Name: מיאלינציה חוץ גופית של אקסונים היקפיים בתרבות משותפת של שורשי חולדה, גנגליון גבי, צמחים ותאי שוואן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: למד מיאלינציה של העצבים ההיקפיים בשיטת תרבית משותפת של שורשי חולדה ותאי שוואן. מודל זה מאפשר כימות מיאלין ומחקר אינטראקציות אקסון-שוואן לסינון תרופות במחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפרופ' ד"ר ראלף גולד ולד"ר גיזה אלריכמן על הייעוץ והתמיכה.

<ol><li>Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+cell+body+size%2C+axon+size%2C+and+signal+conduction+velocity+for+individually+labelled+dorsal+root+ganglion+cells+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).</li>
<li>Taveggia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells-axon+interaction+in+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Schwann cells-axon interaction in myelination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).</li>
<li>Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+regeneration+and+muscle+reinnervation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652(2020).</li>
<li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).</li>
<li>Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+injury+and+myelination%3A+Potential+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).</li>
<li>Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+Schwann+cell+proliferation.+III.+Evidence+for+the+surface+localization+of+the+neurite+mitogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen.</a> The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).</li>
<li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li>
<li>Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+axon-related+Schwann+cells+in+vitro.+I.+Ascorbic+acid+regulates+basal+lamina+assembly+and+myelin+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation.</a> The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).</li>
<li>Paivalainen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+mouse+dorsal+root+ganglion%2FSchwann+cell+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).</li>
<li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140 (4), 898-913 (2017).</li>
<li>Taveggia, C., Bolino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRG+neuron%2FSchwann+cells+myelinating+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).</li>
<li>Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+versatile+method+for+the+isolation%2C+purification+and+cryogenic+storage+of+Schwann+cells+from+adult+rodent+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves.</a> Scientific Reports. 6, 31781(2016).</li>
<li>Pitarokoili, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+triamcinolone+acetonide+exerts+anti-inflammatory+effects+on+Lewis+rat+experimental+autoimmune+neuritis+and+direct+anti-oxidative+effects+on+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58(2019).</li>
<li>Grüter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+and+anti-oxidative+effect+of+the+direct+TRPV1+receptor+agonist+capsaicin+on+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145(2020).</li>
<li>Lehmann, H. C., Höke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+as+a+therapeutic+target+for+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+%26+Neurological+Disorders+-+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies.</a> CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).</li>
<li>Joshi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Schwann+cell+plasticity+in+chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy+%28CIDP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP).</a> Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255(2016).</li>
<li>Klimas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+immunomodulatory+effects+of+bortezomib+in+experimental+autoimmune+neuritis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Communications%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis.</a> Brain Communications. 3 (4), (2021).</li>
<li>Szepanowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPA1+signaling+drives+Schwann+cell+dedifferentiation+in+experimental+autoimmune+neuritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis.</a> Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293(2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מהיר וקל ליצירת מיאלינציה חוץ גופית על ידי מיזוג שתי תרביות נפרדות מסוג תאים, תאי Schwann וצמחי גנגליון שורש גבי.
שלב קריטי בפרוטוקול הוא גידול צמחי DRG, במיוחד בימים הראשונים של התרבות. DRG הם שבירים מאוד לפני בניית רשת אקסונלית חזקה ויש לטפל בהם בזהירות רבה, למשל, כאשר מוציאים אותם מהאינקובטור או במהלך שינוי תווך. DRG שמתנתקים מקרקעית הבאר ונמצאים שוחים במדיום מראים טיפוח לא מוצלח. עבור תאי Schwann, שינוי שיעורי ההתרבות עקב תנאי גידול שונים ותוספי מזון (למשל...

