עכבר ב- Vivo שליה ממוקד מניפולציה CRISPR
14 באפריל 2023
כאן אנו מתארים שיטה ספציפית לזמן כדי לתפעל ביעילות מסלולים התפתחותיים קריטיים בשליית העכבר in vivo. זה מבוצע באמצעות הזרקה ואלקטרופורציה של פלסמידים CRISPR לתוך השליות של סכרים בהריון ביום העוברי 12.5.
פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר מניפולציה ממוקדת ספציפית לזמן של שליות עכבר באמצעות CRISPR. זה יאפשר לחוקרים להבהיר תפקודים גנטיים ספציפיים במהלך אמצע עד סוף ההריון. מניפולציות גנטיות הגורמות לביטוי יתר בתוך שליית העכבר הן נדירות מאוד.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מגוון של שינויים בביטוי גנים בתוך השליה. אל תתייאש אם מונחים ראשוניים יש טכניקה זו אינם מוצלחים. מכיוון שטכניקה זו מאתגרת, זה דורש לא מעט זמן להתאמן כדי לשלוט.
כדי להתחיל, מניחים את שכיבת הסכר המורדם עם חרוט אף לשמירה על הרדמה באזור ההכנה. לגלח היטב את בטן הסכר. כדי למנוע התייבשות הקרנית, יש להניח ג'ל דמעות מלאכותי על שתי עיני הסכר.
לאחר מכן השתמשו באפליקטורים סטריליים מכותנה כדי לחטא את אתר הניתוח עם לפחות שלושה סבבים לסירוגין של תמיסת פובידון-יוד, ואחריה 70% אתנול עם ציפוי סופי של תמיסת פובידון-יוד. לאחר ההכנה, העבירו את הסכר עם חרוט אף ההרדמה לאזור הניתוח המיועד. עבור laparotomy הרחם, מניחים את הסכר שכיבה על שולחן הניתוחים ולאבטח את חרוט האף במקומו עם נייר דבק.
הניחו כרית חימום מתחת לפד סופג לטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס. לאחר אישור עומק ההרדמה באמצעות חוסר רפלוקס צביטת בוהן, השתמש במלקחיים ובמספריים כדי לבצע חתך מקו האמצע של כשני סנטימטרים דרך העור המאוהל. לאחר מכן בצע חתך אנכי דרך הצפק באמצעות מלקחיים סטריליים, בעדינות אוהל הרחק מקרני הרחם.
לעסות את שתי קרני הרחם על ידי לחיצה משני צדי הבטן עם אצבעות כדי להנחות אותם. הניחו את הרחם החשוף על גבי וילונות כירורגיים סטריליים המונחים מעל הבטן התחתונה ושמרו אותו לח בעזרת טיפות מלח סטרילי חם לפי הצורך. לאחר שהרחם נחשף, בחר שלושה זוגות שליות למניפולציה.
רשום את המיקום של מניפולציות שליה ואת הארגון של העוברים בתוך קרני הרחם. עבור הזרקת השליה של פלסמיד הבקרה, לטעון כמות מספקת של פלסמיד הבקרה המתאים עבור שלוש זריקות באמצעות micropipette מכויל. לבצע את כל ההזרקות בין אזור ההחלטה לאזור הצומת בעומק של כ-0.5 מילימטרים לרוחב לתוך השליה.
לאחר ההזרקה אך מיד לפני ההתחשמלות יש לצפות את מקומות המגע במי מלח סטריליים, ולמרוח את המלח בדיוק על שלושת האתרים בדופן הרחם והמשוטים בטפטפת או מזרק. תוך שתי דקות מההזרקה יש לבצע אלקטרופורציה באמצעות זוג משוטים בקוטר שלושה מ"מ המחוברים למכונת אלקטרופורציה. כדי להבטיח יעילות שילוב CRISPR ואת הכדאיות של עוברים, כוונן את ההגדרות ל- 30 וולט, פעימה של 30 אלפיות השנייה, שתי פעימות, פעימה של 970 מילי-שנייה כבויה וחד-קוטבית.
לחץ בעדינות על משוטי האלקטרופורציה מעל דפנות הרחם בצדדים הצדיים של השליה. מניחים את משוט האנודה מעל אתר ההזרקה ואת הקתודה ישירות ממול. לחץ על הדופק במכונת האלקטרופורציה והמתן להשלמת שני הפולסים לפני הסרת משוטי האלקטרופורציה.
