Name: עכבר ב- Vivo שליה ממוקד מניפולציה CRISPR (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: למד מניפולציה ממוקדת של שליית עכבר באמצעות CRISPR לחקירת פונקציות גנים בהריון. השיטה כוללת הזרקת פלסמידים ואלקטרופורציה ביום עוברי 12.5 לשינויי ביטוי גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים במקורות המימון הבאים: R01 MH122435, NIH T32GM008629 ו-NIH T32GM145441. המחברים מודים לד"ר ואל שפילד ולמעבדות של ד"ר קלווין קרטר באוניברסיטת איווה על השימוש בחדר הניתוח ובציוד שלהם, כמו גם לד"ר אריק ואן אוטרלו, ד"ר ננדקומר נאראיאנן וד"ר מתיו ובר על עזרתם במיקרוסקופיה. המחברים מודים גם לד"ר שרה מאורר, מאיה אוונס וסרילקה קונדו על עזרתן בניתוחי הפיילוט.

<ol><li>Cross, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+development+and+evolution+of+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Genes, development and evolution of the placenta.</a> Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).</li>
<li>Perez-Garcia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placentation+defects+are+highly+prevalent+in+embryonic+lethal+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants.</a> Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).</li>
<li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta-brain-axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">The placenta-brain-axis.</a> Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).</li>
<li>Maslen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+placenta-heart+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in placenta-heart interactions.</a> Frontiers in Physiology. 9, 735(2018).</li>
<li>Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+horizons+for+neurodevelopmental+disorders%3A+Placental+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms.</a> Frontiers in Pediatrics. 9, 653230(2021).</li>
<li>Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+placental+development+and+its+impact+on+fetal+growth-new+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 570(2018).</li>
<li>Goeden, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Inflammation+disrupts+fetal+neurodevelopment+via+increased+placental+output+of+serotonin+to+the+fetal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain.</a> Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).</li>
<li>vander Bom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+epidemiology+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The changing epidemiology of congenital heart disease.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).</li>
<li>Wilson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+commonly+expressed+genes+between+first+trimester+fetal+heart+and+placenta+cell+types+in+the+context+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10756(2022).</li>
<li>Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Genetic+manipulation+of+the+rodent+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Review: Genetic manipulation of the rodent placenta.</a> Placenta. 32, S130-S135 (2011).</li>
<li>Wenzel, P. L., Leone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Cre+recombinase+in+early+diploid+trophoblast+cells+of+the+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta.</a> Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).</li>
<li>Zhou, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+expression+of+Cre+recombinase+provokes+placental-specific+DNA+recombination+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice.</a> PLoS One. 7 (2), e29236(2012).</li>
<li>Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+platelet-derived+growth+factor+receptor+alpha+promoter-directed+expression+of+cre+recombinase+in+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta.</a> Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).</li>
<li>Nadeau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Map2k1+and+Map2k2+genes+contribute+to+the+normal+development+of+syncytiotrophoblasts+during+placentation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation.</a> Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).</li>
<li>Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+trophoblast-specific+genetic+manipulation+using+lentiviral+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22BioProtocol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery.</a> BioProtocol. 7 (24), e2652(2017).</li>
<li>Okada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+of+placental+defects+and+embryonic+lethality+by+trophoblast-specific+lentiviral+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer.</a> Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).</li>
<li>Lecuyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+placental+marker+of+fetal+brain+defects+after+in+utero+alcohol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44(2017).</li>
<li>Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+placental+gene+transfer+of+IGF-1+corrects+placental+insufficiency+via+enhanced+placental+glucose+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms.</a> PLoS One. 8 (9), e74632(2013).</li>
<li>Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+amino+acid+transporters+by+adenoviral-mediated+human+insulin-like+growth+factor-1+in+a+mouse+model+of+placental+insufficiency+in+vivo+and+the+human+trophoblast+line+BeWo+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro.</a> Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).</li>
<li>Song, A. J., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+and+avoiding+problems+when+using+the+Cre-lox+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system.</a> Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).</li>
<li>Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+of+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Biosafety of adenoviral vectors.</a> Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).</li>
<li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li>
<li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+development%3A+Lessons+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Placental development: Lessons from mouse mutants.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).</li>
<li>Elmore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+atlas+of+the+developing+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histology atlas of the developing mouse placenta.</a> Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).</li>
<li>Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+phenotype+and+the+insulin-like+growth+factors%3A+Resource+allocation+to+fetal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth.</a> The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).</li>
<li>Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factors+in+embryonic+and+fetal+growth+and+skeletal+development+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review).</a> Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).</li>
<li>Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+the+developing+mouse+inner+ear+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3653(2012).</li>
<li>Elser, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+maternal+exposure+to+cypermethrin+and+stress+affect+embryonic+brain+and+placental+outcomes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice.</a> Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).</li>
<li>Gumusoglu, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+maternal+interleukin-17+and+autism-related+cortical+gene+expression%2C+neurobiology%2C+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior.</a> Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).</li>
<li>Liu, F., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+gene+transfer+to+the+liver+following+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).</li>
<li>Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+genes+via+sonoporation+and+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of genes via sonoporation and electroporation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+gene+editing+using+ribonucleoproteins+in+skin+stem+cells+of+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).</li>
<li>Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakamura%2C+H+%22Electroporation+and+Sonoporation+in+Developmental+Biology%22">Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology</a>. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).</li>
<li>Bond, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+timing+and+coordination+of+neurogenesis+and+astrogenesis+in+developing+mouse+hippocampal+subregions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions.</a> Brain Sciences. 10 (12), 909(2020).</li>
<li>Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+developmental+events+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Timing of developmental events in the early mouse embryo.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).</li>
<li>Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+mouse+trophoblast+cells+and+trophoblast+invasion+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3202(2012).</li>
<li>Mandegar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+Interference+efficiently+induces+specific+and+reversible+gene+silencing+in+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).</li>
<li>Dai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+CRISPRa+screen+identifies+putative+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers.</a> Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).</li>
<li>Ursini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+genomic+risk+scores+and+early+neurodevelopmental+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118(2021).</li>
<li>Smajdor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethical+challenges+in+fetal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Ethics%22%5BJournal%5D)">Ethical challenges in fetal surgery.</a> Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).</li>
<li>Antiel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethical+challenges+in+the+new+world+of+maternal-fetal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery.</a> Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השליה היא מווסת עיקרי של גדילת העובר, וכאמור, שינויים בביטוי או בתפקוד של גן השליה עשויים להשפיע באופן משמעותי על התפתחות העובר6. ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כאן לביצוע מניפולציה ממוקדת in vivo CRISPR של שליית העכבר בגישה כירורגית מתקדמת יחסית. טכניקה זו מאפשרת יבול משמעותי של עוברים בני קיימא והשליות התואמות שלהם שניתן להשתמש בהם למחקר נוסף (איור 6A,B). השיטה הזו אפשרה לנו לבטא בהצלחה את השליה IGF-1 ב-E14.5 (אי...