במערכת העצבים ההיקפית (PNS), העברת מידע מהירה מתווכת על ידי אקסונים עטופים במיאלין. המיאלינציה של אקסונים חיונית כדי לאפשר התפשטות מהירה של דחפים חשמליים, שכן מהירות ההולכה של סיבי העצב מתואמת לקוטר האקסון ועובי המיאלין1. איתות חושי מהפריפריה למערכת העצבים המרכזית (CNS) מסתמך על הפעלה של נוירונים חושיים מסדר ראשון השוכנים בהגדלות של השורש הגבי, המכונים גרעיני שורש גבי (DRG). עבור היווצרות ותחזוקה של מיאלין, תקשורת רציפה בין אקסונים ותאי Schwann, שהם תאי Glia myelinating ב- PNS, היא חובה2.
מחלות רבות של מערכת העצבים הפארא-סימפתאית מפריעות להתמרה של מידע על-ידי נזק אקסונלי ראשוני או דמיאלינטינג, וכתוצאה מכך להיפסטזיה או דיססתזיה. לנוירונים חושיים מסדר ראשון יש את היכולת להתחדש במידה מסוימת לאחר נזק עצבי, על ידי אינטראקציה מורכבת בין תא העצב לבין תאי שוואן הסובבים אותו3. במקרה זה, תאי Schwann יכולים לעבור תכנות מחדש של תאים כדי לנקות פסולת אקסונלית כמו גם מיאלין ולקדם התחדשות אקסונלית, וכתוצאה מכך רמיאלינציה4. הבנת מנגנוני המיאלינציה בבריאות ובמחלות חשובה, על מנת למצוא אפשרויות טיפול אפשריות להפרעות דה-מיאלינציה של מערכת העצבים הפארא-סימפתטית. מיאלין יכול להיפגע גם על ידי נוירוטראומה חריפה, וגישות לקידום מיאלינציה לקידום התאוששות תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית נמצאות תחת חקירה5.
הידע שלנו על מיאלינציה היקפית הפיק תועלת רבה מתרביות מיאלינטיות של תאי Schwann ונוירונים חושיים. מאז הגישות הראשונות יושמו 6,7,8, myelination נחקר באופן אינטנסיבי עם שימוש במערכות coculture שונות9,10,11. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מהיר וקל עבור myelination in vitro חזק של אקסונים גנגליון שורש גבי. הפרוטוקול להכנת תאי Schwann מבוסס על הפרוטוקול של Andersen et al.12, שפורסם בעבר ב-Pitarokoili et al.13. אנו משתמשים בתאי Schwann שמקורם בחולדות צעירות ובתרביות DRG עובריות עבור התרבות המשותפת, שבה המיאלינציה מתרחשת בסביבות היום ה-14. מטרת השיטה היא לספק מערכת שתחקור את היווצרות המיאלין כתוצאה מאינטראקציה ישירה בין תאי אקסון-שואן, ולחקור מודולטורים של מיאלינציה של מערכת העצבים הפארא-סימפתטית. בהשוואה לתרביות תאים עצביים מנותקים, צמחי DRG נשמרים יותר אנטומית ויוצרים תהליכים אקסונליים ארוכים. כימות של אזור האקסון המיאלינטי מספק קריאה מספקת למיאלינציה בקוקולטור. השיטה היא כלי רב ערך לסינון תרכובות טיפוליות עבור השפעתן הפוטנציאלית על מיאלינציה של מערכת העצבים הפאראסימפת-דלקתית, וניתן להשתמש בה גם בנוסף למחקרי in vivo במודלים של בעלי חיים14.

