדגור ב-100 סל"ד למשך 30 דקות על שולחן ניעור בטמפרטורה של 37°C.</li>
	<li>שאפו את מתלה רקמת הריאה דרך מזרק 10 מ"ל לפחות פי 20 כדי שיהיה עדין ככל האפשר. סנן את המתלה דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. צנטריפוגו את התסנין ב 400 x גרם במשך 10 דקות ולזרוק את supernatant.</li>
	<li>לפרוס את תאי הדם האדומים בגלולה על ידי הוספת 3 מ"ל של חיץ ליזיס RBC (ראה טבלת חומרים) על קרח במשך 2-3 דקות.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 5 דקות, להשעות מחדש את גלולת התא עם 10 מ"ל של DMEM (המכיל 100 U/mL פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין). לספור את התאים באמצעות hemocytometer.</li>
	<li>זרעו את התאים לתוך 10 ס"מ צלחת תרבית תאים דבק ב 2 x 107 תאים / צלחת, ולדגור במשך 1 שעה ב 37 ° C ו 5% CO2. זה מאפשר IMs הריאה לדבוק צלחת5. לאחר שעה אחת, שאפו את התאים הסופרנאטנטיים והצפים, והוסיפו 10 מ"ל של מדיום תרבית שלם טרי (DMEM המכיל 10% FBS, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין). יש לדגור במשך יותר מ-8 שעות או למשך הלילה.</li>
	<li>קבע את טוהר ההודעות המיידיות המתקבלות באמצעות ציטומטריית זרימה עם צביעה עבור סמני F4/80 ו- CD11c, כפי שתואר קודם לכן5 (ראה איור משלים 1).</li>
</ol>3. העברה מאמצת של IMs לתוך alveoli הריאה
<ol><li>החלף את מדיום התרבית מהצלחת המכילה את IMs הריאתיים המבודדים (שלב 2.7) במדיום תרבית שלם המכיל 10 ng/mL IL-33 לגירוי IMs. יש לדגור במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. השתמש ב- PBS 1x במקום IL-33 כפקד.</li>
	<li>לנתק את IMs ריאתי על ידי טיפול בהם עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין במשך 5 דקות. לאחר מכן, להרוות את העיכול על ידי הוספת 3 מ"ל של תרבית טרייה מדיום מלא, ולקצור את המקרופאגים ריאתיים על ידי צנטריפוגה של תרחיף התא ב 150 x גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות. ספור את התאים באמצעות המוציטומטר, והשהה מחדש את התאים ב- PBS לריכוז סופי של 5 x 105 תאים / 50 μL.</li>
	<li>מרדימים את העכברים המקבלים עם גז איזופלורן 3%. המתן עד שהעכבר יאבד את הכרתו (כמו בשלב 1.2), ולאחר מכן תקן את הגפיים של העכבר המרדים על צלחת אנכית עם סרט רפואי. משוך בעדינות את לשון העכבר לצד אחד באמצעות צמר גפן.</li>
	<li>הפעל את מנורת האינטובציה והאיר אותה על גרונו של העכבר כך שניתן יהיה לראות את קנה הנשימה. בדוק כי קנה הנשימה קרוב לבסיס הלשון, הוושט קרוב לחלק האחורי של הצוואר, אך פתח הוושט אינו נראה במהלך הניתוח.</li>
	<li>השתמש במנורת האינטובציה (22 G) כדי לסייע באינטובציה של העכבר. יש להנחות את צינורית המחט לתוך קנה הנשימה בעזרת חוט מנחה (קוטר 0.4 מ"מ). הסר את חוט ההנחיה ודחוף את הצינורית לתוך קנה הנשימה של העכבר כדי להשלים את האינטובציה.</li>
	<li>לאחר הצינורית הוא ציין להיכנס קנה הנשימה, להזריק 50 μL של תרחיף התא (המכיל 5 x 105 IMs) לתוך העכבר המקבל דרך קנה הנשימה.</li>
	<li>הניחו את העכברים על משטח חימום קבוע בטמפרטורה של 38°C לחימום מחדש כדי לזרז את ההתאוששות. עקוב אחר העכברים עד שהם מתעוררים. לאחר שהם מתאוששים היטב ומשיגים שכיבה עצם החזה, מעבירים אותם לכלוב.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, מתן בלומיצין (BLM) דרך קנה הנשימה (באמצעות ההליך בשלבים 3.3-3.5) במינון של 1.4 U/kg משקל גוף כדי לגרום IPF. לתת כמות שווה של מלוחים לקבוצת הביקורת.</li>
	<li>לאחר 21 יום, לקבוע את מידת החומרה של פיברוזיס ריאתי עבור קבוצות שונות של עכברים שהועברו באימוץ עם PBS או השעיית IM מגורה IL-33 על ידי הערכת ביטוי של סמנים עבור פיברוזיס ואת Ashcroft ציונים10.<ol><li>לחלץ את סך הרנ"א מרקמת הריאה באמצעות מגיב מיצוי RNA (ראה טבלת חומרים). הערה: ניתוח כמותי בוצע עם קורא microplate. אם יחס OD260/OD280 הוא 1.8-2.0, טוהר הרנ"א גבוה. כל הדגימות אוחסנו ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>בצע PCR כמותי פלואורסצנטי כדי להעריך את הביטוי של אקטין שרירים α חלק (SMA) ופיברונקטין באמצעות פריימרים ספציפיים. הערה: הפריימרים ששימשו עבור α-SMA היו קדימה 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' והפוך 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', והפריימרים ששימשו לפיברונקטין היו קדימה 5'-TCTGGGAAATGGAAGAGGGGAATGG-3' והפוך 5'-CACTGAAGCAGTTCCTCGGTTGT-3'.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע אימונוהיסטוכימיה כמתואר להלן.<ol><li>מייבשים את הריאה השמאלית, מטמיעים אותה ופורסים אותה בעזרת פרוסת פרפין לעובי של 4 מיקרומטר.</li>
