התגבשות חלבון בתפוקה גבוהה באמצעות מיקרודיאליזה
3 במרץ 2023
הפרוטוקול המוצג מתאר גישה פשוטה לסינון תנאי התגבשות חלבונים וגדילת גבישים באמצעות צלחת דיאליזה בעלת תפוקה גבוהה של 96 בארות. השימוש בשפופרות דיאלייזר לגידול בקנה מידה גדול של מיקרו-גבישים מודגם גם עבור קריסטלוגרפיה טורית ויישומי MicroED.
התגבשות על ידי דיאליזה היא שיטה לא מנוצלת. פרוטוקול זה מציג גישה נובו לכך, אשר תגדיל את מגוון אסטרטגיות ההתגבשות הקיימות כיום לקביעה מובנית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא בעלת תפוקה גבוהה, פשוטה להתקנה ללא צורך בציוד מיוחד, ומאפשרת ניטור קל של צמיחת גבישים.
האדם המבצע טכניקה זו חייב להיות נוח עם pipetting נפח נמוך באמצעות פיפטות רב ערוציות. יש להקפיץ את הטיפות בצורה מספקת ככל האפשר כדי למנוע התייבשות חלקית. כדי להגדיר את ניסוי המיקרודיאליזה, הניחו צלחת מיקרודיאליזה מסחרית של 96 בארות בכיוון צד החלבון כלפי מעלה והסירו את סרט הכיסוי הדביק על ידי קילוף ספייסר הדבק בלחץ 200 מיקרון.
לאחר קילוף סרט הכיסוי הדביק, שים לב למיקום של באר A1. לאחר מכן, באמצעות פיפטה רב ערוצית, לטעון מקסימום של 3.2 מיקרוליטר של דגימת חלבון מוכן כראוי לתוך כל באר. מקם כראוי את סרט כיסוי UV של 200 מיקרון מעל צלחת 96 בארות כאשר הסרט פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, כדי להפעיל ולאטום את דבק הלחץ, לחץ על סרט כיסוי UV באמצעות משוט איטום ובדוק את תקינותו.
כעת, הפוך את הצלחת כדי להביא אותה לכיוון צד החיץ כלפי מעלה ושים לב למיקום המראה של הבאר המסומנת A1. באמצעות פיפטה רב ערוצית, לטעון מקסימום של 350 מיקרוליטר של תמיסת הדיאליזה לתוך כל באר של הצלחת בזהירות לאטום את הבארות עם סרט כיסוי המאגר. לאחר מכן, הניחו את הצלחת בכיוון צד החיץ כלפי מעלה בתוך אינקובטור מבוקר טמפרטורה מתאים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס כדי לאפשר צמיחת גביש. כדי לבחון את היווצרות הגביש מתחת למיקרוסקופ, הסר את סרט הכיסוי המגן מסרט כיסוי UV של 200 מיקרון והנח את הצלחת מתחת לעינית כאשר צד החלבון פונה כלפי מעלה.
כדי להקים ניסוי התגבשות בקנה מידה גדול, אמצו את התנאים שבהם התרחשה צמיחת מיקרו-גבישים בלוח המיקרודיאליזה ושחזרו את אותם תנאים במיכלים גדולים. בחר את גודל המיכל בהתאם לנפח תמיסת הדיאליזה. פיפטה בנפח מרבי של 500 מיקרוליטר דגימת חלבון לתוך צינור הדיאליזר לפני אטימת הצינור באמצעות מכסה הפלסטיק האדום.
הניחו את צינור הדיאליזר האטום בנפח 500 מיקרוליטר במדף הצף בתוך המיכל המלא בתמיסת דיאליזה. לאחר מכן, הניחו את המיכל ללא הפרעה בתוך אינקובטור מתאים מבוקר טמפרטורה ב 20 מעלות צלזיוס כדי להשיג צמיחה גבישית. כדי לבדוק היווצרות של גבישים, פיפטה אחד עד שני מיקרוליטר של התמיסה מן dialyzer על שקופית כיסוי זכוכית.
כסו את התמיסה בשקופית זכוכית נוספת וצפו בה תחת מיקרוסקופ. תמונות שצולמו באמצעות מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה גבוהה הראו היווצרות מוצלחת של מיקרו-גבישים של ארבעה חלבונים באמצעות לוחות מיקרודיאליזה עם ממברנות חיתוך משקל מולקולרי של 10 קילודלטון. ליזוזים נמצא כיוצר גבישים כאשר הוא מחויג כנגד נתרן אצטט מולארי 0.1 ב-pH 4 המכיל תוספים מתאימים.