השליה היא איבר חיוני המעורב בהתפתחות העובר. תפקידה העיקרי של השליה הוא לספק גורמים חיוניים ולווסת את העברת החומרים המזינים והפסולת אל העובר וממנו. שליות יונקים מורכבות הן מרקמה עוברית והן מרקמה אימהית, המרכיבות את הממשק העוברי-אימהי, ולכן הגנטיקה של האם והעובר משפיעה על הפונקציה1. אנומליות גנטיות או תפקוד לקוי של השליה יכולים לשנות באופן דרסטי את התפתחות העובר. עבודות קודמות הראו כי גנטיקה והתפתחות שליה קשורות להתפתחות משתנה של מערכות איברים ספציפיות בעובר. בפרט, הפרעות בשליה קשורות לשינויים במוח, בלב ובמערכת כלי הדם של העובר 2,3,4,5.
העברת הורמונים, גורמי גדילה ומולקולות אחרות מהשליה לעובר ממלאת תפקיד מרכזי בהתפתחות העובר6. הוכח כי שינוי ייצור השליה של מולקולות ספציפיות יכול לשנות את ההתפתחות העצבית. דלקת אימהית יכולה להגביר את ייצור הסרוטונין על ידי שינוי ביטוי הגן המטבולי טריפטופן (TRP) בשליה, אשר לאחר מכן יוצר הצטברות של סרוטונין במוח העובר7. מחקרים אחרים מצאו מומים בשליה לצד מומי לב. הפרעות בשליה נחשבות כתורמות למומי לב מולדים, המום המולד, השכיח ביותר בבני אדם8. מחקר שנערך לאחרונה זיהה מספר גנים בעלי מסלולים תאיים דומים הן בשליה והן בלב. אם הם משובשים, מסלולים אלה עלולים לגרום לפגמים בשני האיברים9. המומים בשליה עלולים להחמיר מומי לב מולדים. תפקידה של גנטיקה של השליה ותפקודה על התפתחות מערכת איברים עוברית ספציפית הוא תחום מחקר מתפתח.
לעכברים יש שליות המוכריאליות ותכונות אחרות של שליות אנושיות, מה שהופך אותם למודלים שימושיים ביותר לחקר מחלות אנושיות1. למרות חשיבותה של השליה, חסרות כיום מניפולציות גנטיות ממוקדות in vivo. יתר על כן, יש כיום יותר אפשרויות זמינות עבור נוקאאוטים או נוק-דאונים מאשר ביטוי יתר או מניפולציות רווח של פונקציה בשליה10. ישנם מספר קווים טרנסגניים למניפולציה ספציפית לשליה, כל אחד בשושלות טרופובלסטים שונות בנקודות זמן שונות. אלה כוללים Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER ו- Gcm1-Cre 11,12,13,14. בעוד טרנסגנים Cre אלה יעילים, הם עשויים שלא להיות מסוגלים לתפעל גנים מסוימים בנקודות זמן ספציפיות. שיטה נפוצה נוספת לביטוי גנים של שליה היא החדרת וקטורים לנטי-ויראליים לתרבית בלסטוציסט, מה שגורם למניפולציה גנטית ספציפית לטרופובלסט15,16. טכניקה זו מאפשרת שינוי משמעותי בביטוי גן השליה בשלב מוקדם בהתפתחות. השימוש בהפרעות RNA in vivo נוצל בדלילות בשליה. החדרת פלסמידים shRNA יכולה להתבצע באופן דומה לטכניקת CRIPSR המתוארת במאמר זה. זה נעשה ב E13.5 כדי להפחית בהצלחה את ביטוי PlGF בשליה, עם השפעות על כלי הדם במוח של צאצאים17.
בנוסף לטכניקות המשמשות בעיקר לנוקאאוט או להדחה, גרימת ביטוי יתר מבוצעת בדרך כלל עם אדנווירוסים או החדרת חלבון אקסוגני. לטכניקות המשמשות לביטוי יתר יש שיעורי הצלחה משתנים והן בוצעו לרוב בשלב מאוחר יותר בהריון. כדי לחקור את תפקידו של גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-1) בתפקוד השליה, בוצעה העברת גן שליה בתיווך אדנובירל כדי לגרום לביטוי יתר של הגן IGF-1 18,19. זה בוצע מאוחר בהריון עכבר על E18.5 באמצעות הזרקת שליה ישירה. כדי לספק אפשרויות נוספות ולעקוף כשלים אפשריים של מניפולציות גנטיות מבוססות של שליה, כגון כשלים משולבים של Cre-Lox, הרעילות האפשרית של אדנווירוסים, וההשפעות מחוץ למטרה של shRNA, ניתן להשתמש במניפולציה ישירה של CRISPR in vivo של השליה 20,21,22. מודל זה פותח כדי לתת מענה להיעדר מודלים של ביטוי יתר וליצור מודל עם גמישות.
טכניקה זו מבוססת על עבודתם של Lecuyer et al., שבה פלסמידים shRNA ו- CRISPR כוונו ישירות in vivo לשליות עכבר כדי לשנות ביטוי PlGF 17. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לשנות ישירות את ביטוי גני השליה באמצעות מניפולציה של CRISPR במספר נקודות זמן; עבור עבודה זו, E12.5 נבחר. השליה התבגרה בשלב זה והיא גדולה מספיק כדי לבצע מניפולציות, מה שמאפשר החדרת פלסמיד CRISPR ספציפי על E12.5, אשר יכול להשפיע באופן משמעותי על התפתחות העובר מאמצע עד סוף ההריון23,24. בניגוד לגישות טרנסגניות, אך בדומה להשראות נגיפיות או הפרעות RNA, טכניקה זו מאפשרת ביטוי יתר או נוקאאוט בנקודות זמן מסוימות באמצעות גישה כירורגית מתקדמת יחסית, ובכך מונעת שליה לקויה אפשרית או קטלניות עוברית משינויים מוקדמים יותר. מכיוון שרק שליות מעטות מקבלות את פלסמיד הניסוי או הבקרה בתוך המלטה, הגישה מאפשרת שני סוגים של בקרות פנימיות. בקרות אלה הן אלה המוזרקות ומתחשמלות עם פלסמיד הבקרה המתאים ואלה שאינן מקבלות מניפולציה ישירה. טכניקה זו הותאמה ליצירת ביטוי יתר של הגן IGF-1 בשליית העכבר באמצעות פלסמיד CRISPR מתווך הפעלה סינרגיסטי (SAM). הגן IGF-1 נבחר, שכן IGF-1 הוא הורמון גדילה חיוני המועבר לעובר ומיוצר בעיקר בשליה לפני הלידה25,26. טכניקת CRISPR חדשה ממוקדת שליה זו תאפשר מניפולציה ישירה שתסייע להגדיר את הקשר בין תפקוד השליה להתפתחות העובר.

