Name: במבחנה חקר ההשפעות של מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן על נדידת תאי קרסט עצביים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: חקור נדידת תאי קרסט עצביים במטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן באמצעות מודל במבחנה. שיטה זו מאפשרת הערכת הידבקות תאים, נדידה ופירוק HA לאורך זמן, ומספקת פלטפורמה לסינון תרופות המשפיעות על תהליכי הפירוק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אני מביע תודה רבה לפומיטושי איירי ויו ימאגוצ'י על עידודם והצעותיהם האדיבות בביסוס שיטה זו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים לתוכניות מחקר מדעי מהאגודה היפנית לקידום המדע (#19KK0232 ל- T.I., #20H03896 ל- T.I). השיטה המקורית לציפוי HA על מצעי זכוכית ומבחני פירוק HA באתרם על המצע תוארה ב- Yamamoto et al. (2017)8, ואילו השיטה להכנת מצעים מעורבים HA/Col1 תוארה ב- Irie et al. (2021)7.

כל הנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של בית הספר למוסמכים של אוניברסיטת אוסקה לרפואת שיניים.
1. תרבות של עכבר גולגולתי עצבי crest תאים
הערה: קו תאי הפסגה העצבית ששימש במחקר זה כולל תאי O9-1, שמקורם ב-Wnt1-Cre; תאים המבטאים R26R-GFP שבודדו מעוברי עכבר E8.512 (ראו דיון). השיטה המתוארת כאן לגידול תאי O9-1 עוקבת אחר פרוטוקול13 שנקבע בעבר.
<ol><li>הכינו את הצלחת מצופה המטריצה של קרום המרתף.<ol><li>הפשירו את מטריצת קרום המרתף (ראו טבלת חומרים) על קרח. לדלל את המטריצה 1:50 ב 1x PBS מקורר, ולשמור על קרח.</li>
		<li>מצפים צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ ב-10 מ"ל של תמיסת מטריצת קרום מרתף מדוללת. דוגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה, ושאפו את המטריצה לפני השימוש.</li>
		<li>לשטוף את הצלחת 3x עם 2 מ"ל של PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>תאי תרבית O9-1 על הצלחת המצופה מטריצה של קרום המרתף.<ol><li>יש לחמם את תא הגזע העוברי המלא (ES) (ראו טבלת חומרים) באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.</li>
		<li>ערבב בעדינות את תרחיף התאים O9-1 (ראה טבלת חומרים) וספור את מספר התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי (ראה רשימת חומרים). כוונן את ריכוז התא ל- 1.1 × 106/מ"ל עם תווך תאי ES מלא.</li>
		<li>הוסף 8 מ"ל של תווך תאי ES שלם שחומם מראש לצלחת התרבית המצופה מטריצה בקוטר 10 ס"מ, וזרע את תאי O9-1 בגודל 1.1 x 106 תאים לצלחת. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח של 5% CO2 .</li>
		<li>למחרת, החלף את המדיום בתווך תאי ES מלא טרי (מחומם מראש ל-37°C). יש להחליף במדיום טרי כל 2-3 ימים לאחר מכן. הערה: כאשר התאים הם בערך 80% confluent (3-4 ימים לאחר ציפוי), הם יכולים להיות מנותקים עם 0.25% טריפסין-EDTA ולהעביר הלאה או להקפיא לשימוש מאוחר יותר. תמונות מייצגות של תאי O9-1 מוצגות באיור 1.</li>
		<li>שטפו את צלחת התרבית עם 2 מ"ל של 1x PBS לפני טריפסיניזציה. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA שחומם מראש ודגר במשך 5 דקות ב 37 ° C. בדוק ניתוק תאים מלא; טפחו בעדינות על צד הצלחת כמה פעמים במידת הצורך.</li>
		<li>הוסף 2 מ"ל של תווך תאי ES שלם שחומם מראש לצלחת התרבית והעבר את התאים המנותקים לצינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 5 דקות.</li>
		<li>השליכו את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא. לאחר מכן, הוסף 2 מ"ל של תווך תאי ES שלמים שחוממו מראש לצינור, והשהה מחדש את התאים ביסודיות על ידי צנרת. זרעו את התאים על צלחת תרבית חדשה בצפיפות התאים הרצויה.</li>
		<li>לחלופין, הכינו מלאי תאים קפואים על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום הקפאת תאים המכיל 10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לצינור במקום תווך תאי ES שלם והשעיה יסודית של התאים. העבירו את תרחיף התא לצינורות הקפאה, ואחסנו בטמפרטורה של -80°C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנת התבשיל המצופה HA/Col1
הערה: השיטה המקורית של ציפוי HA/Col1 על כלים בעלי תחתית זכוכית הוצעה על ידי Irie et al.7.
<ol><li>הוסיפו בזהירות 50 מיקרוליטר של טריאתוקסיסילן לא מדולל לצלחת בעלת תחתית זכוכית בקוטר 3.5 ס"מ (ראו טבלת חומרים). יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולהגן מפני אור. הערה: הדגירה עם triethoxysilane לא יעלה על 5 דקות. זה עלול להשפיע על יעילות הציפוי ולייצר מוצרים לא רצויים.</li>
	<li>לשטוף את המנה במהירות 3x עם 2 מ"ל של מים מזוקקים. הוסיפו 50 μL של 0.25% גלוטראלדהיד, מדולל פי 100 ב-PBS, לכל מנה, ודגרו ב-RT למשך 30 דקות.</li>
	<li>יש לשטוף במהירות 4x עם 2 מ"ל של PBS. לאחר מכן, מצפים את הכלים עם 300 μL של קולגן מסוג I ב 0.2 N חומצה אצטית ב RT במשך 1 שעה.</li>