<table><tbody><tr><td>Anti-MBP, ארנב</td><td>Novus Biologicals, Centannial, ארה"ב</td><td>ABIN446360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&szlig; III-טובולין, עכבר&nbsp;</td><td>Biolegend, סן דייגו, ארה"ב</td><td>657402</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה&nbsp;</td><td>A4403-100MG</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27</td><td>תרמו פישר מדעי, שוורטה, גרמניה&nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>קצה מסנן ביוספרה, 100 ומיקרו; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70760212 קצה מסנן ביוספרה, 1250 ומיקרו; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>701186210 קצה מסנן ביוספרה, 20 ומיקרו; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>701114210 קצה מסנן ביוספרה, 300 ומיקרו; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>70765210</tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>קארל רוט, קרלסרוהה, גרמניה&nbsp;</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים, 100 ומיקרו; M</td><td>BD Bioscience, היידלברג, גרמניה</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810-R</td><td>Eppendorf AG, המבורג, גרמניה</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>CO2 חממת Heracell</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>51017865</tr><tr><td>כיסויים 12 מ"מ</td><td>Carl Roth, קרלסרוהה, גרמניה&nbsp;</td><td>P231.1</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים מעוקלים&nbsp;</td><td>Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה</td><td>11370-42</td><td></td></tr><tr><td>DAPI fluoromount-G(R)</td><td>Biozol, Eching, גרמניה</td><td>SBA-0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>4942078001</tr><tr><td>מים מזוקקים (מערכת טיהור מים)&nbsp;</td><td>Millipore, Molsheim, France</td><td>ZLXS5010Y</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>31331093</tr><tr><td>DPBS (ללא Ca2+ וללא Mg2+)</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה&nbsp;</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>אתנול&nbsp;</td><td>VWR, רדנור, ארה"ב&nbsp;</td><td></td><td></td>1009862500</tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה&nbsp;</td><td>F7524</td><td>FCS חייב להיבדק עבור תרבית תאים של שוואן</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה&nbsp;</td><td>F6886-10MG</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה&nbsp;</td><td>G1393-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Thermo Fisher Scientific, שוורטה, גרמניה</td><td>5710064</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific, שוורטה, גרמניה&nbsp;</td><td>A11036</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב IgG Alexa Fluor 568</td><td>תרמו פישר מדעי, שוורטה, גרמניה&nbsp;</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (ללא Ca2+ וללא Mg2+)&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, שוורטה, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>14170138</tr><tr><td>HERAcell Incubator</td><td>Heraeus Instruments, הנאו, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>51017865</tr><tr><td>Heraguard ECO 1.2</td><td>Thermo Fisher Scientific, שוורטה, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>51029882 סרום סוסים</td><td>Pan-Biotech, איידנבך, גרמניה</td><td>P30-0712</td><td></td></tr><tr><td>Image J Software</td><td>HIH, בת'סדה, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה&nbsp;</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>לייבוביץ ואקוטי; s L-15 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, שוורטה, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>11415064</tr><tr><td>L-גלוטמין 200 mM&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, שוורטה, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>25030024</tr><tr><td>MACS Multistand&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, גרמניה</td><td>130042303</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ&nbsp;</td><td>מוטיק, וצלר, גרמניה</td><td>מוטיק BA 400</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Axio observer 