לאחר מכן המשך להזרקת שליה של פלסמיד ניסיוני כפי שהודגם קודם לכן. בצע אלקטרופורציה של כל שלוש השליות המוזרקות הניסיוניות תוך שתי דקות מההזרקה כפי שבוצע עבור קבוצת הביקורת. לאחר השלמת מניפולציית השליה, עסו בעדינות את קרני הרחם בחזרה לתוך חלל הבטן באמצעות אצבעות בלבד כדי לתפעל ישירות את קרני הרחם.
בצע תפרים קטועים על שכבת הצפק באמצעות תפרים מצופים קלועים קלועים באורך 45 ס"מ עם סגסוגת מחט מעגל 13 מ"מ, שלוש שמיניות. לאחר תפירת שכבת הצפק, תפרו את העור בתפרים נמסים באמצעות אותו סוג של תפרים נמסים המשמשים לצפק. לאחר סיום התפירה, יש למרוח דבק רקמות על התפרים שעל העור.
כאשר דבק הרקמה התייבש, כבו את הוופורייזר והעבירו את הסכר מאזור הניתוח לכלוב תומך על גבו. לשליות הוזרקו פלסמיד בקרה כללי מסוג CRISPR Cas9 ופלסמיד CRISPR בקרת הפעלה או פלסמיד הפעלת IGF-1 SAM. התמונות המייצגות שלאחר נקרופסי לא הראו נזק ניכר או שינוי במראה הפנוטיפי באף קבוצת טיפול.
שיעור ההישרדות של העוברים הלא מטופלים בהמלטות שעברו מניפולציה ירד לממוצע של 79.05% בעוד שחלה ירידה משמעותית בהישרדות העוברים שעברו מניפולציה בממוצע של 55.56%לא היה הבדל משמעותי במשקל השליה של אף קבוצה. לא היה הבדל משמעותי בעלייה במשקל האימהית מיד לאחר הניתוח בהשוואה לניתוחי דמה. סכרים הריוניים רבים הציגו ירידה קלה או ללא שינוי במשקל ביום שלאחר ההליך, ככל הנראה עקב הפרעות אכילה במהלך הניתוח ולאחריו.
רוב הסכרים הראו עלייה במשקל ב-E14.5, אך מדי פעם עדיין נצפתה ירידה במשקל. בדיקת qPCR הראתה עלייה משמעותית בביטוי IGF-1 בשליות עם ביטוי יתר של IGF-1 לעומת שליות הביקורת. הערכת ELIZA של שליות E14.5 הראתה עלייה משמעותית ברמות חלבון IGF-1 בשליות עם ביטוי יתר של IGF-1 לעומת שליות הביקורת.
אוטופלואורסצנטיות ירוקה הדגימה את תת-האזורים של ממשק העובר של השליה האימהית עם תיוג Cas9 אדום רק בשליית ביטוי היתר IGF-1, מה שמצביע על שילוב מוצלח של CRISPR בכל שלושת תתי האזורים של השליה. הפלואורסצנט בסימון הכלאה C2 אישר את שילובו של פלסמיד ההפעלה IGF-1 ללא נדידה לשליות לא מטופלות. ניתן היה לזהות את אזור הנשירים והמבוך סביב אזור הצומת האדום המסומן בצביעת Prl8a8.
זכור לרשום את סוג המניפולציה והמיקום של השליות והעוברים המתאימים. מומלץ מאוד לרשום את מיקום צוואר הרחם והעוברים בתוך קרני הרחם. לאחר הליך זה, ניתן לבצע ניתוח של השליה, העובר והסכר.
זה יאפשר הבנה טובה יותר של גנים תפקידים ספציפיים לשליה בהריון, תפקוד שליה והתפתחות עוברית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה תלוית-זמן למניפולציה של מסלולי התפתחות קריטיים בשילייה של עכבר באמצעות CRISPR. הטכניקה כוללת הזרקה ואלקטרופורציה של פלסמידי CRISPR לשילייות של עכברות הרריות ביום עוברי 12.5.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- הנדסה גנטית
רקע
- מניפולציה ממוקדת של תפקודי גנים במהלך ההריון היא קריטית להבנת תהליכי התפתחות.
- שינויים גנטיים בשילייה הם נדירים ומאתגרים.
- שיטה זו מאפשרת מגוון של שינויים בביטוי גנים.
- שליטה בטכניקה דורשת תרגול והתמדה.
מטרת המחקר
- להבהיר תפקודי גנים ספציפיים במהלך שלבים בינוניים ומאוחרים של ההיריון.
