עכבר ב- Vivo שליה ממוקד מניפולציה CRISPR

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר מניפולציה ממוקדת ספציפית לזמן של שליות עכבר באמצעות CRISPR. זה יאפשר לחוקרים להבהיר תפקודים גנטיים ספציפיים במהלך אמצע עד סוף ההריון. מניפולציות גנטיות הגורמות לביטוי יתר בתוך שליית העכבר הן נדירות מאוד.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מגוון של שינויים בביטוי גנים בתוך השליה. אל תתייאש אם מונחים ראשוניים יש טכניקה זו אינם מוצלחים. מכיוון שטכניקה זו מאתגרת, זה דורש לא מעט זמן להתאמן כדי לשלוט.

כדי להתחיל, מניחים את שכיבת הסכר המורדם עם חרוט אף לשמירה על הרדמה באזור ההכנה. לגלח היטב את בטן הסכר. כדי למנוע התייבשות הקרנית, יש להניח ג'ל דמעות מלאכותי על שתי עיני הסכר.

לאחר מכן השתמשו באפליקטורים סטריליים מכותנה כדי לחטא את אתר הניתוח עם לפחות שלושה סבבים לסירוגין של תמיסת פובידון-יוד, ואחריה 70% אתנול עם ציפוי סופי של תמיסת פובידון-יוד. לאחר ההכנה, העבירו את הסכר עם חרוט אף ההרדמה לאזור הניתוח המיועד. עבור laparotomy הרחם, מניחים את הסכר שכיבה על שולחן הניתוחים ולאבטח את חרוט האף במקומו עם נייר דבק.

הניחו כרית חימום מתחת לפד סופג לטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס. לאחר אישור עומק ההרדמה באמצעות חוסר רפלוקס צביטת בוהן, השתמש במלקחיים ובמספריים כדי לבצע חתך מקו האמצע של כשני סנטימטרים דרך העור המאוהל. לאחר מכן בצע חתך אנכי דרך הצפק באמצעות מלקחיים סטריליים, בעדינות אוהל הרחק מקרני הרחם.

לעסות את שתי קרני הרחם על ידי לחיצה משני צדי הבטן עם אצבעות כדי להנחות אותם. הניחו את הרחם החשוף על גבי וילונות כירורגיים סטריליים המונחים מעל הבטן התחתונה ושמרו אותו לח בעזרת טיפות מלח סטרילי חם לפי הצורך. לאחר שהרחם נחשף, בחר שלושה זוגות שליות למניפולציה.

רשום את המיקום של מניפולציות שליה ואת הארגון של העוברים בתוך קרני הרחם. עבור הזרקת השליה של פלסמיד הבקרה, לטעון כמות מספקת של פלסמיד הבקרה המתאים עבור שלוש זריקות באמצעות micropipette מכויל. לבצע את כל ההזרקות בין אזור ההחלטה לאזור הצומת בעומק של כ-0.5 מילימטרים לרוחב לתוך השליה.

לאחר ההזרקה אך מיד לפני ההתחשמלות יש לצפות את מקומות המגע במי מלח סטריליים, ולמרוח את המלח בדיוק על שלושת האתרים בדופן הרחם והמשוטים בטפטפת או מזרק. תוך שתי דקות מההזרקה יש לבצע אלקטרופורציה באמצעות זוג משוטים בקוטר שלושה מ"מ המחוברים למכונת אלקטרופורציה. כדי להבטיח יעילות שילוב CRISPR ואת הכדאיות של עוברים, כוונן את ההגדרות ל- 30 וולט, פעימה של 30 אלפיות השנייה, שתי פעימות, פעימה של 970 מילי-שנייה כבויה וחד-קוטבית.

לחץ בעדינות על משוטי האלקטרופורציה מעל דפנות הרחם בצדדים הצדיים של השליה. מניחים את משוט האנודה מעל אתר ההזרקה ואת הקתודה ישירות ממול. לחץ על הדופק במכונת האלקטרופורציה והמתן להשלמת שני הפולסים לפני הסרת משוטי האלקטרופורציה.