7</td><td>Zeiss, Oberkochen, גרמניה&nbsp;</td><td>491917-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ</td><td>VWR, רדנור, ארה"ב&nbsp;</td><td>630-1985</td><td></td></tr><tr><td>מפריד MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec , ברגיש גלדבאך, גרמניה</td><td>130091632</td><td></td></tr><tr><td>עמודות MS</td><td>Miltenyi Biotec , ברגיש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירת נויבאואר&nbsp;</td><td>עוזר, ארלנגן, גרמניה</td><td>40441 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neuregulin</td><td>Peprotech, רוקי היל, ארה"ב</td><td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, שוורטה, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>NGF</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה&nbsp;</td><td>N1408</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Biozol, Eching, גרמניה</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon & Delta; מנות מרובות, 4 באר</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה&nbsp;</td><td>D6789</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>אקרוס אורגני, ניו ג'רזי, ארה"ב&nbsp;</td><td></td><td></td>10342243</tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>תרמו פישר מדעי, שוורטה, גרמניה&nbsp;</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Eppendorf AG, המבורג, גרמניה</td><td>4430000018&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf AG, המבורג, גרמניה</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה&nbsp;</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא אולדריץ' GmbH, שטיינהיים, גרמניה&nbsp;</td><td>צינורות תגובה P4707-50ML</td><td></td></tr><tr><td>, 15&nbsp; מ"ל</td><td>סארסטדט, N&uuml; mbrecht, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>62554502</tr><tr><td>צינורות תגובה, 50&nbsp; מ"ל</td><td>סארסטדט, N&uuml; mbrecht, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>62547254</tr><tr><td>כלי תגובה, 1.5 מ"ל</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>72690001 ארון בטיחות S2020 1.8</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, שוורטה, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>51026640</tr><tr><td>מספריים</td><td>Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה</td><td>14083-08</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית, 10 מ"ל</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>861254025</tr><tr><td>פיפטה סרולוגית, 25 מ"ל</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>861685001</tr><tr><td>פיפטה סרולוגית, 5 מ"ל</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>861253001</tr><tr><td>Spatula</td><td>Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה</td><td>10094-13</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope Discovery.V8</td><td>Zeiss, Oberkochen, גרמניה&nbsp;</td><td>495015-0012-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>TC צלחת 100, תא +</td> <td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>833902300</tr><tr><td>צלחת TC 35, תא +</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>833900300</tr><tr><td>צלחת TC 60, תא +</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>833901300 Thy-1 Microbeads (ערכת MACS)</td><td>Miltenyi Biotec , ברגיש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-094-523</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה&nbsp;</td><td>תמיסת טריפן כחולה X100-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>0.4%&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, שוורטה, גרמניה&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>טריפסין (2.5%), ללא פנול אדום</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, גרמניה&nbsp;</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, שוורטה, גרמניה&nbsp;</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>סוג I קולגנאז</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה&nbsp;</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים מסוג 1008</td><td>GFL, בורגוודל, גרמניה&nbsp;</td><td>4285</td><td></td></tr></tbody></table>