		<li>מניחים את חלקי הרקמה על שקופיות ואופים את המגלשות בתנור ב 65-70 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד 1 שעה. הורידו את המגלשות עם אחוז הולך ופוחת של אלכוהול (כלומר, 100%, 95%, 90%, 80% ו-70% אלכוהול) למשך 5 דקות.</li>
		<li>מכתימים את המגלשות בתמיסת צבע המטוקסילין (טהורה אנליטית) למשך 5 דקות. לאחר מכן, שטפו את המגלשות במי ברז. השרו את המגלשות ב-1% חומצה הידרוכלורית למשך 3 שניות, שטפו את הצבע הצף והשרו במים זורמים למשך 5 דקות. המקטעים יהפכו כחולים.</li>
		<li>לטבול בתמיסת eosin במשך 10 שניות עד 1 דקות (לקבוע את זמן הצביעה בהתאם לצבע), לשטוף עם מי ברז, ומניחים 70%, 80%, 95%, 100%, ו 100% אלכוהול, בהתאמה, במשך 5 דקות כל אחד. לאחר מכן הניחו את המגלשות בתמיסות קסילן I וקסילן II למשך 3 דקות. לאחר הייבוש, התבוננו וצלמו מתחת למיקרוסקופ האנכי עם סרט איטום דביק ניטרלי.</li>
		<li>בצע ניקוד Ashcroft על הסעיפים כדי לציין את חומרת פיברוזיס ריאתי10. לבצע ניתוח סטטיסטי של הנתונים באמצעות מבחן t של שני מדגמים בלתי תלויים.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+immunity+in+IPF+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment.</a> Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+circular+RNA+expression+patterns+in+polarized+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).</li>
<li>Lee, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophages+in+the+development+of+acute+and+chronic+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases.</a> Cells. 10 (4), 897(2021).</li>
<li>Luzina, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-33+potentiates+bleomycin-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).</li>
<li>Nie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT2+regulates+pulmonary+inflammation+and+fibrosis+via+modulating+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation.</a> Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).</li>
<li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+PU.1+promotes+alternative+macrophage+polarization+and+asthmatic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation.</a> Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).</li>
<li>Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes%3A+Advancements+and+innovation+in+the+manufacturing+process%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+critical+for+broadly-reactive+antibody-mediated+protection+against+influenza+A+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 846(2017).</li>
<li>Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+alveolar+macrophages+attenuates+acute+ventilator+induced+lung+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats.</a> Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).</li>
<li>Hübner, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+quantification+of+pulmonary+fibrosis+in+histological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples.</a> Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).</li>
<li>Tacke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+monocytes+acquire+antigens+from+other+cells+in+the+bone+marrow+and+present+them+to+T+cells+after+maturing+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).</li>
<li>Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophages%3A+A+new+therapeutic+pathway+in+fibrosing+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).</li>
<li>Wendisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+triggers+profibrotic+macrophage+responses+and+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis.</a> Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+Friend+or+foe+in+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 170(2018).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