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל שפופרות</td><td>USA Scientific Inc</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformeldhyde (PFA) ב-PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J61899. </td><td></td>AP</tr><tr><td>96 באר צלחת</td><td>קורנינגס</td><td>3598</td><td>לערכת BCA</td></tr><tr><td>רפידות תחתונות סופגות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>בקרת הפעלה פלסמיד</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-437275</td><td>מים ללא דנאז המסופקים לדילול</td></tr><tr><td>AMV טרנסקריפטאז הפוך ניו</td><td>אינגלנד ביולאבס</td><td>M0277L</td><td>שימוש לסינתזה cDNA</td></tr><tr><td>הרדמה וופייזור גז</td><td>Vetamac</td><td>VAD-601TT</td><td>VAD-קומפקטי וופורייזר</td></tr><tr><td>דמעות מלאכותי ג'ל</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>BCA ערכת בדיקת חלבון</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td>כימות חלבון</td></tr><tr><td>Biovortexer</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>198050000</td><td>הומוגנייזר רקמות כף יד</td></tr><tr><td>CellSens Software</td><td>Olympus</td><td>V4.1.1</td><td>עיבוד תמונה לתמונות FISH.</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628168</td><td>צנטריפוגה צלחת</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>J67241-AP</td><td>בידוד RNA</td></tr><tr><td>אפליקטורים עם קצה כותנה</td><td>ProAdvantage</td><td>77100</td><td>עיקור לפני השימוש</td></tr><tr><td>CRISPR/Cas9 בקרת פלסמיד</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-418922</td><td>מים ללא דנאז המסופקים לדילול</td></tr><tr><td>CryoStat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>דיסקציה מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>M125 C</td><td>משמש להדמיה לאחר נקרוסקופיה</td></tr><tr><td>תפרים נמסים</td><td>Med Vet International</td><td>J385H</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים</td><td>Gibco</td><td>15230162</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td> <td>Thermo fisher Scientific</td><td>14190144</td><td>(-) סידן; (-) מגנזיום</td></tr><tr><td>ECM 830 אלקטרו אלקטרופורטור (מכונת אלקטרופורציה)</td> <td>BTX הרווארד מכשיר</td><td>45-0662</td><td>גנרטור בלבד</td></tr><tr><td>סכין גילוח חשמלי</td><td>Wahl</td><td>CL9990</td><td></td></tr><tr><td>משוטי אלקטרופורציה מדעיים של קנט / פינצטה</td><td>BTX הרווארד מכשיר</td><td>45-0487</td><td>משוטים בקוטר 3 מ"מ; חוטים כלולים</td></tr> קלטת <tr><td>הטבעה: 250 PK</td><td>Grainger</td><td>21RK94</td><td>קלטות הטמעת שליה</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>268280010</td><td></td></tr><tr><td>מיכלי F-Air Penn</td><td>Veterinary Supply Inc</td><td>BIC80120</td><td>מסנן איזופלורן עודף</td></tr><tr><td>צבע ירוק מהיר FCF</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td>להתמוסס ל 1 &mu; גרם/מ"ל ומסנן; להגן מפני אור</td></tr><tr><td>פוטומטר מיקרופלייט מבוסס פילטר (קורא צלחות)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14377576</td><td>יכול לשמש עבור BCA ו-ELISA</td></tr><tr><td>Ocps</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>קצות עדינים, ישר ומשונן</td></tr><tr><td>, ניטרלי חוצץ, 10%</td> <td>נימי זכוכית HT501128</td><td></td><td></td>סיגמא אולדריץ'</tr><tr><td>- זכוכית בורוסיליקט (מיקרופיפטה)</td><td>מכשיר</td> <td>סאטרB150-86-10</td><td>OD: 1.5 מ"מ, תעודת זהות: 0.86 מ"מ, אורך 10 ס"מ</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב עצירת פרוטאז ופוספוטאז (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861281</td><td>מאגר הומוגניזציה של חלבון</td></tr><tr><td>כרית חימום Thermotech</td><td></td><td>S766D</td><td>Digitial Moist Heating</td></tr><tr><td>Pad Hemostats</td><td>VWR</td><td>10806-188</td><td>לסת מוגמרת לחלוטין;</td></tr><tr><td>אמבט מים חמים</td> מעוקל <td>Fisher Scientific</td><td>20253</td><td>Isotemp 205</td></tr><tr><td>Igf-1 SAM פלסמיד (m1)</td> <td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-421056-ACT</td><td>מים ללא דנאז מסופקים לדילול</td></tr><tr><td>תא אינדוקציה</td><td>Vetamac</td><td>941443</td><td>אין צורך בגודל ליטר ספציפי</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Pharma Limited</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>בידוד RNA</td> <td>איזופרופונלי/2-פרופונלי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A451-4</td></tr><tr><td>קטמין הידרוכלוריד 100 מ"ג/מ"ל</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-114-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2/Magneisum Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63069-100ML</td><td>1M. מאגר הומוגניזציה של חלבון</td></tr><tr><td>MicroAmp&trade; צלחת תגובה אופטית 384 בארות עם ברקוד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>4309849</td><td>לוחות ברקודים אין צורך</td></tr><tr><td>בקצה מיקרו-נימי</td><td>Eppendorf</td><td>5196082001</td><td>מחובר למיקרו-מזרק BTX</td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק</td><td>BTX מכשיר הרווארד</td><td>45-0766</td><td>מחזיק פיפטות נירוסטה, אורך 130 מ"מ, עבור 1 עד 1.5 מ"מ פיפטות</td></tr><tr><td>Microject 1000A (מכונת הזרקה)</td> <td>BTX מכשיר הרווארד</td><td>45-0751</td><td>MicroJect 1000A Plus System</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה דגם P-97</td><td>מכשיר סאטר</td><td>P-97</td><td>חולץ מיקרופיפטה מסוג בוער/חום</td></tr><tr><td>מיקסר מיקרופלייט (שייקר צלחות)</td> <td>scilogex</td><td>822000049999</td><td></td></tr><tr><td>עכבר/עכברוש IGF-I/IGF-1 ערכת קוונטיקין ELISA</td><td>R & D Systems</td><td>MG100</td><td></td></tr><tr><td>Needles</td><td>BD - Becton, Dickson, and Company</td><td></td><td>305106 30 Gx 1/2 (0.3 מ"מ x 13 מ"מ)</td></tr> <tr><td>Nitrogen Tank</td><td>Linde</td><td>7727-37-9</td><td>כל גז אינרטי</td></tr><tr><td>תרופה נוגדת דלקת שאינה סטרואידית (NSAID)</td><td>Norbrook Laboratories Limited</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>אנלסגי כגון Meloxicam</td></tr><tr><td>Nose</td><td>Cone Vetamac</td><td>921609</td><td>9-14 מ"מ</td></tr><tr><td>צבע זיהוי אופל 620</td><td>Akoya Biosciences</td><td>SKU FP1495001KT</td><td>משמש</td></tr><tr><td>לתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T) של</td> FISH <td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>מיכל חמצן</td><td>Linde</td><td>7782 - 44 - 7</td><td>חמצן בדרגה</td></tr><tr><td>רפואית Pestles</td><td>USA Scientific Inc</td><td>14155390</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פובידון-יוד, 5%</td> <td>Avrio Health L.P.</td><td>NDC 67618-155-16</td><td></td></tr><tr><td>כוח SYBR&trade; Green PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4367659</td><td>שימוש עבור</td></tr><tr><td>בוחנים אקראיים qPCR (פריימרים אקראיים)</td> <td>New England Biolabs</td><td>S1330S</td><td>שימוש לסינתזת cDNA</td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>Grainger</td><td>26X080</td><td></td></tr><tr><td>RNA ערכת ניקוי & רכז</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNALater</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>ערכת RNAscope v.2.5</td><td>Advanced Cells Diagnostics</td><td>323100</td><td>מכיל את כל הריאגנטים הנדרשים להכלאה פלואורסצנטית באתרה. בדיקות נמכרות בנפרד.</td></tr><tr><td>RNAscope ומסחר; בדיקה- MM-PRL8A8-C2</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>&nbsp; 528641-C2</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope ומסחר; בדיקה- Vector-dCas9-3xNLS-VP64</td><td>אבחון תאים מתקדמים</td><td>527421</td><td></td></tr><tr><td>Roto-Therm Mini</td><td>Benchmark</td><td>R2020</td><td>תנור יבש למספריים הכלאה באתרו</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td>מספריים לניתוח, קצה חד, 4&sup1;/?</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (מי מלח)</td><td>Hospra</td><td>NDC 0409-4888-03</td><td>סטרילי,&nbsp; 0.9%</td></tr> <tr><td>נתרן ציטראט, מלח טריסודיום, דיהידרט, [חומצת לימון, טריסודיום דיהידרט]</td><td>מוצר מחקר בינלאומי</td><td>03-04-6132</td><td></td></tr><tr><td>תרכיז נתרן הידרוקסיד 1N, פישר כימיקל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>SS277</td><td>חוצץ הומוגניזציה של חלבון</td></tr><tr><td>ספינת קיטור</td><td>בלה</td><td>B00DPX8UBA</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Surgical</td><td>Drape Busse</td><td>696</td><td>לעקר לפני השימוש</td></tr><tr><td>Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath כיסוי זכוכית 24x60</td><td>Leica</td><td>3800160</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים</td><td>BD - Becton, Dickson, and Company</td><td>309659</td><td>BD Luer Slip Tip מזרק סטרילי, לשימוש חד פעמי, 1 מ"ל</td></tr><tr><td>תרמו סיינטיפיק ומסחר; Invitrogen ומסחר; ננו-דרופ וסחר; ספקטרופוטומטר אחד עם WiFi ו-Qubit&trade; 4 פלואורומטר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-400-525</td><td>תצורה זו מגיעה עם פלואורומטר קיוביט 4.&nbsp; אין צורך בכימות קיוביטים.</td></tr><tr><td>דבק רקמות</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>VetBond</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15568025</td><td>1M. מאגר הומוגניזציה של חלבון</td></tr><tr><td>TRIzol&trade; ריאגנט</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>15596018</td><td>בידוד RNA</td></tr><tr><td>TSA חבילת חיץ תאים</td><td>מתקדמים אבחון</td><td>322810</td><td>משמש לדילול צבע זיהוי אופל 620</td></tr><tr><td>אוניברסלי F-Circuit</td><td>Vetamac</td><td>40200</td><td>מחובר לאביזרי אידוי וופורייזר מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>מורכב זקוף</td><td>אולימפוס</td><td>BX61VS</td><td>משמש להדמיית FISH</td></tr><tr><td>Vectorshield עם DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>מדיית הרכבה Coverslip</td></tr><tr><td>ViiA &trade; 7 מערכת PCR בזמן אמת עם 384 בארות</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 4453536</td><td>זה מיועד לזיהוי בלוקים של SYBR 384 בארות. TaqMan ו/או בלוקים קטנים יותר זמינים</td></tr><tr><td>לק Wet n Wild Shine, מגן ציפורניים שקוף, צבע ציפורניים</td><td>Amazon</td><td>C450B</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין 20 מ"ג/מ"ל</td><td>Anased</td><td>343730_RX</td><td></td></tr></tbody></table>

