Name: מודל אורגנואיד מוחי אנושי להשתלת תאים עצביים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: למדו פרוטוקול להשתלת תאים עצביים באורגנואידים מוחיים אנושיים. השיטה מאפשרת מעקב ארוך טווח באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ומספקת פלטפורמה גמישה להערכת טיפולים תרופתיים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המימון לעבודה זו ניתן באמצעות קרנות פילנתרופיות IRIC מקרן מרסל וז'אן קוטו ומקרן Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS #295647). ל- D.J.H.F.K. יש תמיכה בשכר מ- FRQS בצורה של מלגת Chercheurs-boursiers Junior 1 (#283502). M.I.I.R. נתמך על ידי פרס IRIC לדוקטורט מהמכון לחקר אימונולוגיה וסרטן, Bourse de passage accélère de la maitrise au doctorat מאוניברסיטת מונטריאול, ובורס דה Mérite aux cycles supérieurs.

<ol><li>Spurlock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+penetrating+ballistic-like+brain+injury+induced+cognitive+deficits+after+neuronal+differentiation+of+transplanted+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Amelioration of penetrating ballistic-like brain injury induced cognitive deficits after neuronal differentiation of transplanted human neural stem cells.</a> Journal of Neurotrauma. 34 (11), 1981(2017).</li>
<li>Zhou, Y., Shao, A., Xu, W., Wu, H., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advance+of+stem+cell+treatment+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Advance of stem cell treatment for traumatic brain injury.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 301(2019).</li>
<li>Hayashi, Y., Lin, H. -T., Lee, C. -C., Tsai, K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neural+stem+cell+transplantation+in+Alzheimer%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of neural stem cell transplantation in Alzheimer's disease models.</a> Journal of Biomedical Science. 27 (1), 29(2020).</li>
<li>Kefalopoulou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+clinical+outcome+of+fetal+cell+transplantation+for+Parkinson+disease%3A+Two+case+reports%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term clinical outcome of fetal cell transplantation for Parkinson disease: Two case reports.</a> JAMA Neurology. 71 (1), 83-87 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+graft-derived+dopaminergic+innervation+is+maintained+24+years+after+transplantation+in+the+degenerating+parkinsonian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensive graft-derived dopaminergic innervation is maintained 24 years after transplantation in the degenerating parkinsonian brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (23), 6544-6549 (2016).</li>
<li>Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+stem+cell+therapies+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The future of stem cell therapies for Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).</li>
<li>Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cell-based+therapy+for+Parkinson%27s+disease%3A+A+Kyoto+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">iPS cell-based therapy for Parkinson's disease: A Kyoto trial.</a> Regenerative Therapy. 13, 18-22 (2020).</li>
<li>Krause, M., Phan, T. G., Ma, H., Sobey, C. G., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapies+for+stroke%3A+Are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapies for stroke: Are we there yet.</a> Frontiers in Neurology. 10, 656(2019).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+Growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: Growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+neural+stem+cells+to+model+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Using human neural stem cells to model neurological disease.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Hodge, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+cell+types+with+divergent+features+in+human+versus+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex.</a> Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+divergence+of+vulnerability+and+responses+to+stressors+between+human+and+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Conservation and divergence of vulnerability and responses to stressors between human and mouse astrocytes.</a> Nature Communications. 12 (1), 3958(2021).</li>