מחקר זה מספק שיטה יעילה לדלדול, בידוד, תרבית והעברת מקרופאגים, אשר יכולה לסייע בחקר המנגנונים של פיברוזיס ריאתי בעכברים. ישנן שיטות רבות לדלדול מקרופאגים בעכברים, כגון ניהול קנה הנשימה, הזרקת ורידים בזנב ושאיפת אף11. מחקר זה ייעל את שיטת שאיפת האף, שהיא פשוטה לתפעול ויכולה לרוקן ביעילות מקרופאגים ריאתיים 8,9. לאחר גירוי IL-33 של IMs בתרבית במשך 24 שעות, IMs הועברו באופן מאומץ לריאות של העכברים המקבלים באמצעות נתיב ניהול קנה נשימה לא פולשני...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse&#160;with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF) היא מחלה דלקתית ריאתית מפושטת הנגרמת על ידי גורמים רבים1. במיקרו-סביבה הציטוקינים של התגובה החיסונית Th1 ו-Th2, מקרופאגים יכולים להיות מקוטבים למקרופאגים המופעלים באופן קלאסי (M1) ולמקרופאגים מופעלים לחלופין (M2). ליפופוליסכרידים (LPS) או הציטוקין IFN- γ גורמים למקרופאגים M1 לקטב ולייצר ציטוקינים מעודדי דלקת, כולל iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α ו-IL-12. לעומת זאת, ציטוקינים מסוג II IL-4 ו-IL-13 מניעים את הקיטוב של מקרופאגים M2, אשר יכולים לייצר גורמים שונים המעודדים גדילה של פיברובלסטים, כגון TGF-β ו-PDGF, המקדמים פיברוזיס ריאתי2. התהליך הפתולוגי של IPF מלווה בהפעלת מקרופאגים וחדירה. IPF מתווך תיקון פציעות, דלקת ופיברוזיס באמצעות שחרור ציטוקינים3. מכיוון שרק אפשרויות טיפוליות מוגבלות זמינות, חקירת המנגנונים הפתולוגיים המולקולריים של IPF היא בעלת משמעות רבה לפיתוח אסטרטגיות חדשות למניעה וטיפול ב- IPF. מחקרים קודמים של הקבוצה שלנו וחוקרים אחרים 4,5 אישרו את השחרור המוגבר של IL-33 בחולי IPF ובמודלים של עכברים עם IPF המושרה על ידי בלומיצין (BLM). IL-33 משתחרר על-ידי תאי אפיתל ואנדותל במהלך פיברוזיס ומעורב בהפעלת מקרופאגים, מה שגורם להתרבות חריגה של פיברובלסטים, הסננת לויקוציטים, ובסופו של דבר אובדן תפקוד ריאות5. הפרוטוקול הנוכחי מתאר העברה מאומצת של מקרופאגים אינטרסטיציאליים (IMs) מעוררי IL-33 לתוך הנאדיות כאמצעי לחקר התפתחות IPF במודלים של עכברים. כאן, IMs בודדו מרקמת הריאה של עכברים מארחים, גודלו בתרבית במבחנה, עוררו עם IL-33 במשך 24 שעות, ולאחר מכן הועברו באופן מאומץ לנאדיות של עכברים מושתלים על ידי הזרקת קנה הנשימה. האיסוף הישיר של מקרופאגים עכבריים מעוררים והעברתם המאומצת לנאדיות המקבל נמצא כמחמיר את מידת הפיברוזיס הריאתי ויכול להמחיש בצורה ברורה יותר את ההשפעה של גורמים מעוררים על פיברוזיס בהשוואה למחקרים קודמים6. הטכניקה המתוארת במאמר זה יכולה לאפשר לחוקרים לחקור את תפקודם של מקרופאגים המעוררים על ידי ציטוקינים פוטנציאליים בהתפתחות IPF.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; DMEM</td><td>Life טכנולוגיות ביוטכנולוגיה, ארה"ב</td><td>1508012</td><td></td></tr><tr><td>מחט עורקית</td><td>B Braun Melsingen AG, גרמניה</td><td>21G15G8393</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; אקורי&nbsp; C6 פלוס</td><td>בקטון דיקינסון, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleomycin</td><td>Biotang, ארה"ב</td><td>Ab9465</td><td></td></tr><tr><td>חממת פחמן דו חמצני</td><td>Thermo Forma, ארה"ב</td><td>Thermo Forma370</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>R& D Systems, ארה"ב</td><td>1124F</td><td></td></tr><tr><td>CD11c</td><td>R& D Systems, ארה"ב</td><td>N418</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים</td><td>Thermo Forma, ארה"ב</td><td>174926</td><td></td></tr><tr><td>ליפוזומי קלודרונאט&nbsp;</td><td>ליפוזומי קלודרונאט, הולנד</td><td>CI-150-150</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז A</td><td>Sigma-Aldrich, ארה"ב</td><td>10103578001</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>R& D Systems, ארה"ב</td><td>521204</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאי פלקון</td><td>בקטון, דיקינסון ושות', ארה"ב</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>טכנולוגיות חיים, ארה"ב</td><td>1047571</td><td></td></tr><tr><td>המטוקסילין אאוזין&nbsp;</td><td>נאנג'ינג Jiancheng טכנולוגיה, סין</td><td>06-570</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 PCR זיהוי מערכת</td><td>רוש, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גורם רקומביננטי עכברי IL-33</td><td>פפרוטק, ארה"ב</td><td>210-33</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניקון</td><td>תאגיד ניקון, יפן</td><td>941185</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין, סטרפטומיצין</td><td>טכנולוגיות חיים, ארה"</td>ב <td>877113</td><td></td></tr><tr><td>פוספט מאגר (PBS)</td> <td>גואנגדונג Huankai טכנולוגיה מיקרוביאלית, סין</td><td>1535882</td><td></td></tr><tr><td>RBC מאגר ליזה</td><td>Beyotime Biotechnology Company, סין</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>RNA מבודד</td><td>Vazyme חברה, סין</td><td>R401-01-AA</td><td>סה"כ RNA מיצוי ריאגנט</td></tr><tr><td>RWD מכונת הרדמה אינהלציה</td><td>שנזן Rayward Life Technology, סין</td><td>R500</td><td></td></tr><tr><td>פרפין חצי אוטומטי slicer</td><td>Leica, גרמניה</td><td>LeicaRM2245</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq</td><td>Takara, יפן</td><td>410800</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.25%</td><td>Life Technologies, ארה"ב</td><td>1627172</td><td></td></tr></tbody></table>