עכבר ב- vivo שליה ממוקד מניפולציה crispr

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

השליה היא איבר חיוני המווסת ומשמר את התפתחות היונקים ברחם. השליה אחראית על העברת חומרי מזון ופסולת בין האם לעובר ועל ייצור ואספקה של גורמי גדילה והורמונים. מניפולציות גנטיות שליה בעכברים הן קריטיות להבנת התפקיד הספציפי של השליה בהתפתחות טרום לידתי. לעכברים טרנסגניים בעלי ביטוי Cre ספציפי לשליה יש יעילות משתנה, ושיטות אחרות למניפולציה של גנים שליה יכולות להיות חלופות שימושיות. מאמר זה מתאר טכניקה לשינוי ישיר של ביטוי גנים שליה באמצעות מניפולציה של גן CRISPR, אשר ניתן להשתמש בה כדי לשנות את הביטוי של גנים ממוקדים. באמצעות גישה כירורגית מתקדמת יחסית, סכרים בהריון עוברים לפרוטומיה ביום העוברי 12.5 (E12.5), ופלסמיד CRISPR מועבר על ידי מיקרופיפטה זכוכית לתוך השליה הבודדת. הפלסמיד מחושמל מיד לאחר כל הזרקה. לאחר התאוששות הסכר, השליות והעוברים יכולים להמשיך בהתפתחות עד להערכה בנקודת זמן מאוחרת יותר. הערכת השליה והצאצאים לאחר השימוש בטכניקה זו יכולה לקבוע את התפקיד של תפקוד השליה הספציפי לזמן בהתפתחות. סוג זה של מניפולציה יאפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו גנטיקה ותפקוד של שליה משפיעים על גדילת העובר והתפתחותו בהקשרים של מחלות מרובות.

תוצאות כלליות של הליכים (איור 6) במחקר היו שלוש קבוצות שעברו מניפולציה. אלה כללו שליות שהוזרקו עם פלסמיד בקרה כללי CRISPR Cas9 (Cas9 Control), פלסמיד CRISPR בקרת הפעלה (Act Control), או פלסמיד הפעלת IGF-1 SAM (Igf1-OE). בקרת Cas9 מתאימה יותר לפלסמידים נוקאאוט, ובקרת ההפעלה מתאימה יותר לפלסמידים של ביטוי יתר/הפעלה. כדי להעריך את שינויי הכדאיות הנגרמים על-ידי מניפולציה של השליות באמצעות הזרקה והתחשמלות, הישרדות העוברים בתוך המלטה נותחה ב-E...

כאן אנו מתארים שיטה ספציפית לזמן כדי לתפעל ביעילות מסלולים התפתחותיים קריטיים בשליית העכבר in vivo. זה מבוצע באמצעות הזרקה ואלקטרופורציה של פלסמידים CRISPR לתוך השליות של סכרים בהריון ביום העוברי 12.5.

עכבר ב- Vivo שליה ממוקד מניפולציה CRISPR

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients ...