<li>Morizane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+matching+improves+engraftment+of+iPSC-derived+neurons+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MHC matching improves engraftment of iPSC-derived neurons in non-human primates.</a> Nature Communications. 8 (1), 385(2017).</li>
<li>Khrameeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+transcriptome+map+of+human%2C+chimpanzee%2C+bonobo%2C+and+macaque+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution transcriptome map of human, chimpanzee, bonobo, and macaque brains.</a> Genome Research. 30 (5), 776-789 (2020).</li>
<li>Powell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+brains%3A+The+ethics+of+transplanting+human+neurons+into+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hybrid brains: The ethics of transplanting human neurons into animals.</a> Nature. 608 (7921), 22-25 (2022).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionally+integrated+human+forebrain+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids.</a> Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>García-Delgado, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids+to+evaluate+cellular+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Brain organoids to evaluate cellular therapies.</a> Animals. 12 (22), (2022).</li>
<li>Lin, J. -R., Fallahi-Sichani, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+imaging+of+single+cells+using+a+high-throughput+cyclic+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed imaging of single cells using a high-throughput cyclic immunofluorescence method.</a> Nature Communications. 6 (1), 8390(2015).</li>
<li>Knapp, D. J. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+identifies+a+CD33%2B+subset+of+human+cord+blood+cells+with+high+regenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis identifies a CD33+ subset of human cord blood cells with high regenerative potential.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 710-720 (2018).</li>
<li>Georgala, P. A., Carr, C. B., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax6+in+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of Pax6 in forebrain development.</a> Developmental Neurobiology. 71 (8), 690-709 (2011).</li>
<li>Britanova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+is+a+postmitotic+determinant+for+upper-layer+neuron+specification+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex.</a> Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+G2019S-LRRK2+sporadic+Parkinson%27s+disease+in+3D+midbrain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling G2019S-LRRK2 sporadic Parkinson's disease in 3D midbrain organoids.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 518-531 (2019).</li>
<li>Smits, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Parkinson%27s+disease+in+midbrain-like+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids.</a> NPJ Parkinson's Disease. 5, 5(2019).</li>
<li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-I-interferon+signaling+drives+microglial+dysfunction+and+senescence+in+human+iPSC+models+of+Down+syndrome+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Type-I-interferon signaling drives microglial dysfunction and senescence in human iPSC models of Down syndrome and Alzheimer's disease.</a> Cell Stem Cell. 29 (7), 1135.e8-1153.e8 (2022).</li>
<li>Sun, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> eLife. 11, e76707(2022).</li>