העברה מאומצת של מקרופאגים מעוררי il-33 למודלים של עכברים הנגרמים על ידי בלומיצין כדי לחקור את השפעתם על פיברוזיס ריאתי אידיופתי in vivo

Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

התגובה הדלקתית הנגרמת על ידי פגיעה ריאתית מוקדמת היא אחד הגורמים החשובים להתפתחות פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF), המלווה בהפעלת תאים דלקתיים כגון מקרופאגים ונויטרופילים, כמו גם שחרור של גורמים דלקתיים כולל TNF-α, IL-1β ו- IL-6. דלקת מוקדמת הנגרמת על ידי מקרופאגים אינטרסטיציאליים ריאתיים פעילים (IMs) בתגובה לגירוי IL-33 ידועה כממלאת תפקיד חיוני בתהליך הפתולוגי של IPF. פרוטוקול זה מתאר העברה מאומצת של IMs שעוררו IL-33 לריאות של עכברים כדי לחקור את התפתחות IPF. היא כוללת בידוד ותרבית של IMs ראשוניים מריאות עכבר מארח, ולאחר מכן העברה מאומצת של IMs מעוררים לתוך alveoli של עכברים מושתלי IPF המושרה על ידי בלומיצין (BLM) (אשר כבר רוקנו בעבר מקרופאגים alveolar על ידי טיפול עם ליפוזומים clodronate), ואת ההערכה הפתולוגית של עכברים אלה. התוצאות המייצגות מראות כי העברה מאומצת של מקרופאגים מעוררי IL-33 מחמירה פיברוזיס ריאתי בעכברים, דבר המצביע על כך שהקמת ניסוי העברת המקרופאגים המאמצת היא אמצעי טכני טוב לחקר פתולוגיה של IPF.