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר מניפולציה ממוקדת ספציפית לזמן של שליות עכבר באמצעות CRISPR. זה יאפשר לחוקרים להבהיר תפקודים גנטיים ספציפיים במהלך אמצע עד סוף ההריון. מניפולציות גנטיות הגורמות לביטוי יתר בתוך שליית העכבר הן נדירות מאוד.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מגוון של שינויים בביטוי גנים בתוך השליה. אל תתייאש אם מונחים ראשוניים יש טכניקה זו אינם מוצלחים. מכיוון שטכניקה זו מאתגרת, זה דורש לא מעט זמן להתאמן כדי לשלוט.כדי להתחיל, מניחים את שכיבת הסכר המורדם עם חרוט אף לשמירה על הרדמה באזור ההכנה. לגלח היטב את בטן הסכר. כדי למנוע התייבשות הקרנית, יש להניח ג'ל דמעות מלאכותי על שתי עיני הסכר.לאחר מכן השתמשו באפליקטורים סטריליים מכותנה כדי לחטא את אתר הניתוח עם לפחות שלושה סבבים לסירוגין של תמיסת פובידון-יוד, ואחריה 70% אתנול עם ציפוי סופי של תמיסת פובידון-יוד. לאחר ההכנה, העבירו את הסכר עם חרוט אף ההרדמה לאזור הניתוח המיועד. עבור laparotomy הרחם, מניחים את הסכר שכיבה על שולחן הניתוחים ולאבטח את חרוט האף במקומו עם נייר דבק.הניחו כרית חימום מתחת לפד סופג לטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס. לאחר אישור עומק ההרדמה באמצעות חוסר רפלוקס צביטת בוהן, השתמש במלקחיים ובמספריים כדי לבצע חתך מקו האמצע של כשני סנטימטרים דרך העור המאוהל. לאחר מכן בצע חתך אנכי דרך הצפק באמצעות מלקחיים סטריליים, בעדינות אוהל הרחק מקרני הרחם.לעסות את שתי קרני הרחם על ידי לחיצה משני צדי הבטן עם אצבעות כדי להנחות אותם. הניחו את הרחם החשוף על גבי וילונות כירורגיים סטריליים המונחים מעל הבטן התחתונה ושמרו אותו לח בעזרת טיפות מלח סטרילי חם לפי הצורך. לאחר שהרחם נחשף, בחר שלושה זוגות שליות למניפולציה.רשום את המיקום של מניפולציות שליה ואת הארגון של העוברים בתוך קרני הרחם. עבור הזרקת השליה של פלסמיד הבקרה, לטעון כמות מספקת של פלסמיד הבקרה המתאים עבור שלוש זריקות באמצעות micropipette מכויל. לבצע את כל ההזרקות בין אזור ההחלטה לאזור הצומת בעומק של כ-0.5 מילימטרים לרוחב לתוך השליה.לאחר ההזרקה אך מיד לפני ההתחשמלות יש לצפות את מקומות המגע במי מלח סטריליים, ולמרוח את המלח בדיוק על שלושת האתרים בדופן הרחם והמשוטים בטפטפת או מזרק. תוך שתי דקות מההזרקה יש לבצע אלקטרופורציה באמצעות זוג משוטים בקוטר שלושה מ"מ המחוברים למכונת אלקטרופורציה. כדי להבטיח יעילות שילוב CRISPR ואת הכדאיות של עוברים, כוונן את ההגדרות ל- 30 וולט, פעימה של 30 אלפיות השנייה, שתי פעימות, פעימה של 970 מילי-שנייה כבויה וחד-קוטבית.