דומאטין יצר גבישים כאשר חוגגו כנגד פרופאן ביס-טריס מולארי 0.1 ב-pH 6.6 המכיל תוספים מתאימים. תנאי דיאליזה אופטימליים הובילו להיווצרות מיקרו-גבישים על ידי חלבוני הממברנה, כלומר חלבון משאבת השטף הרב-תרופתי E.coli AcrB וטרנספורטר הלקטוז E.coli LacY. התגבשות בקנה מידה גדול בצינורות הדיאליזר תוך שימוש בתנאי הדיאליזה האופטימליים שהתקבלו מניסויי המיקרודיאליזה הובילה להיווצרות אלפי מיקרו-גבישים לכל אחד מהחלבונים.
לצורך התגבשות של פומיטין, 250 מיקרוליטר של חלבון היה dialyzed מול 50 מיליליטר של תמיסת דיאליזה. עבור AcrB, 250 מיקרוליטר של החלבון חוגו כנגד 25 מיקרוליטר של תמיסת דיאליזה. גם התגבשות LacY נקבעה באותו יחס, עם 100 מיקרוליטר חלבון ל-10 מיליליטר תמיסת דיאליזה.
בעת היפוך הצלחת לצד החיץ כלפי מעלה, חשוב לשים לב למיקום של A1, כך שניתן יהיה לחלק פתרונות ממסך ההתגבשות בהתאם. הגבישים המתקבלים משיטה זו יכולים לשמש ליישומים במורד הזרם, כגון קריסטלוגרפיה טורית ומיקרו ED.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה בתפוקה גבוהה לסינון תנאי גיבוש חלבונים באמצעות צלחת מיקרודיאליזה של 96 באר. הוא מדגים את גידול המיקרו-גבישים ליישום בקריסטלוגרפיה סדרתית ו-MicroED.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- גיבוש חלבונים
- ביולוגיה מבנית
- טכניקות קריסטלוגרפיה
רקע
- גיבוש על ידי דיאליזה הוא שיטה פחות נפוצה בגיבוש חלבונים.
- גישה זו משפרת את מגוון אסטרטגיות הגיבוש הזמינות.
- היא מועדפת בשל פשטותה ויכולת התפוקה הגבוהה שלה.
- ניטור של גידול גבישים הוא פשוט עם שיטה זו.
מטרת המחקר
- להציג גישה חדשנית לגיבוש חלבונים.
- להקל על גידול בקנה מידה גדול של מיקרו-גבישים.
- לייעל תנאים ליישומים של קריסטלוגרפיה סדרתית ו-MicroED.
שיטות בשימוש
- שימוש בצלחת מיקרודיאליזה של 96 באר לצורך גיבוש.
- טעינת דגימות חלבון ופתרונות דיאליזה לבארות.
- דגירה בטמפרטורה מבוקרת לצורך גידול גבישים.
- בדיקה מיקרוסקופית של היווצרות גבישים.
תוצאות עיקריות
- היווצרות מוצלחת של מיקרו-גבישים עבור חלבונים מרובים.
- תנאים מותאמים הובילו לאלפי מיקרו-גבישים.
- תנאים ספציפיים לליזוזים, דומטין, AcrB, ו-LacY זוהו.
- ניתן להשתמש בגבישים שנוצרו ליישומים נוספים.
מסקנות
- השיטה מספקת דרך אמינה לסינון תנאי גיבוש.
- היא מאפשרת קלות בהגדלת ניסויי הגיבוש.
- הגישה מועילה לקביעת מבנה החלבונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-throughput protein crystallization via microdialysis enables rapid screening of crystallization conditions, supporting structural biology and drug discovery pipelines. This workflow increases predictive confidence in structure-based target validation and accelerates the transition from discovery to preclinical research. The approach is scalable, robust, and compatible with downstream applications such as serial crystallography and MicroED.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates rapid interrogation of protein structure-function relationships for target validation.
- Enables mechanistic de-risking by providing atomic-resolution structural data.
- Supports portfolio triage by identifying tractable targets through structural insights.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein crystals for downstream screening and biophysical assays.
- Standardizes crystallization conditions using SBS-compatible 96-well plates for reproducibility.
- Enables scalable production of microcrystals for high-throughput screening platforms.
- Supports reliable evaluation of protein-ligand interactions in structure-based drug design.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data with disease-relevant protein targets for translational biomarker development.
- Ensures continuity from discovery-stage structural elucidation to preclinical validation studies.
- Reduces risk in advancing candidates by providing robust structural evidence.
Pipeline & Workflow Integration
This microdialysis-based crystallization method integrates seamlessly from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting iterative structure-guided optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification through high-throughput structural analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers high-quality crystals suitable for X-ray and electron diffraction measurements.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by supporting biomarker and target validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable platform for repeated use across diverse protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable crystallization workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust structural insights early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein handling and low-volume pipetting techniques.
- Needs access to standard crystallization laboratory infrastructure and microscopy for monitoring.
- Demands cross-team standardization for plate setup and data interpretation.
- Adaptable to a wide range of protein classes, including membrane proteins, as demonstrated.
- Limited by protein solubility and stability under dialysis conditions as noted in the protocol.