מיאלינציה חוץ גופית של אקסונים היקפיים בתרבות משותפת של שורשי חולדה, גנגליון גבי, צמחים ותאי שוואן

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

תהליך המיאלינציה חיוני כדי לאפשר העברת אותות מהירה ומספקת במערכת העצבים. במערכת העצבים ההיקפית, נוירונים ותאי Schwann עוסקים באינטראקציה מורכבת כדי לשלוט במיאלינציה של אקסונים. הפרעות של אינטראקציה זו והתמוטטות של נדן המיאלין הם סימני היכר של נוירופתיות דלקתיות ומתרחשות באופן משני בהפרעות נוירודגנרטיביות. כאן, אנו מציגים מודל קוקולטורה של צמחי גנגליון שורש גבי ותאי Schwann, אשר מפתח מיאלינציה חזקה של אקסונים היקפיים כדי לחקור את תהליך המיאלינציה במערכת העצבים ההיקפית, לחקור אינטראקציות בין תאי אקסון-שוואן ולהעריך את ההשפעות האפשריות של חומרים טיפוליים על כל סוג תא בנפרד. מבחינה מתודולוגית, גנגליונים של שורש גבי של חולדות עובריות (E13.5) נקטפו, נותקו מהרקמה הסובבת אותם, ותורבתו כצמחים שלמים במשך 3 ימים. תאי Schwann בודדו מחולדות בוגרות בנות 3 שבועות, ועצבים סיאטיים עוכלו אנזימטית. תאי Schwann שהתקבלו טוהרו על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית וגודלו בתרבית בתנאים מועשרים בנוירגולין ובפורסקולין. לאחר 3 ימים של תרבית גנגליון שורש גבי, נוספו 30,000 תאי Schwann לצמח גנגליון שורש גבי אחד בתווך המכיל חומצה אסקורבית. הסימנים הראשונים של מיאלינציה התגלו ביום ה-10 של התרבות המשותפת, באמצעות אותות מפוזרים לחלבון בסיסי של מיאלין בצביעה אימונוציטוכימית. מהיום ה-14 ואילך נוצרו נדני המיאלין והתפשטו לאורך האקסונים. ניתן לכמת את המיאלינציה על ידי צביעת חלבון בסיסי במיאלין כיחס בין אזור המיאלינציה לאזור האקסון, כדי להסביר את ההבדלים בצפיפות האקסונלית. מודל זה מספק הזדמנויות ניסיוניות לחקור היבטים שונים של מיאלינציה היקפית במבחנה, שהיא חיונית להבנת הפתולוגיה של והזדמנויות טיפול אפשריות לדמיאלינציה וניוון עצבי במחלות דלקתיות וניווניות של מערכת העצבים ההיקפית.