לחץ בעדינות על משוטי האלקטרופורציה מעל דפנות הרחם בצדדים הצדיים של השליה. מניחים את משוט האנודה מעל אתר ההזרקה ואת הקתודה ישירות ממול. לחץ על הדופק במכונת האלקטרופורציה והמתן להשלמת שני הפולסים לפני הסרת משוטי האלקטרופורציה.לאחר מכן המשך להזרקת שליה של פלסמיד ניסיוני כפי שהודגם קודם לכן. בצע אלקטרופורציה של כל שלוש השליות המוזרקות הניסיוניות תוך שתי דקות מההזרקה כפי שבוצע עבור קבוצת הביקורת. לאחר השלמת מניפולציית השליה, עסו בעדינות את קרני הרחם בחזרה לתוך חלל הבטן באמצעות אצבעות בלבד כדי לתפעל ישירות את קרני הרחם.בצע תפרים קטועים על שכבת הצפק באמצעות תפרים מצופים קלועים קלועים באורך 45 ס"מ עם סגסוגת מחט מעגל 13 מ"מ, שלוש שמיניות. לאחר תפירת שכבת הצפק, תפרו את העור בתפרים נמסים באמצעות אותו סוג של תפרים נמסים המשמשים לצפק. לאחר סיום התפירה, יש למרוח דבק רקמות על התפרים שעל העור.כאשר דבק הרקמה התייבש, כבו את הוופורייזר והעבירו את הסכר מאזור הניתוח לכלוב תומך על גבו. לשליות הוזרקו פלסמיד בקרה כללי מסוג CRISPR Cas9 ופלסמיד CRISPR בקרת הפעלה או פלסמיד הפעלת IGF-1 SAM. התמונות המייצגות שלאחר נקרופסי לא הראו נזק ניכר או שינוי במראה הפנוטיפי באף קבוצת טיפול.שיעור ההישרדות של העוברים הלא מטופלים בהמלטות שעברו מניפולציה ירד לממוצע של 79.05% בעוד שחלה ירידה משמעותית בהישרדות העוברים שעברו מניפולציה בממוצע של 55.56%לא היה הבדל משמעותי במשקל השליה של אף קבוצה. לא היה הבדל משמעותי בעלייה במשקל האימהית מיד לאחר הניתוח בהשוואה לניתוחי דמה. סכרים הריוניים רבים הציגו ירידה קלה או ללא שינוי במשקל ביום שלאחר ההליך, ככל הנראה עקב הפרעות אכילה במהלך הניתוח ולאחריו.רוב הסכרים הראו עלייה במשקל ב-E14.5, אך מדי פעם עדיין נצפתה ירידה במשקל. בדיקת qPCR הראתה עלייה משמעותית בביטוי IGF-1 בשליות עם ביטוי יתר של IGF-1 לעומת שליות הביקורת. הערכת ELIZA של שליות E14.5 הראתה עלייה משמעותית ברמות חלבון IGF-1 בשליות עם ביטוי יתר של IGF-1 לעומת שליות הביקורת.אוטופלואורסצנטיות ירוקה הדגימה את תת-האזורים של ממשק העובר של השליה האימהית עם תיוג Cas9 אדום רק בשליית ביטוי היתר IGF-1, מה שמצביע על שילוב מוצלח של CRISPR בכל שלושת תתי האזורים של השליה. הפלואורסצנט בסימון הכלאה C2 אישר את שילובו של פלסמיד ההפעלה IGF-1 ללא נדידה לשליות לא מטופלות. ניתן היה לזהות את אזור הנשירים והמבוך סביב אזור הצומת האדום המסומן בצביעת Prl8a8.זכור לרשום את סוג המניפולציה והמיקום של השליות והעוברים המתאימים. מומלץ מאוד לרשום את מיקום צוואר הרחם והעוברים בתוך קרני הרחם. לאחר הליך זה, ניתן לבצע ניתוח של השליה, העובר והסכר.זה יאפשר הבנה טובה יותר של גנים תפקידים ספציפיים לשליה בהריון, תפקוד שליה והתפתחות עוברית.