	<li>לשטוף במהירות 3x עם 2 מ"ל של PBS. יש להוסיף 300 μL של 200 מיקרוגרם/מ"ל נתרן היאלורונאט-H2 (FAHA-H2) עם תווית פלואורסציינמין (מדולל ב-PBS) לכל מנה ולדגור למשך הלילה ב-RT. יש לשטוף שוב 3x עם 2 מ"ל PBS. לאחר שאיפת PBS, לייבש את הצלחת באוויר במשך 5 דקות על ספסל נקי. הערה: FAHA-H2 הוא נתרן היאלורונט עם תווית פלואורסציינמין עם משקל מולקולרי ממוצע שנע בין 1,200-1,600 KDa. HA של משקל מולקולרי מתאים ניתן להשתמש על פי תכנון המחקר.</li>
</ol>3. בדיקת נדידה על צלחת מצופה HA/Col1
הערה: בדיקה מבוססת סגירת פצע באמצעות מרווחים מוגדרים של 500 מיקרומטר ללא תאים במצעי Col1/HA בוצעה באמצעות תוספות תרבית של 2 בארות (ראה טבלת חומרים). תאי O9-1 מבטאים את Tmem2, אשר נדרש להידבקות ולפירוק של חומצה היאלורונית בחלל החוץ-תאי9 (איור 2 ואיור 3).
<ol><li>לאחר ייבוש צלחת תחתית הזכוכית המצופה מחברים את תוספות התרבית 2 בארות לכלים, וממלאים את התוספות חיצונית עם 1 מ"ל של PBS.</li>
	<li>זרעו את תאי O9-1 לתוך הבארות ב 1 x 104 תאים ב 100 μL של מדיום הנשר המעובד של Dulbecco (DMEM) המכיל 2% סרום בקר עוברי (FBS) לכל תוספת. תרבית את התאים במשך 2 ימים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 לח.</li>
	<li>מוציאים את התוספות בזהירות מהכלים המצופים בתחתית הזכוכית בפינצטה. שטפו בעדינות את הכלים המצופים בתחתית הזכוכית עם 2 מ"ל של 1x PBS כדי להסיר את התאים ואת פסולת התא. הוסף 2 מ"ל של DMEM טרי המכיל 2% FBS לתוך מנות התרבית.</li>
	<li>צלם תמונות עם ניגודיות פאזה כעת כנקודת זמן התחלה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי All-in-One במצב מונוכרום עם הגדרות ברזולוציה גבוהה (רווח של 6 dB, ללא binning). במחקר זה נעשה שימוש בעדשות אובייקטיביות עם הגדלות של פי 4 עד פי 20 לצורך הדמיה (ראו טבלת חומרים). הערה: לכוד את התמונות עם ניגודיות הפאזה עם פסי קנה המידה המתאימים ושמור אותן בתבנית TIFF.</li>
	<li>תרבית את התאים במשך 48 שעות נוספות ב 37 ° C ו 5% CO2. צלם תמונות עם ניגודיות פאזה בתרבית של 24 שעות ו-48 שעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב-תכליתי.</li>
	<li>תקן את התאים ב 48 שעות עם 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. לאחר מכן, לשטוף את הכלים 3x במשך 5 דקות כל אחד עם 1 מ"ל של PBS טרי.</li>
	<li>הניחו תלוש כיסוי עם אמצעי הרכבה (ראו טבלת חומרים) לתצפית מורפולוגית נוספת. הערה: ניתן לצלם את הכלים באופן מיידי או לאחסן עד חודשיים בטמפרטורה של 4°C.</li>
	<li>אופציונלי: סימון חיסוני של התאים לחלבונים מעניינים. הערה: פרוטוקול לזיהוי קומפלקס הידבקות מוקד (FA) באמצעות נוגדן חד-שבטי אנטי-וינקולין שמקורו בעכבר (ראה טבלת חומרים) מתואר כאן כדוגמה.<ol><li>דוגרים על הכלים (משלב 3.6) עם 0.5 מ"ל של חיץ חוסם (5% סרום עיזים רגיל ב-PBS) למשך 60 דקות. הערה: בחר מאגר חסימה מתאים עבור הנוגדן הראשי. חיץ חוסם טיפוסי יהיה 5% סרום נורמלי מאותו מין כמו הנוגדן המשני בשימוש.</li>
		<li>הכינו את הנוגדן הראשוני המדולל במאגר דילול נוגדנים (1% סרום עיזים תקין ב-PBS). לדגור את הכלים עם 0.5 מ"ל של נוגדן ראשוני מדולל לילה ב 4 °C (75 °F). הערה: בחר את מאגר דילול הנוגדנים המתאים. בדרך כלל, הנוגדן משמש בדילול 1:50-1:200.</li>
		<li>יש לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 2 מ"ל של PBS. הכינו את הנוגדן המשני נגד עכבר שמקורו בעז מדוללת במאגר דילול הנוגדנים (1% סרום עיזים תקין ב-PBS). לדגור את הכלים עם 0.5 מ"ל של נוגדן משני מדולל במשך 1-3 שעות בטמפרטורת החדר. הערה: בדרך כלל, הנוגדן המשני משמש בדילול של 1:500-1:1,000. DAPI יכול לשמש להכתמת הגרעינים.</li>
		<li>יש לשטוף 3 פעמים עם 2 מ"ל PBS במשך 5 דקות בכל פעם. מניחים את הכיסוי עם 50 μL של אמצעי הרכבה. הערה: ניתן לצלם את הכלים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי All-in-One עם מסנן GFP (עירור: 470/40, פליטה: 525/50) ומסנן TexasRed (עירור: 560/40, פליטה: 630/75) במצב מונוכרום עם הגדרות ברזולוציה גבוהה (רווח ב 6 dB, ללא binning). במחקר זה נעשה שימוש בעדשות אובייקטיביות עם הגדלות של פי 4 עד פי 20. הערה: ניתן לאחסן את השקופית עד חודשיים ב- 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>פתח את תוכנת ImageJ 1.51s. בחלון ImageJ, בחר File > Open משורת התפריטים כדי לפתוח את קובץ התמונה שנשמר.</li>
	<li>לקביעת קנה המידה, ציירו קו באותו מרחק כמו סרגל קנה המידה. עבור אל נתח > הגדר קנה מידה והקלד את המרחק והיחידות הידועים של הקו בתיבות המתאימות בחלון הגדר קנה מידה .</li>
	<li>צייר קו ישר בין המרווח בין התאים והקש Analyze > Measure כדי להעביר את הערכים לחלון נתונים. מדדו לפחות חמישה מיקומים שונים בכל מדגם, וערכו ממוצע של המרחקים כדי לקבל את נתוני המדגם המייצגים. בצע את הניתוחים הסטטיסטיים באמצעות תוכנה מתאימה (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>