הפרוטוקול המשמש כאן מסוכם בתרשים הזרימה באיור 1. שאיפת ליפוזומים קלודרונט דרך האף (איור 2) שימשה לדלדול המקרופאגים הריאתיים של עכברי C57BL/6 בוגרים, וזה יצר מודל טוב של עכבר מושתל. בדיקות מיידיות ריאתיות בודדו מעכבר אחר (מארח) שלא טופל (איור 3A,B) וגודלו בתרבית חוץ גופית. המקרופאגים שבודדו עוררו באמצעות IL-33 במשך 24 שעות, ולאחר מכן הוחדרו תוך קנה הנשימה לעכברים המקבלים (איור 3C</stron...

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של מקרופאגים אינטרסטיציאליים ריאתיים (IMs) ואת העברתם המאומצת לאחר גירוי IL-33 של נאדיות הריאה במודל עכבר, אשר יכול להקל על מחקר in vivo של פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF).

העברה מאומצת של מקרופאגים מעוררי IL-33 למודלים של עכברים הנגרמים על ידי בלומיצין כדי לחקור את השפעתם על פיברוזיס ריאתי אידיופתי in vivo

The inflammatory response caused by early lung injury is one of the important causes of the development of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), which is ...

הפרוטוקול מתאר את הבידוד של IMS ריאתי והעברה מאומצת לאחר קביעת IL-33 במודל עכבר, אשר יכול להקל על מחקר in vivo של פיברוזיס ריאתי אידיופתי. הטכניקה מאפשרת לחוקרים לחקור את תפקודם של המקרופאגים, המדמים ציטוקינים מסורתיים בפיתוח IPF. כדי להתחיל, להוציא את בקבוקון של ליפוזומים clodronate מהמקרר.תנו לו להתחמם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר והפכו מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב אחיד. שאפו 60 מיקרוליטר של ליפוזומים קלודרונט באמצעות פיפטה עם קצה יניקה סטרילי. לנהל את הבקרה ואת התרופה טיפה חכם לתוך חלל האף של העכבר מורדם.לאחר כל טיפה, ודא שהעכבר שואף את התרופה לחלוטין ונושם באופן שווה. לאחר דלדול המקרופאגים בנאדיות בעכבר המקבל, התחל על ידי חיטוי העור של העכבר המארח מורדם עם 75% אלכוהול ויוד. השתמש מספריים לחתוך דרך העור ולחשוף את רקמת cardiopulmonary.שואפים 10 מיליליטר של PBS במזרק מצויד מחט 20 מד, ולהכניס את קצה המחט לתוך אטריום ימין של העכבר. לאחר מכן לחתוך את נבוב הווריד הנחות של העכבר עם מספריים כירורגיים ידנית לבלבל את העכבר עם PBS במהירות קבועה של 10 עד 20 מיליליטר לדקה עד רקמת הריאה הופך לבן. יתר על כן, הבלו את רקמת הריאה ולהעביר אותו PBS קר כקרח בצלחת תרבית.חותכים את רקמת הריאה לשברים ומוסיפים 15 מיליליטר של מדיום DMEM המכיל 1% collagenase A כדי לבודד את המקרופאגים, ואז לדגור אותו ב 100 סל"ד במשך 30 דקות על שולחן רעד 37 מעלות צלזיוס. שאפו את מתלה רקמת הריאה בערך 20 פעמים דרך מזרק 10 מיליליטר כדי לעשות את זה בסדר. סנן את המתלה דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר.צנטריפוגה את התסנין ב 400 גרם במשך 10 דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, ליז את הדם האדום עם שלושה מיליליטר של חיץ ליזה התאית על קרח במשך שתיים עד שלוש דקות. צנטריפוגה ב 150 גרם במשך חמש דקות להשעות מחדש את גלולת התא ב 10 מיליליטר של DMEM.לאחר מכן לספור את התאים באמצעות hemocytometer. זרעו את התאים לצלחת תרבית תאים דבקה בקוטר 10 ס"מ ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% כדי להצמיד את המקרופאגים הבין-תאיים של הריאה לכלים. לאחר שעה, שאפו את התאים העליונים והצפים.מוסיפים 10 מיליליטר של מדיום התרבית הטרי והשלם ודוגרים במשך יותר משמונה שעות או לילה. כדי לעורר את המקרופאגים הבין-תאיתיים המבודדים, החלף את מדיום התרבית המשומש באינטרלוקינים בינוניים שלמים 33. כמו כן להכין צלחת בקרה על ידי הוספת PBS במקום interleukins 33.לדגור על הצלחות במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כדי לנתק את המקרופאגים interstitial ריאתי, לטפל בהם עם מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין במשך חמש דקות. לאחר מכן מוסיפים שלושה מיליליטר של תרבית טרייה מדיום שלם כדי להרוות את העיכול וצנטריפוגה את תרחיף התא כדי לקצור את המקרופאגים הריאתיים.לאחר ספירת התאים, יש להשהות מחדש את התאים ב-PBS לריכוז סופי של חמש פעמים 10 לתאים החמישיים ל-50 מיקרוליטר. כדי להתחיל את ההעברה של מקרופאגים interstitial, לתקן את הגפיים של העכבר מקבל מורדם על צלחת אנכית עם סרט רפואי בעדינות למשוך את הלשון של העכבר לצד אחד, באמצעות צמר גפן. לאחר הפעלת מנורת האינטובציה, להאיר אותו על הגרון של העכבר כדי לראות את קנה הנשימה, אשר צריך להיות קרוב לבסיס הלשון.הכנס את צינורית מחט הבית לקנה הנשימה באמצעות מנורת אינטובציה 22 מד וחוט מנחה בקוטר 0.4 מילימטר. כדי לסיים את האינטובציה, להסיר את חוט המדריך ולדחוף את הצינורית לתוך קנה הנשימה של העכבר. כעת הזריקו 50 מיקרוליטר של תרחיף התא לעכבר המקבל דרך קנה הנשימה כאשר הצינורית נראית נכנסת לקנה הנשימה.לאחר 24 שעות, מתן בלומיצין דרך קנה הנשימה כדי לגרום לפיברוזיס ריאתי אידיופתי. כמו כן לתת נפח שווה של מלוחים לקבוצת הביקורת. לאחר 21 יום, לקבוע את מידת החומרה של פיברוזיס ריאתי על ידי הערכת הביטוי של סמנים עבור פיברוזיס ואת ציוני Ashcroft.צביעת HE הראתה כי העברה מאומצת של מקרופאגים מעוררי אינטרלוקין 33 החמירה את מידת הרס רקמת הריאה והגדילה את צבירת הפיברובלסטים בעכברים שעוררו בלומיצין, בהשוואה לקבוצת הביקורת. העלייה בציון אשקרופט ממחישה גם את מידת הפיברוזיס הריאתי. רמות הביטוי של mRNA של אלפא SMA ופיברונקטין ברקמות הריאה של העכבר המקבל שהכילו אינטרלוקינים שהועברו באימוץ מקרופאגים אינטרסטיציאליים 33 וטופלו בבלומיצין היו גבוהות יותר, בהשוואה לאלה של עכברי הבר שטופלו ב-BLM.500 מיקרוליטר אוויר צריך להיות נכנס מיד לתוך הריאות עם מזרק 1 מילימטר כדי להבטיח כי השעיית התא בצינורית יכול להיכנס לחלוטין לרקמת הריאה.