- לספק שיטה מהימנה למניפולציה גנטית בשלייה של עכבר.
- לקדם את ההבנה של התפתחות השלייה ותפקודה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקת פלסמידי CRISPR לשלייות של עכברים.
- אלקטרופורציה להגברת ספיגת הפלסמיד.
- ביצוע ההתערבות ביום עוברי 12.5.
- הערכת שינויים בביטוי גנים לאחר המניפולציה.
תוצאות עיקריות
- מניפולציה מוצלחת של ביטוי גנים בשיליה של עכבר.
- הוכחת פוטנציאל לביטוי יתר של גנים ספציפיים.
- מתן תובנות לגבי האתגרים ועקומת הלמידה הקשורה לטכניקה.
- הדגשת החשיבות של התערבויות תלויי-זמן.
מסקנות
- שיטה זו מהווה התקדמות משמעותית במחקר של השילשייה.
- היא פותחת נתיבים חדשים לחקר תפקוד גנים במהלך ההיריון.
- חוקרים מוזמנים להתמיד למרות אתגרים ראשוניים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מניפולציה של CRISPR המכוונת לשליה בעכברים מאפשרת בחינה מדויקת ותלוית-זמן של תפקוד גנים בממשק שבין האם לעובר, ובכך היא נותנת מענה לפער קריטי במידול התפתחותי ומחלות. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות למחקר טיפולי טרום-לידתיים וסביב-לידתיים, ותומכת בהחלטות מותאמות-סיכון בשלבי הגילוי המוקדמים ובמסלולי תרגום קליניים. הספציפיות והשליטה הזמנית של השיטה מספקות ערך אסטרטגי לצווני ביו-פארמה השואפים להפחית סיכונים בבחינת הביולוגיה של השליה בהקשרים של מחלות מורכבות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה תפקודית ישירה של גנים מטרה בשילייה במהלך חלונות התפתחותיות מוגדרים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד השפעות של גנים ספציפיים לשליה מהשפעות סיסטמיות.
- מסייע במיון תיקי פרויקטים על ידי הבהרת תפקידם של גנים מועמדים בצמיחה עוברית ובמודלים של מחלות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות validated in vivo עבור בדיקות פנוטיפיות ומולקולריות המשך.
- מאפשר הערכה כמותית הניתנת לשחזור של ביטוי גנים ותוצרי חלבון בשליות שעברו מניפולציה.
- תומך בסריקה של תפקוד גנים וסימון מסלולים (pathway modulation) בהקשר פיזיולוגי רלוונטי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מודלים רלוונטיים למחלות לצורך חקר תרומות השילייה להפרעות התפתחותיות.
- מספק רציפות ממניפולציה גנטית ועד לקריאות של סמנים ביולוגיים ופנוטיפים במחקרי קדם-קליניים.
- מפחית סיכונים מהיפותזות תרגומיות על ידי מתן אפשרות להתערבויות ממוקדות ותלויות-זמן in vivo.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו למניפולציה של השילייה המבוססת על CRISPR משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשרת בין אימות מטרות מוקדם לבין פיתוח מודלים תרגומיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מנגנוני של תפקוד גנים בשילייה.
- סריקה: מספק נתונים כמותיים של ביטוי גנים וחלבונים לצורך ניתוח השוואתי.
- אנליטיקה: מאפשר הערכה סטטיסטית של שלייה שעברה מניפולציה לעומת שלייה בקבוצת ביקורת באמצעות תוצרי qPCR ו-ELISA.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מניפולציה גנטית לבין פנוטיפים הרלוונטיים למחלה והערכת סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ברמה ארגונית: מבסס פלטפורמת in vivo הניתנת לשימוש חוזר למחקרי תפקוד גנים בשילייה על פני תוכניות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות של השילייה ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מניפולציה גנטית in vivo באמצעות פרוטוקולים הניתנים לשחזור ובעלי יכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות go/no-go ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות פרינטאליות ופרינטטליות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות שילייה ומודלים של מחלות בהתאם לסיכון המעודכן.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות כירורגיות מתקדמות ובמסירת CRISPR in vivo.
- נדרש גישה לציוד אלקטרופורציה ולפלטפורמות ניתוח מולקולרי כמותי.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים של פרוטוקולי המניפולציה וההערכה.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מבנים גנטיים או זני עכברים שונים.
- יש להביא בחשבון את המורכבות הטכנית ואת שיעורי ההישרדות של העוברים בתכנון הניסיוני.