<ol><li>Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+switches+in+mammalian+neural+crest+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326(2013).</li>
<li>Casini, P., Nardi, I., Ori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+is+required+for+cranial+neural+crest+cells+migration+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development.</a> Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).</li>
<li>Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versican+is+selectively+expressed+in+embryonic+tissues+that+act+as+barriers+to+neural+crest+cell+migration+and+axon+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth.</a> Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).</li>
<li>Camenisch, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+hyaluronan+synthase-2+abrogates+normal+cardiac+morphogenesis+and+hyaluronan-mediated+transformation+of+epithelium+to+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).</li>
<li>Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart-valve+mesenchyme+formation+is+dependent+on+hyaluronan-augmented+activation+of+ErbB2-ErbB3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors.</a> Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).</li>
<li>Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+hyaluronan+synthase-2+in+craniofacial+and+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development.</a> Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).</li>
<li>Irie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+surface+hyaluronidase+TMEM2+regulates+cell+adhesion+and+migration+via+degradation+of+hyaluronan+at+focal+adhesion+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100481(2021).</li>
<li>Yamamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+homolog+of+the+zebrafish+transmembrane+protein+2+%28TMEM2%29+is+the+long-sought-after+cell-surface+hyaluronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).</li>
<li>Inubushi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+surface+hyaluronidase+TMEM2+plays+an+essential+role+in+mouse+neural+crest+cell+development+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival.</a> PLoS Genetics. 18 (7), 1009765(2022).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51046(2014).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).</li>
<li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li>
<li>Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+manipulation+of+O9-1+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Humphries, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinculin+controls+focal+adhesion+formation+by+direct+interactions+with+talin+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin.</a> Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).</li>
<li>Perris, R., Perissinotto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+extracellular+matrix+during+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration.</a> Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).</li>
<li>Perris, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+changes+in+the+distribution+of+proteoglycans+during+avian+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development.</a> Development. 111 (2), 583-599 (1991).</li>
<li>Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decorin+developmental+expression+and+function+in+the+early+avian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Decorin developmental expression and function in the early avian embryo.</a> The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).</li>
<li>Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+avian+neural+crest+cell+migration+on+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin.</a> Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).</li>
<li>Chevalier, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+tissue+mechanical+properties+affect+enteric+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration.</a> Scientific Reports. 6, 20927(2016).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+and+Migration%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
<li>Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+methods+for+cell-cycle+synchronization+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells.</a> Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).</li>
<li>Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+T+lymphocyte+adhesion+receptor+for+an+alternative+cell+attachment+domain+%28CS-1%29+in+plasma+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin.</a> Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).</li>
<li>Robert, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+3-aminopropyltriethoxysilane+layers+formed+on+silanol-terminated+silicon+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces.</a> The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).</li>
</ol>

המחבר מצהיר כי לא קיימים אינטרסים מתחרים.

רכיבי ECM שונים מסדירים הגירה/הגירה של NCC. לדוגמה, HA מווסת באופן חיובי את נדידת NCC 2,15. באופן מעניין, מחקר המבוסס על מודלים גנטיים של עכברים של Tmem2, היאלורונידאז על פני התא, הבהיר את הדרישה לפירוק HA בנדידת NCC9. קולגן מצוי בשפע גם ב-ECM המקיף את הצינור העצבי16. הוכח כי דקורין, פרוטאוגליקן קטן עשיר בלאוצין, מווסת נדידת NCC במהלך התפתחות עצבית17. רכיבי ECM אחרים, כולל למינין ופיברונקטין ...

תאי קרסט עצביים (Neural crest cells או NCCs) הם אוכלוסיית תאים רב-פוטנטית הקיימת בעוברים מתפתחים, והם מקורם בגבול הצלחת העצבית במהלך הנוירולציה. הם תורמים להיווצרות של מגוון רקמות, כולל מערכת העצבים ההיקפית, מערכת הלב וכלי הדם, רקמות craniofacial ואת השלד1. לאחר אינדוקציה ואפיון NCC בגבול הצלחת העצבית, NCCs מהגרים מהנוירואפיתל ונודדים לעבר אתרי רקמות שמקורם ב- NCC1.
היאלורונן (HA) הוא גליקוזאמינוגליקן ללא סולפט המופץ במגוון רקמות כמרכיב של המטריצה החוץ תאית (ECM). חשיבותה של חומצה היאלורונית בהתפתחות עוברים הודגמה במערכות מודל באמצעות אבלציה של גנים האחראים על חילוף החומרים של היאלורונן. לדוגמה, מוטציות בגנים סינתאז היאלורונן (Has1 ו- Has2) ב- Xenopus נמצאו כמובילות לפגמים בנדידת NCC ומום גולגולתי2. בנוסף, דווח כי הפרוטאוגליקנים קושרי HA, אגרקן וורסיקני, מפעילים השפעות מעכבות על נדידת NCC3. בעכברים, אבלציה Has2 מובילה לפגמים חמורים בהיווצרות כרית אנדוקרדיאלית, וכתוצאה מכך קטלניות באמצע ההיריון (E9.5-10) 4,5,6.
חלבון טרנסממברנה 2 (Tmem2), היאלורונידאז על פני התא, הוכח לאחרונה כממלא תפקיד קריטי בקידום הידבקות ונדידה של תאים סרטניים בתיווך אינטגרין על ידי הסרת חומצה היאלורונית הקשורה למטריצה באתרי ההדבקה 7,8. לאחרונה, Inubushi et al.9 הראו כי מחסור ב- Tmem2 מוביל למומים גולגולתיים חמורים עקב חריגות בהגירה / הגירה של NCC והישרדות. במחקר הקודם9, ביטוי Tmem2 נותח במהלך היווצרות והגירה של NCC. ביטוי Tmem2 נצפה באתר של דלמינציה של NCC ובהגירה של NCCs חיוביים ל-Sox9 (איור 1). נוסף על כך, באמצעות שימוש בתאי סמל עצבי O9-1 של עכבר שהתרוקן מ-Tmem2, המחקר הראה שהביטוי במבחנה של Tmem2 היה חיוני ליצירת הידבקויות מוקדיות עבור תאי O9-1 ולנדידתם למצעים המכילים HA (איור 2 ואיור 3)9.
תוצאות אלה מצביעות בבירור על כך ש- Tmem2 חשוב גם להידבקות והגירה של NCC באמצעות ECM עשיר ב- HA. עם זאת, המנגנון המולקולרי של הידבקות והגירה של NCC בתוך ECM עשיר HA עדיין לא ברור. לכן, יש צורך להקים מערכת ניסויית בתרבית חוץ גופית כדי לחקור באופן מלא הידבקות והגירה של NCC בתוך ECM עשיר HA.
מבין הגישות הרבות המשמשות לבדיקת נדידת תאים, הבדיקה המבוססת על סגירת פצעי תאים היא שיטה פשוטה המשמשת לעתים קרובות בתחומי הפיזיולוגיה והאונקולוגיה10. גישה זו שימושית בשל הרלוונטיות שלה לפנוטיפ in vivo והיא יעילה בקביעת התפקידים של תרופות וכימואטרקטנטים במהלך נדידת תאים11. ניתן להעריך את יכולת הנדידה הן של מסות תאים שלמים והן של תאים בודדים על ידי מדידת מרחקי פער התא לאורך זמן11. בכתב יד זה, מוצגת בדיקה שונה המבוססת על סגירת פצעים במבחנה כדי למדל נדידת NCC לרקמות עשירות בחומצה היאלורונית המקיפות את הצינור העצבי. הליך זה ישים גם לחקר רכיבי ECM שונים (כלומר, קולגן, פיברונקטין ולמינין) כדי לנתח את תפקיד פיגום ECM בנדידת NCC.