המיאלינציה בתרבות המשותפת הוערכה בימים 10, 12, 14, 16, 18 ו-20. צמחי DRG ותאי Schwann הוכתמו עבור MBP, βIII-tubulin ו- DAPI. הרשת האקסונלית בקוקולטורה הייתה צפופה ולא השתנתה באופן ניכר במהלך הזמן של התצפית. הסימנים הראשונים של מיאלין, בצורה של שברים קטנים, היו ניתנים לזיהוי ביום ה-10 והתגברו ביום ה-12 (איור 2). האזורים החיוביים ל-MBP גדלו עם הזמן עד היום ה-20 לתרבות. המיאלינציה כומתה כיחס בין האזורים החיוביים MBP ו-βIII-tubulin. המיאלינציה עלתה משמעותית בימים 18 ו-20 בהשוואה ליום 10 (<strong...

במערכת ההתרבות המשותפת של גרעיני השורש הגבי ותאי Schwann, ניתן ללמוד מיאלינציה של מערכת העצבים ההיקפית. מודל זה מספק הזדמנויות ניסיוניות לצפות ולכמת את המיאלינציה ההיקפית ולחקור את ההשפעות של תרכובות ריבית על מעטפת המיאלין.

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

מודל זה מספק הזדמנויות ניסיוניות ללמוד היבטים שונים של myelination של מערכת העצבים ההיקפית במבחנה. הוא מאפשר כימות מיאלין ובחינה של אינטראקציות תאי אקסון-שואן. התרבות המשותפת מפתחת מיאלינציה חזקה מהיום ה-14 ואילך.תרביות DRG explant מספקות את היתרון של ארכיטקטורה מבנית שלמה בהשוואה לתרבויות עצביות מנותקות. שיטה זו זמינה כדי לסנן תרכובות tropotic עבור מחלות דלקתיות נוירודגנרטיביות של מערכת העצבים ההיקפית. כדי להתחיל, לעקר את אזור העבודה בפלג הגוף העליון של החולדה המורדמת עם 70% אתנול.פתחו את הגפה השמאלית התחתונה הגבית של החולדה בעזרת מספריים, והסירו בזהירות את שריר הזרוע. שחררו את העצב הסיאטי על ידי הגבהה חלקה עם מלקחיים מעוקלים, והקפידו לא לחבול בעצב. בעזרת מלקחיים, מעבירים את העצבים החתוכים לצלחת תרבית רקמה עם מדיום L-15 קר כקרח של לייבוביץ' עם 50 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין.לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, הסר את השומן, השרירים וכלי הדם מהעצבים בעזרת שני זוגות מלקחיים עדינים. זהה את הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של העצב הסיאטי והסר את האפיניוריום עם זוג אחד של מלקחיים עדינים בכיוון פרוקסימלי עד דיסטלי תוך החזקת קצה העצב הפרוקסימלי עם הזוג השני של מלקחיים עדינים. לאחר העברת העצבים המטוהרים לצלחת תרבית רקמה אחרת עם מדיום L-15 קר כקרח של לייבוביץ' עם ג'נטמיצין, מקניטים את פשקווילי העצבים המבודדים כדי להפריד ולבודד סיבי עצב בודדים באמצעות שני זוגות מלקחיים עדינים.מעבירים את סיבי העצב לצינור 50 מיליליטר באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, ותופסים כמה שפחות מדיום. לאחר מכן להוסיף 50 מיליליטר של מדיום L 15 של לייבוביץ' עם גנטמיצין לסיבי העצב ב slew כמה פעמים. צנטריפוגה הצינור המכיל את סיבי העצב ב 188 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הסרת הסופרנטנט, מעבירים את הגלולה עם התווך L-15 של לייבוביץ' לצלחת תרבית רקמה של 60 מילימטר. שוטפים את צינור ה-50 מיליליטר ב-10 מיליליטר של תמיסת העיכול האנזימטית ומוסיפים אותו לצלחת סיבי העצב. מפיצים את סיבי העצבים בצלחת בזהירות עם קצה פיפטה.יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 18 שעות. ולעצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת 10 מיליליטר ב 40% FCS ב HBSS. מעבירים את העצבים המעוכלים לתוך צינור 50 מיליליטר לצנטריפוגה ב 188 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר השלכת supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 10 מיליליטר של DMEM המכיל 10% FCS ו 50 מיקרוגרם למיליליטר של gentamycin. לאחר מכן, סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים 100 מיקרומטר. לאחר צנטריפוגה ב 188 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשעות מחדש את הגלולה עם ארבעה מיליליטר של DMEM המכיל FCS ו gentamycin.