לאחר מכן המשך להזרקת שליה של פלסמיד ניסיוני כפי שהודגם קודם לכן. בצע אלקטרופורציה של כל שלוש השליות המוזרקות הניסיוניות תוך שתי דקות מההזרקה כפי שבוצע עבור קבוצת הביקורת. לאחר השלמת מניפולציית השליה, עסו בעדינות את קרני הרחם בחזרה לתוך חלל הבטן באמצעות אצבעות בלבד כדי לתפעל ישירות את קרני הרחם.

בצע תפרים קטועים על שכבת הצפק באמצעות תפרים מצופים קלועים קלועים באורך 45 ס"מ עם סגסוגת מחט מעגל 13 מ"מ, שלוש שמיניות. לאחר תפירת שכבת הצפק, תפרו את העור בתפרים נמסים באמצעות אותו סוג של תפרים נמסים המשמשים לצפק. לאחר סיום התפירה, יש למרוח דבק רקמות על התפרים שעל העור.

כאשר דבק הרקמה התייבש, כבו את הוופורייזר והעבירו את הסכר מאזור הניתוח לכלוב תומך על גבו. לשליות הוזרקו פלסמיד בקרה כללי מסוג CRISPR Cas9 ופלסמיד CRISPR בקרת הפעלה או פלסמיד הפעלת IGF-1 SAM. התמונות המייצגות שלאחר נקרופסי לא הראו נזק ניכר או שינוי במראה הפנוטיפי באף קבוצת טיפול.

שיעור ההישרדות של העוברים הלא מטופלים בהמלטות שעברו מניפולציה ירד לממוצע של 79.05% בעוד שחלה ירידה משמעותית בהישרדות העוברים שעברו מניפולציה בממוצע של 55.56%לא היה הבדל משמעותי במשקל השליה של אף קבוצה. לא היה הבדל משמעותי בעלייה במשקל האימהית מיד לאחר הניתוח בהשוואה לניתוחי דמה. סכרים הריוניים רבים הציגו ירידה קלה או ללא שינוי במשקל ביום שלאחר ההליך, ככל הנראה עקב הפרעות אכילה במהלך הניתוח ולאחריו.

רוב הסכרים הראו עלייה במשקל ב-E14.5, אך מדי פעם עדיין נצפתה ירידה במשקל. בדיקת qPCR הראתה עלייה משמעותית בביטוי IGF-1 בשליות עם ביטוי יתר של IGF-1 לעומת שליות הביקורת. הערכת ELIZA של שליות E14.5 הראתה עלייה משמעותית ברמות חלבון IGF-1 בשליות עם ביטוי יתר של IGF-1 לעומת שליות הביקורת.

אוטופלואורסצנטיות ירוקה הדגימה את תת-האזורים של ממשק העובר של השליה האימהית עם תיוג Cas9 אדום רק בשליית ביטוי היתר IGF-1, מה שמצביע על שילוב מוצלח של CRISPR בכל שלושת תתי האזורים של השליה. הפלואורסצנט בסימון הכלאה C2 אישר את שילובו של פלסמיד ההפעלה IGF-1 ללא נדידה לשליות לא מטופלות. ניתן היה לזהות את אזור הנשירים והמבוך סביב אזור הצומת האדום המסומן בצביעת Prl8a8.

זכור לרשום את סוג המניפולציה והמיקום של השליות והעוברים המתאימים. מומלץ מאוד לרשום את מיקום צוואר הרחם והעוברים בתוך קרני הרחם. לאחר הליך זה, ניתן לבצע ניתוח של השליה, העובר והסכר.

זה יאפשר הבנה טובה יותר של גנים תפקידים ספציפיים לשליה בהריון, תפקוד שליה והתפתחות עוברית.