<li>Popova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microglia+states+are+conserved+across+experimental+models+and+regulate+neural+stem+cell+responses+in+chimeric+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human microglia states are conserved across experimental models and regulate neural stem cell responses in chimeric organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (12), 2153.e6-2166.e6 (2021).</li>
<li>Wang, S., Li, B., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+fluorophores+for+deep-tissue+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging.</a> ACS Central Science. 6 (8), 1302-1316 (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

לאור העניין המשמעותי בגישות טיפוליות תאיות לטיפול בפציעות CNS / הפרעות נוירודגנרטיביות 1,2,3,4,5,6,7,8, מודלים של תפקוד התא במסגרת השתלה צוברים חשיבות. מאמר זה מציג שיטה להשתלת NPCs אנושיים מתויגים באורגנואידים מוחיים אנושיים, יחד עם מעקב אחר תאים חיים והערכת נקודות קצה על ידי היסטולוגיה וצביעה אימונופלואורסצנטית. חשוב לציין, הראינו כי התאים המושתלים היו מסוגלים לנדוד, התמיינות והתמדה לטווח ארוך (4 חודשים) בסביבה אורגנואידית. התמדה ארוכת טווח כזו היא עלייה ניכרת לעומת יכולת התחזוקה של תרביות פרוסות מוח17. מערכת זו מתאימה, אם כן, לבחון רבות מההתנהגויות שיש להעריך במסגרת טיפולית פוטנציאלית, כגון הישרדות, ריבוי והבחנה. ואכן, מחקר אורתוגונלי הראה לאחרונה כי NPCs מושתלים התנהגו באופן דומה באורגנואידים מוחיים בהשוואה ל- NPCs שהושתלו במוחות עכבר NSG20, ובכך אישרו את התועלת של אורגנואידים כמושתלים. מכיוון שמדובר במערכת חוץ גופית, זה גם פשוט להוסיף ציטוקינים או תרופות מעניינות. זה יכול לשמש כדי להבין טוב יותר את ההשפעות של סביבות ספציפיות כגון דלקת ומדכאי חיסון על התאים המושתלים כדי לחקות עוד יותר את מה שהם עשויים להיתקל בסביבה טיפולית. פרוטוקול האימונופלואורסנציה המחזורית שהדגמנו (בהתבסס על מחקרקודם 21) מרחיב עוד יותר את כוחה של גישה זו, ומאפשר להעריך בו זמנית מגוון רחב של סמנים ספציפיים לשושלת ואולי גם למחלה במקטע אחד, ובכך מאפשר מעקב מדויק אחר התאים המושתלים והשפעתם על הרקמה. כמובן, ניתן להשתמש בשיטות אחרות להערכת נקודות קצה במקום זאת בהתאם למטרות הניתוח. לדוגמה, ניקוי רקמות עם שחזור תלת-ממדי יכול לשמש אם מורפולוגיה של התא היא עניין עיקרי, או דיסוציאציה ואחריה ציטומטריית זרימה יכול לשמש אם כימות של סוגי תאים ספציפיים הוא המטרה הסופית. אנו מצפים ששיטה זו תהיה ניתנת להרחבה בקלות לסוגי תאים אחרים כגון גידולים במערכת העצבים המרכזית, מה שעשוי לאפשר את המחקר שלהם בהקשר מיקרו-סביבתי רלוונטי. באופן דומה, ניתן להחליף את האורגנואידים המשמשים כמושתלים באורגנואידים מודל מחלה 25,26,27, מה שעשוי לאפשר מידול של גישות השתלה למצבים אלה.
כמו בכל הדגם, גם לזה המוצג כאן יש מגבלות משלו. ראשית, אורגנואידים שמקורם ב- iPSC אינם בשלים מבחינה התפתחותית19, ולכן יש להם הבדלים חשובים בהשוואה למוח המזדקן, שבו מחלות נוירודגנרטיביות רבות מתבטאות. אורגנואידים מוחיים גם אינם אחידים בהתפתחותם19, ובכך מונעים הזרקה עקבית לאותה נישה פיזיולוגית בדיוק. יתר על כן, בעוד שהם מכילים את סוגי התאים של אזורי המוח הרלוונטיים18,19, הם חסרים את רכיבי האנדותל, מיקרוגליאה ומערכת החיסון, שגם הם חשובים בסביבה in vivo 14. זה מגביל את המחקר של איך המארח יגיב להשתלת התא. טכניקות מגיעות כיום לאינטרנט כדי להוסיף תאי כלי דם28 ו microglial29, כמו גם כדי להגדיל את עקביות אורגנואיד אזוריזציה18, ובכך לשפר את כוח המידול של מערכת השתלת אורגנואידים. עם זאת, הם ידרשו בדיקות נוספות ואופטימיזציה מעבר למה שמוצג כאן. בעוד פרוטוקול זה אינו יקר ואינו דורש ציוד מיוחד, נותרו מספר שיקולים טכניים חשובים - עומק ההזרקה, למשל. זאת הן בשל העובדה שאורגנואידים אינם מחוררים, ולכן לעתים קרובות יש להם מרכז נמק אם הם גדלים יותר מדי19 ושאור אינו יכול לחדור דרך ליבת האורגנואיד לצורך מעקב אחר תאים חיים. לכן, התאים שהוזרקו עמוק מדי ומושבות שהיגרו פנימה עלולים להתפספס. בעוד שניתן לשפר זאת על ידי שימוש בפלואורופורים באורך גל ארוך יותר עם חדירה טובה יותר לרקמות30, בהתאם לגודל האורגנואיד ומנגנון האיתור, סביר להניח שזה יישאר שיקול. לבסוף, מכיוון שאורגנואידים במוח נמצאים במצב התפתחותי, תזמון ההשתלה הוא שיקול מרכזי נוסף, מכיוון שהסביבה צפויה להשתנות בהתאם לשלב ההתפתחותי של האורגנואיד שאליו הוא מוזרק. בעוד שניתן לשלוט בכך במידה מסוימת על ידי הבטחת גיל אורגנואיד עקבי בזמן ההזרקה, זהו, ללא ספק, גורם שיש לקחת בחשבון.