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבית תאים בגודל 10 ס"מ</td><td>CORNING</td><td>Cat. 353003</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Millipore</td><td>Cat. לא. BSS-1005-B</td><td></td></tr><tr><td>תרבית 2 בארות מוסיפה</td><td>ibidi</td><td>Cat. מס' 80209</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 תווית עז נגד עכבר IgG</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. A21422</td><td>נוגדנים משניים נגד עכברים נגזר עיזים</td></tr><tr><td>נגד תאים אוטומטי</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat. לא. TC20</td><td></td></tr><tr><td>CELLBANKER</td><td>ZENOGEN PHARMA</td><td>Cat. 11910</td><td>קולגן בינוני להקפאת תאים</td></tr><tr><td>מסוג I</td><td>סיגמא</td><td>קאט. מס' 08-115</td><td></td></tr><tr><td>חתול שלם של תא ES בינוני</td><td></td><td>. לא. ES-101-B</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. 10184322</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>Cat. 11971025</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>Cat. מיקרוסקופ</td> פלואורסצנטי 10270106 <td></td></tr><tr><td></td><td>Keyence</td><td>Cat. לא. BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסנט עם תווית HA</td><td>PG Research</td><td>FAHA-H2</td><td></td></tr><tr><td>Glas צלחת תחתונה</td><td>Iwaki</td><td>Cat. 11-0602</td><td></td></tr><tr><td>glutaldehyde</td><td>Sigma</td><td>Cat. מס' G5882</td><td></td></tr><tr><td>חתול מטריגל</td><td>פישר</td><td>. לא. CB-40234</td><td>מטריצת קרום הבסיס</td></tr><tr><td>נוגדן חד-שבטי נגד וינקולין</td><td>סיגמא</td><td>קאט. לא. V9264</td><td></td></tr><tr><td>מדיית הרכבה</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Fisher</td><td>Cat. 50062Z</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 תאים</td><td>Millipore</td><td>Cat. לא. SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>Cat. 158127</td><td></td></tr><tr><td>triethoxysilane</td><td>Sigma</td><td>Cat. מס' 390143</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA</td><td>Millipore</td><td>Cat. לא. SM-2003-C</td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנה חקר ההשפעות של מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן על נדידת תאי קרסט עצביים

In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration

תאי פסגה עצבית (NCCs) הם תאים נודדים מאוד שמקורם באזור הגבי של הצינור העצבי. הגירה של NCCs מן הצינור העצבי הוא תהליך חיוני לייצור NCC ואת ההגירה שלהם לאחר מכן לעבר אתרי המטרה. מסלול הנדידה של NCCs, כולל רקמות הצינור העצבי שמסביב, כולל מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן (HA). כדי למדל נדידת NCC לתוך הרקמות הסובבות העשירות בחומצה היאלורונית מהצינור העצבי, הוקמה במחקר זה בדיקת נדידת מצע מעורבת המורכבת מחומצה היאלורונית (משקל מולקולרי ממוצע: 1,200-1,400 kDa) וקולגן מסוג I (Col1). בדיקת נדידה זו מראה כי תאי קו תאי NCC, O9-1, נודדים מאוד על המצע המעורב וכי ציפוי החומצה ההיאלורונית מתפרק באתר של הידבקויות מוקדיות במהלך הנדידה. מודל זה במבחנה יכול להיות שימושי לחקירה נוספת של הבסיס המכניסטי המעורב בהגירה של NCC. פרוטוקול זה ישים גם להערכת מצעים שונים כפיגומים לחקר נדידת NCC.