adoptive-transfer-il-33-stimulated-macrophages-into-bleomycin-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים הדמיה גישה המבוססת על מיקרו-CT וקרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית להערכת האורך של המודל פיברוזיס הריאות העכבר המושרה על ידי החדרה intratracheal כפול של bleomycin יחידנית או פולשני משולבת.

יחידנית או משולבת הדמיה גישה המבוססת על מיקרו-CT וקרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית להערכת האורך של ריאות הנגרמת Bleomycin פיברוזיס בעכברים

אנו מתארים שיטה כדי לשפר באופן משמעותי את engraftment orthotopic של סרטן ריאות תאים לריאות מאתר על ידי מיזוג מראש את דרכי הנשימה עם פציעה. גישה זו ויכול להיות מיושם גם ללמוד אינטראקציות סטרומה בתוך הריאות microenvironment, הפצתו גרורתי, morbidities משותף של סרטן ריאות, לייצר ביעילות רבה יותר החולה נגזר xenografts.

מיזוג מראש את דרכי הנשימה של עכברים עם Bleomycin מגדיל את היעילות של Orthotopic ריאות סרטן תא Engraftment

כאן אנו מציגים שיטה יעילה כדי לחקור את הפעילות האנטיפיברוטית של תאים בעלי מזון מסטרומה האנושית מתוך הגוף הפנימי שהתקבלו מן החבל הטבור כולו בעקבות אינדוקציה של פגיעה בריאה על ידי הזרקה אנדוקנה של ליאומיצין ב C57BL /6 עכברים. פרוטוקול זה ניתן להרחיב בקלות לבדיקה טרום קלינית של therapeutics אחרים.

אינדוקציה של פגיעה בריאות העכבר על ידי הזרקת אנדוקנה של ליאומיצין

מודלים שונים של בעלי חיים של פיברוזיס ריאתי הוקמו באמצעות בלומיצין כדי להבהיר את הפתוגנזה של פיברוזיס ריאתי ולמצוא מטרות תרופות חדשות. עם זאת, רוב המודלים פיברוזיס ריאתי המכוונים לרקמת הריאה יש מתן תרופות לא אחיד. כאן, אנו מציעים מודל של פיברוזיס ריאתי אחיד המושרה על ידי nebulization בלומיצין האף.

מודל עכבר של פיברוזיס ריאתי המושרה על ידי נבוליזציה של בלומיצין באף

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (מיקרו-CT) כדי לכמת אזורים מאווררים במודל פיברוזיס ריאתי חד צדדי המושרה על ידי בלאומיצין באמצעות החדרה תוך קנה הנשימה בצד הנגע.

ניתוח נפח ריאות חד צדדי באמצעות מיקרו-CT להערכה משופרת של פיברוזיס ריאתי במודלים פרה-קליניים

פרוטוקול זה מדגים את טכניקת השאיפה האורופרינגיאלית לשימוש במודל עכברי הבלאומיצין של פיברוזיס ריאתי.

מתן אורו-לוע של בלאומיצין במודל העכברי של פיברוזיס ריאתי

טיפול תאי מציע התערבות מבטיחה לפיברוזיס ריאתי על ידי שימוש בתאי אב לתיקון רקמות פגועות ושיפור תפקוד הריאות. מכיוון שהדמיה ממלאת תפקיד מרכזי במעקב אחר אינטגרציה של תאים, כאן, אנו מתארים הדמיה מונחית חלקיקים מגנטיים מעקב in vivo של טיפול תאי בפיברוזיס ריאתי במודל עכבר.

מעקב In Vivo מונחה תמונה של תאי אב אפיתל ריאה דיסטליים מושתלים לפיברוזיס ריאתי באמצעות הדמיית חלקיקים מגנטית

פרוטוקול זה מתאר שיטה להשראת פיברוזיס ריאתי בעכברים באמצעות מתן חוזר ונשנה של בלאומיצין, המניב מאפיינים פתולוגיים הדומים מאוד לאלה של פיברוזיס ריאתי אידיופטית.

מודל עכברי מעודן של פיברוזיס ריאתי אידיופטי

כאן אנו מציגים פרוטוקול למידול פיברוזיס ריאתי בעכברים באמצעות בלומיצין אירוסולי המועבר דרך קנה הנשימה. שיטה אופטימלית זו מאפשרת מסירה אחידה, כמותית ומדויקת ללא חתך כירורגי, ומשפרת את השחזור והאמינות של פיברוזיס הנגרמת על ידי בלומיצין.

שיטה משופרת מבוססת אירוסולים להעברת בלומיצין תוך-קנה הנשימה למודלים של עכברים ניתנים לשחזור ומינימום פולשני של פיברוזיס ריאתי

גרורות הריאה ניסיוניים מודל CTL עכבר חיסוני לניתוח האינטראקציה תאים סרטניים...

גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר

חקור העברה מאומצת של מקרופאגים ריאתיים מעוררי IL-33 במודל עכברים עם בלומיצין לחקר פיברוזיס ריאתי אידיופתי. שיטה זו מאפשרת לבודד מקרופאגים ולחקור את תפקידם במחלות ריאה.

העברה מאומצת של מקרופאגים מעוררי IL-33 למודלים של עכברים הנגרמים על ידי בלומיצין כדי לחקור את השפעתם על פיברוזיס ריאתי אידיופתי in vivo (וידאו) | JoVE Journal

העברה מאומצת של מקרופאגים מעוררי IL-33 למודלים של עכברים הנגרמים על ידי בלומיצין כדי לחקור את השפעתם על פיברוזיס ריאתי אידיופתי in vivo

גלה סרטונים נוספים