הוסף שני מיליליטר של תרחיף התא לכל אחד משני כלי תרבית רקמה מצופים פוליליזין ולמינין 60 מילימטר. דוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, ומשאירים את הלוחות ללא מגע במשך יומיים באינקובטור. צנטריפוגו את תרחיף תאי Schwann ב 188 G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, והשהו מחדש את כדורית התא ב 90 מיקרוליטר של חיץ הפרדת תאים מגנטי לכל אחד כפול 10 לתא השביעי.לאחר מכן להוסיף 10 מיקרוליטר של ti1 מיקרו חרוזים לכל אחד כפול 10 לתאים השביעי. לדגור על התמיסה מחדש במשך 15 דקות בחושך בשמונה מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר במאגר הפרדת התאים המגנטי לתרחיף התא.לאחר צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשהות מחדש את הגלולה ב 500 מיקרוליטר של חיץ הפרדת תאים מגנטי. מקם את עמודת הפרדת התאים המגנטית במפריד התא, והרטיב את העמוד במיליליטר אחד של מאגר הפרדת התאים המגנטי. לאחר מכן להחיל את התאים על זה כדי לאסוף את הזרימה דרך צנטריפוגה.הוציאו בזהירות את הרחם מחולדה הרה שעברה המתת חסד והניחו אותו בצלחת תרבית רקמות 100 מילימטר עם HBSS קר כקרח. מחזיק את הרחם באמצעות מלקחיים מעוקלים, לפתוח את דופן הרחם עם מלקחיים עדינים. מוציאים שק מי שפיר אחד ופותחים אותו בזהירות על ידי צביטת חור במלקחיים עדינים.הוציאו במהירות את כל העוברים מהרחם והעבירו אותם לצלחת מלאה ב- HBSS. בעדינות, הכניסו את פלג הגוף העליון של העובר לתוך צלחת 35 מ"מ מלאה ב-HBSS. תחת מיקרוסקופ סטריאו, פתח את החלק הגבי של פלג הגוף העליון כדי לחלק את העובר לשני חצאים.סובבו חצי אחד הצידה וזהו את גדיל גרעיני השורש הגבי, או DRG, הממוקם בקו בחלק הגבי של העובר. גזרו את ה-DRG כגדיל שלם בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים זעירים. לאחר הנחת DRG בכלי טרי מלא שני מיליליטר של HBSS, יש להפריד DRG בודד מהרקמה הנותרת באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים זעירים.קחו צלחת 4 בארות המכילה 190 מיקרוליטר של מדיום גידול DRG בכל באר, והעבירו בזהירות DRG בודד למרכז כל באר באמצעות מלקחיים עדינים ומרית. לאחר מכן הניחו את תרביות הצמחים של DRG באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, הוסיפו בזהירות 50 מיקרוליטר של מצע הגידול DRG לכל באר וצפו בהיצמדות DRG וצמיחת אקסונים באמצעות מיקרוסקופ יומי.לגידול משותף ביום השלישי של תרבית הצמחים של DRG, החלף בזהירות את מדיום הגידול של DRG ב -250 מיקרוליטר של מדיום התרבית המשותפת המכיל 30, 000 תאי שוואן לכל באר. לביצוע צביעה אימונוציטוכימית, תקן את התאים על החלקות הכיסוי על ידי דגירה של התאים שנשטפו DPBS ב 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות. צלמו את הדגימות המוכתמות אימונוציטוכימית בשמונה אזורים מוגדרים המקיפים את צמח ה-DRG במרכז באמצעות מיקרוסקופ הפוך.המראה של תאי שוואן עם מורפולוגיה מוארכת ובצורת ציר ואקסוני DRG דקים בתרבית משותפת מתואר כאן. מיאלינציה בתרבית המשותפת הוערכה בימים שונים על ידי צביעת צמחי DRG ותאי Schwann עבור חלבון בסיסי של מיאלין או MBP, בטא שלוש טובולין ו- DAPI. הרשת האקסונלית בתרבות המשותפת הייתה צפופה, ולא השתנתה באופן ניכר במהלך הזמן של התצפית.סימנים ראשונים של מיאלינציה נראו בימים 10 ו -12 של תרבות משותפת. מהיום ה-14, אות ה-MVP היה בולט יותר, ואקסונים עטופים במיאלין זוהו. המיאלינציה גדלה עם זמן התרבות המשותפת עד היום ה-20.המיאלינציה כומתה כיחס בין MVP ובטא שלושה אזורים חיוביים לטובולין. עלייה משמעותית במיאלינציה נצפתה בימים 18 ו-20 בהשוואה ליום 10. תרביות צמחי DRG הן שבירות, ויש לטפל בהן בזהירות.לדוגמה, כאשר מוציאים אותם מהאינקובטור או במהלך שינוי וקיבוע בינוניים. ניתוח ביטוי גנים של דגימות תרבית משותפת יכול להיווצר כדי לחקור את המיאלין בפירוט רב יותר. כאן, זיהינו את סמני המיאלין PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 ביום ה-22.