בדיקת נדידה בוצעה על מצעים מעורבים המורכבים מ-Col1 ו-HA בעל משקל מולקולרי גבוה (משקל מולקולרי ממוצע: 1,200-1,400 kDa) באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן. תאי O9-1 בגבול הפער נמצאו נודדים בקלות לתוך הפער העשיר בחומצה היאלורונית (איור 4). צביעה חיסונית עבור סמן FA, וינקולין14, אישרה שתאי O9-1 יצרו הידבקויות מוקדיות (FAs) באתרים של פירוק HA (איור 5).
<img alt="Figure 1" class="...

פרוטוקול זה מתאר ניסוי נדידה חוץ גופית המתאים לניתוח פונקציונלי של המולקולות המעורבות בנדידת in vivo של תאי פסגה עצבית לתוך מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן.

Neural crest cells (NCCs) are highly migratory cells that originate from the dorsal region of the neural tube. The emigration of NCCs from the neural tube ...

חומצה היאלורונית היא אחת המטריצות החוץ-תאיות הנפוצות ביותר במודלים של בעלי חיים. הודגמה חשיבותה של חומצה היאלורונית בהתפתחות עוברית. מודל זה במבחנה שימושי כדי לחקור כיצד תאי פסגה עצבית נצמדים ונודדים בתוך מטריצה חוץ-תאית עשירה בחומצה היאלורונית.בעזרת הטכניקה שלנו, אנו יכולים להעריך את יכולת הנדידה והפירוק של חומצה היאלורונית הן של אוכלוסייה סיטונאית ולאחר מכן של תאים בודדים לאורך זמן. בנוסף, טכניקה זו יכולה לשמש לבדיקת תרופות כדי למצוא תרכובת המאיצה או מונעת פירוק HA. כדי להתחיל, לדלל את מטריצת קרום המרתף עם PBS צונן ביחס של 1:50 ולשמור אותו על קרח.מצפים צלחת תרבית של 10 ס"מ ב-10 מיליליטר של תמיסת המטריצה המדוללת ודגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS. כדי לגדל את תאי O9-1 על הלוח המצופה מטריצה לחמם את גזע עוברי שלם או תווך תא ES באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס.ערבב בעדינות את תרחיף התאים O9-1 וספור את מספר התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. לאחר מכן התאם את ריכוז התא ל -1.1 מיליון תאים למיליליטר עם התווך המלא של תאי ES. הוסף שמונה מיליליטר של תווך תאי ES שלמים שחוממו מראש לצלחת התרבית המצופה במטריצה של 10 סנטימטרים וזרע את תאי O9-1 ב- 1.1 מיליון תאים לצלחת.דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני. למחרת, החליפו את המדיום בתווך תאי ES שלם טרי שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס. יש להחליף במדיום טרי כל יומיים-שלושה לאחר מכן.שטפו את צלחת התרבית עם שני מיליליטר PBS ולאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA שחומם מראש. דוגרים במשך חמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. הוסף שני מיליליטר של תווך תאי ES שלמים שחוממו מראש לצלחת התרבית והעבר את התאים המנותקים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.צנטריפוגו את הצינור ב-300 גרם למשך חמש דקות והשליכו את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא. הוסף שני מיליליטר של תווך תאי ES שלמים שחוממו מראש לצינור והשהה מחדש את התאים ביסודיות על ידי פיפטציה. לאחר מכן זרעו את התאים על צלחת תרבית חדשה בצפיפות התאים הרצויה.הוסיפו בזהירות 50 מיקרוליטר של טריאתוקסיסילן לא מדולל לצלחת תחתית זכוכית בקוטר 3.5 ס"מ ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור. שטפו את המנה שלוש פעמים עם שני מיליליטר מים מזוקקים והוסיפו 50 מיקרוליטר של 0.25% גלוטראלדהיד מדולל 100 פעמים ב-PBS למנה. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ואז לשטוף ארבע פעמים בשני מיליליטר PBS ולצפות את הכלים ב-300 מיקרוליטר קולגן מסוג קולגן, אחד ב-0.2 חומצה אצטית רגילה בטמפרטורת החדר למשך שעה.שוב, לשטוף שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS. הוסיפו 300 מיקרוליטר של 200 מיקרוגרם למיליליטר פלואורסציינמין, המסומן כנתרן היאלורונט H2 לכל מנה ודגרו במשך הלילה בטמפרטורת החדר. יש לשטוף שוב עם שני מיליליטר PBS שלוש פעמים.