mouse-in-vivo-placental-targeted-crispr-manipulation

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של...

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

nucleases מעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וnucleases מפעיל כמו activator-שעתוק (TALENs) יכול לשמש כדי לשנות את הגנום של עוברי preimplantation עכבר על ידי מפעילה שני סוף nonhomologous להצטרף (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית מסלולים (HR). מקדמות אלה לאפשר את הדור המהיר של עכברים עם שינויים גנטיים מדויקים.

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

Microinjection של ביציות העכבר משמש בדרך כלל עבור transgenesis קלאסי ( כלומר, שילוב אקראי של transgenes) ו CRISPR בתיווך גישור המיקוד. פרוטוקול זה סוקר את ההתפתחויות האחרונות microinjection, עם דגש מיוחד על בקרת איכות אסטרטגיות genotyping.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

פונקציות תא-אוטונומי של גנים במוח יכולים להילמד על ידי גרימת הפסד או רווח של פונקציה באוכלוסיות דלילה של תאים. כאן, אנו מתארים בתוך הרחם אלקטרופורציה לספק Cre recombinase לאוכלוסיות דליל לפתח נוירונים בקליפת המוח עם הגנים floxed לגרום לאובדן פונקציה בתוך vivo.

גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה

כאן, אנו מציגים שיטה ששונתה עבור הקפאת הזמנות של עוברי תא אחד, כמו גם פרוטוקול כי זוגות השימוש של עוברים הקפאת להקפיא ואלקטרופורציה עבור הדור היעיל של עכברים מהונדסים גנטית.

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

כאן אנו מתארים מתודולוגיית הקרנה מהירה וישירה vivo CRISPR /Cas9 באמצעות אולטרסאונד מונחה זריקות lentiviral עוברי הרחם כדי להעריך בו זמנית פונקציות של מספר גנים בעור וחלל הפה של עכברים immunocompetent.

ב Vivo CRISPR / Cas9 הקרנה בו זמנית להעריך תפקוד גנים בעור העכבר וחלל הפה

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להזריק לעכבר את חלל מי השפיר ב-E7.5 עם לנטי-וירוס, מה שמוביל להתמרה אחידה של כל הצלחת העצבית, עם השפעה מזיקה מינימלית על ההישרדות או ההתפתחות העוברית.

מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (NEPTUNE) ביום עוברי 7.5

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח מודלים של עכברים מהונדסים גנטית באמצעות תאי גזע עובריים, במיוחד עבור דנ"א גדול (KI). פרוטוקול זה מכוונן באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9, וכתוצאה מכך יעילות KI משופרת באופן משמעותי בהשוואה לשיטת מיקוד הדנ"א הליניארי ההומולוגית הקונבנציונלית בתיווך רקומבינציה.

מיקוד גנים יעיל ביותר בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית

פרוטוקול זה מתאר מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה in vivo לעריכת גנום בתיווך קריספר מוגבלת אזורית באובידוקט העכבר.

מודלים של עכברים מהונדסים בגנום סומטי המשתמשים במיקרו-הזרקה ובאלקטרופורציה של Vivo

למד מניפולציה ממוקדת של שליית עכבר באמצעות CRISPR לחקירת פונקציות גנים בהריון. השיטה כוללת הזרקת פלסמידים ואלקטרופורציה ביום עוברי 12.5 לשינויי ביטוי גנים.

עכבר ב- Vivo שליה ממוקד מניפולציה CRISPR

גלה סרטונים נוספים