in-vitro-myelination-peripheral-axons-coculture-rat-dorsal-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקולים עבור מערכת עובריים במוח חולדה המצרפי תרבות מתואר. אבות multipotent ב אגרגטים יכול לפתח להתמיין נוירונים, האסטרוציטים ו oligodendrocytes.

הכנת המוח עכברוש תרבויות מצטבר עבור Neuron ופיתוח מחקרים גליה

סרטון זה מדגים הליך לבידוד נוירונים של גנגליון שורש גבי (DRG) מעוברי חולדות וטיפוחם יחד עם מבשרי תאי Schwann ליצירת תאי Schwann בוגרים. ה-DRGs המבודדים מעובדים כדי לבודד תאי עצב ותאי גלייה. התאים המבודדים מתורבתים כדי לטהר את תאי העצב, אשר לאחר מכן מתורבתים יחד עם תאים דמויי תאי Schwann (SCLCs) במדיום של תרבית משותפת. אינטראקציה עם נוירוני DRG מובילה להבשלה של SCLCs לתוך תאי Schwann.

בידוד של נוירוני DRG והתרבות משותפת עם מבשרי תאי Schwann ליצירת תאי Schwann

הסרטון מדגים את ההתרבות המשותפת של נוירוני גנגליון שורש גבי (DRG) עם תאי Schwann. תאי עצב DRG גדלים תחילה על קרום מתוח מראש לצמיחה מיושרת של אקסונים. לאחר מכן מוצגים תאי Schwann, אשר נצמדים לאקסונים, מבודדים אותם ומקדמים הישרדות ותפקוד של תאי עצב.

תרבית משותפת של תאי Schwann עם נוירוני DRG על קרום מתוח מראש

סרטון זה מדגים את מודל ההתרבות של צמח גנגליון שורש גבי ותאי Schwann. בתנאי קוטורטור, חומצה אסקורבית מקדמת התמיינות של תאי Schwann לצורות myelinating. תאי Myelinating Schwann עוטפים את האקסונים מספר פעמים כדי ליצור מעטפת מיאלין, החיונית לתפקוד העצבים.

גידול משותף של צמח גנגליון שורש גבי עם תאי Schwann למיאלינציה של נוירונים

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי Schwann מסיבי עצב סיאטיים של עכבר.

הפרדה מגנטית של תאי Schwann מעצבים סיאטיים של עכבר

כאן אנו מציגים פרוטוקולים המציעים בסיס גמיש ואסטרטגי למניפולציה ויראלית של תאי מבשר אוליגודנדרוציטים כדי לבטא יתר על המידה חלבונים מעניינים על מנת לחקור באופן ספציפי את תפקידם באוליגודנדרוציטים באמצעות מודל מבחנה של מיאלינציה של מערכת העצבים המרכזית.

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל במבחנה מבחני myelination

גרעיני גב שורש (DRG) הם מבנים המכילים את תאי העצב התחושתיים של מערכת עצבים ההיקפית. כאשר ניתק, הם יכולים להיות שיתוף תרבותי עם תאים כמו SC-המופק שומן גזע (ASC), מתן מודל רב ערך כדי ללמוד במבחנה התחדשות עצב וmyelination, מחקה את סביבת in vivo באתר הפציעה.

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של נוירונים של גנגליון שורש הגב (DRG) שבודדו מחולדות ואת התרבית של נוירוני DRG על מערכת תרבית תאים סטטית מתוחה מראש כדי לשפר את יישור האקסונים, עם תרבית משותפת של תאי שוואן (SCs) כדי לקדם מיאלינציה.

גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

אנו מציגים מודל במבחנה כדי להעריך חוש הריח ensheathing גליה (OEG) יכולת נוירו-רגנרטיבית, לאחר פגיעה עצבית. הוא מבוסס על קוקולטורה של נוירונים גנגליון רשתית למבוגרים אקסוטומיים (RGN) על מונוליירים OEG ומחקר עוקב של התחדשות אקסון, על ידי ניתוח סמנים אקסונליים וסמטודנדריטיים RGN.

Coculture של נוירונים רשתית עכברוש אקסוטומי עם חוש הריח Ensheathing גליה, כמודל במבחנה של התחדשות אקסון למבוגרים

פרוטוקול זה מתאר שיטות להקמת תרביות שלמות ומנותקות של גרעיני שורש הגב של העכבר (DRG) והשימוש בהן להערכת אינטראקציות גידול-עצב.

הקמת מודלים במבחנה של תרבית גרעיני שורש גב: גישות משלימות לחקירת הצלבה בין סרטן לעצב

למד מיאלינציה של העצבים ההיקפיים בשיטת תרבית משותפת של שורשי חולדה ותאי שוואן. מודל זה מאפשר כימות מיאלין ומחקר אינטראקציות אקסון-שוואן לסינון תרופות במחלות נוירודגנרטיביות.

מיאלינציה חוץ גופית של אקסונים היקפיים בתרבות משותפת של שורשי חולדה, גנגליון גבי, צמחים ותאי שוואן

גלה סרטונים נוספים