לאחר ייבוש צלחת תחתית הזכוכית המצופה מחברים את שתי תוספות תרבית הבאר לכלים וממלאים את התוספות חיצונית במיליליטר אחד של PBS. זרעו את תאי O9-1 לתוך הבארות ב 10, 000 תאים ב 100 מיקרוליטר של DMEM המכיל 2% סרום בקר עוברי או FBS לכל החדרה. תרבית את התאים במשך יומיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני, צלם תמונות ניגודיות פאזה כנקודת זמן התחלה, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי All-in-One.הסר את התוספות בזהירות מכלי תחתית הזכוכית המצופים בפינצטה ושטוף בעדינות את הכלים התחתונים המצופים מזכוכית עם שני מיליליטר PBS כדי להסיר את התאים ואת פסולת התא. הוסף שני מיליליטר של DMEM טרי המכיל 2% FBS לתוך מנות מתורבת. תרבית את התאים במשך 48 שעות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני ותצלם תמונות ניגודיות פאזיות לאחר 24 שעות ו-48 שעות בתרבית.לשטוף את הכלים עם PBS ולתקן את התאים לאחר 48 שעות עם מיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף את הכלים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם מיליליטר אחד של PBS טרי. לבסוף, הניחו תלוש כיסוי עם מדיום ההרכבה לתצפית מורפולוגית נוספת.חלקים רוחביים של הצינור העצבי של עוברי דגל Tmem2 ב-E9.0 מוצגים באיור זה. החלקים ברמת הגולגולת ותא המטען של הצינור העצבי סומנו פעמיים עבור חלבון הדגל Tmem2 והיאלורונן. ביטוי Tmem2 נצפה בלוח העצבי ובאזור הגבול של הצינור העצבי, בעוד שאתרים אלה היו נטולי כתמים היאלורוניים.תיוג כפול של תאי הפסגה העצבית עבור דגל Tmem2 ו- Sox9 מוצג כאן. חלקים רוחביים של הצינור העצבי E9.0 הוכתמו עבור דגל Tmem2 ו- Sox9. התמונות המייצגות של תאי Tmem2 מדולדלים ושולטים בתאי O9-1 בתרבית רגילה מוצגות באיור זה.הביטוי של Tmem2 בתאים אלה הוערך על ידי qPCR עם GAPDH כבקרה פנימית לנורמליזציה. תאי Tmem2 שהתרוקנו ועברו ביקורת O9-1 בתרבית במשך 48 שעות על פתקי כיסוי זכוכית מצופים בהיאלורונן פלואורסצאינציה. פעילות משפילה היאלורוננית מתגלה כאזורים כהים ברקע הפלואורסצנטי.רמת הפירוק של היאלורונן הושוותה גם כמותית בין תאי Tmem2 שהתרוקנו לבין תאי O9-1 בקבוצת הביקורת. ההתפרקות של היאלורונן הקשור למצע בהידבקויות מוקדיות בתאי O9-1 מוצגת באיור זה. תאי O9-1 שגודלו בתרבית על מצעים מעורבים המורכבים מ-Col1/HA סומנו כתאי חיסון עם נוגדן אנטי-וינקולין.הכתמים או הפסים הכהים מייצגים פעילות פירוק היאלורונן במצע FAHA H2. אתרי השפלת היאלורונן וההידבקויות המוקדיות מוקמו במשותף על המצע המעורב. ציפוי קובל של תחתית הזכוכית בחומצה היאלורונית הוא שלב קריטי בפרוטוקול מכיוון שציפוי לקוי עלול לגרום לכך שהחומצה ההיאלורונית תוסר בקלות על ידי כוח מכני במהלך הדבקה ונדידה.כדי להבטיח ציפוי תקין, אנו משתמשים בגלוטראלדהיד, קולגן מסוג 1 משותק כימית לזכוכית באמצעות צימוד זרוע לאלדהיד. ניתן להשתמש במצע מטריצה חוץ-תאי לצד קולגן מסוג 1, אך הם חייבים להיות בעלי קבוצות חימוש וייתכנו מגבלות בציפוי הקובלים על גבי צלחות זכוכית בשל תכונותיהם הכימיות. אז ניסוי וטעייה עשוי להיות נחוץ כדי לקבוע את הגישה הטובה ביותר.ניסוי מעבדה זה יכול להיות מועיל בחקר האופן שבו מולקולות מסוימות פועלות במהלך התנועה של תאי פסגה עצבית לתוך סביבת HA או HA סביב הצינור העצבי. זו יכולה להיות גם דרך שימושית לבדוק תרופות שיכולות להאיץ או למנוע את תהליך ההגירה הזה. מעניין לדעת מדוע ל-Tmem2 יש גם את הפונקציות של היצמדות על HA וגם את ההתפרקות של HA ומדוע HA צריך להתפרק באתר הלכידות המלאה.מאחר שחומצה היאלורונית היא החומר הנפוץ ביותר במטריצה החוץ-תאית, הבנת התשובה לשאלה זו חשובה מאוד בביולוגיה וברפואה. פרוטוקול ניסיוני זה הוא בעל ערך מכיוון שניתן ליישם אותו על סוגי תאים שונים, כולל פיברובלסטים בעור, תאי אפיתל ותאים סרטניים.

in-vitro-investigation-effects-hyaluronan-rich-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מראים כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות מכשיר agarose רומן ג'ל microfluidic מבוסס. טכנולוגיה זו ניתן להתאמה בקלות מערכות אחרות תא יונקים שבו מקורות תא נדירים, כגון אדם בתאי גזע עצביים, ועל להסתובב הזמן הוא קריטי.

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose Microfluidic

זמן לשגות הדמיה של התרבות רקמת 3D מאפשר ללמוד התנהגות הנדידה של תאים בודדים שמקורם רוממות ganglionic בתגובה תמצית חלבון מופרדים מן קליפת המוח.

התנהגות הנדידה של תאים שנוצר תרבויות רוממות Ganglionic

גישה לנתח את ההגירה של תאים (תאי explanted רכס עצביים גזע) הוא תאר. שיטה זו היא זולה, עדינה, ומסוגלת להבחין chemotaxis משני chemokinesis והשפעות אחרות על קוטביות נדידה כגון אלה נגזרים מאינטראקציות תא תא בתוך התרבות העיקרית הגזע עצבי פסגת התא.

ניתוח של נדידת תאים עצביות קרסט טרונק באמצעות Assay השתנה Zigmond הקאמרי

Mesenchyme הגולגולת עובר תנועות morphogenic דרמטיות שעשויים מספקת כוח מניע לגובה של הקפלים...

Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח פסגת premigratory גולגולת עצבית (NC) מneurulas laevis Xenopus. יכול להיות מצופה explants אלה בפיברונקטין ותרבית במבחנה, או מורכב בחזרה לעוברי מארח. טכניקה זו מאפשרת חקר המנגנונים של מעבר NC האפיתל לmesenchyme, הגירה, ובידול.

Dissection של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; העצבי קרסט עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Explant תרבות או<em&gt; In vivo</em&gt; השתלות

הנכסים ומייקרו של המטריצה ​​תאית מכאניים מאוד משפיעים על הגירת 3D של תאים. שיטה במבחנה ללמוד spatiotemporal התנהגות נדידת תאים בסביבות biophysically משתנים, בשתי רמות אוכלוסייה ותא בודדות, מתואר.

מערכת ג&#39;ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) מאפשר לסרטן להפוך לפולשני. כדי לחקור EMT, מתואר מודל מבחנה מבוסס תאי גזע עצביים (NSC) נטול סרום ואנזימים. מערכת סטנדרטית זו מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של נדידת תאים, ביטוי גנים וחלבונים. המודל מתאים לגילוי תרופות.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח והתרבות של תאי ציצה עצביים הגולגולת מדגמי העכבר, בעיקר למחקר של הגירה תא. אנו מתארים את טכניקות ההדמיה החי בשימוש וניתוח של מהירות וצורה תא שינויים.

חיתוך, תרבות וניתוח של הגולגולת הראשי ציצה עצביים תאים מעכבר לחקר של ציצה של תא העצבים העצבי והגירה

פרוטוקול רב-תכליתי זה מתאר את הבידוד של תאי פסגה עצבית קדם-מיגרטיבית (NCCs) באמצעות כריתה של קפלים עצביים גולגולתיים מעוברי אפרוחים. עם הציפוי והדגירה, NCCs נודדים מגיחים מתוך קצוות עצביים, מה שמאפשר הערכה של מורפולוגיה של תאים ונדידה בסביבה דו-ממדית פשוטה.

הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי צמרת עצביים גולגולתיים של אפרוחים

חקור נדידת תאי קרסט עצביים במטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן באמצעות מודל במבחנה. שיטה זו מאפשרת הערכת הידבקות תאים, נדידה ופירוק HA לאורך זמן, ומספקת פלטפורמה לסינון תרופות המשפיעות על תהליכי הפירוק.

במבחנה חקר ההשפעות של מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן על נדידת תאי קרסט עצביים

גלה סרטונים נוספים