פרוטוקול זה זול, פשוט, נטול בעלי חיים ואינו דורש ציוד מיוחד, ובכך הופך את מידול ההשתלות לנגיש למגוון רחב יותר של מעבדות. עם קצב ההתקדמות המהיר הן בטיפול בתאים עצביים והן במערכות מודל אורגנואידים, אנו צופים כי פרוטוקול השתלת האורגנואידים המוצג כאן יהיה מודל שימושי למגוון מחלות וגישות טיפוליות.

המוח האנושי הוא איבר מורכב המורכב מסוגי תאים מרובים של השושלות העצביות והגלייה. יחד, אלה יוצרים רשת מתוחכמת המולידה קוגניציה. יש עניין משמעותי בהשתלת תאים במערכת זו כטיפול במגוון רחב של הפרעות נוירולוגיות, כולל פגיעה מוחית טראומטית (TBI)1,2, הפרעות נוירודגנרטיביות 3,4,5,6,7 ושבץ8. עם זאת, מגבלה מרכזית אחת בקידום אסטרטגיות כאלה היא המיעוט היחסי של מודלים פרה-קליניים זמינים לקביעת תוצאות ההשתלה הצפויות. המודלים הנפוצים ביותר כיום הם שיטות תרבית חוץ גופית כדי לקבוע פוטנציאל תאים והשתלת קסנו בעכברים. בעוד ששיטות תרבית תאים יכולות להעריך התמיינות ופוטנציאל התחדשות עצמית9, אלה מבוצעות בתנאי גידול אופטימליים שאינם מחקים את המיקרו-סביבה שהתאים היו פוגשים בהקשר של השתלה. יתר על כן, האופן שבו התאים גדלים יכול להשפיע על התנהגותם10.
מוחות עכברים מכילים את כל תאי המיקרו-סביבה ולכן הם מערכות מודל חזקות ביותר להשתלה11. עם זאת, ישנם הבדלים חשובים בין העכבר לקליפת המוח האנושית12,13, ולא כל גורמי הגדילה מגיבים בין המינים. מודלים של פרימטים הם חלופה קרובה יותר המחקה טוב יותר את המערכת האנושית וגם הניבו תוצאות פרה-קליניות חשובות14. עם זאת, אפילו קרובי משפחה קרובים יותר אלה שומרים על הבדלים חשובים בהרכב התאי שלהם15. בעוד ששתי מערכות מודל אלה מספקות תובנות חשובות על התנהגות התא במהלך ההשתלה ומשלבות את האלמנטים הכירורגיים של טיפול בסופו של דבר, הן נותרות לא מושלמות. הם גם יקרים ומאתגרים מבחינה טכנית (כלומר, יש לבצע ניתוחי מוח בבעלי החיים), ובכך מגבילים את התפוקה האפשרית. יתר על כן, יש שפע של סוגיות אתיות הקשורות להשתלת תאי מוח אנושיים בבעלי חיים16 . תרביות פרוסות מוח מאפשרות לחתוך מוח אחד ולהשתמש בו לטיפולים מרובים, ובכך להסיר חלק מהמגבלות של השתלות בעלי חיים; עם זאת, אלה יש תוחלת חיים מוגבלת (שבועות), הם עדיין נגזר מן החי, (להיות פרוסה דקה) אין מספיק נפח / שלמות פני השטח כדי לחקות את הזרקת תאים17. לפיכך, נותר פער חשוב בין תרביות תאים בלבד / מודלים פוטנציאליים לבין השתלת in vivo.
אורגנואידים מוחיים הם מודל במבחנה המכיל את סוגי התאים העצביים העיקריים הקיימים במוח וניתן לייצר אותם במספרים גבוהים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs)18,19. אורגנואידים כאלה מספקים אפוא הקשר תאי, שיכול לאפשר להעריך את היכולת התפקודית של תא בדיקה בעל עניין בסביבת ההשתלה. ואכן, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי תאי אב עצביים (NPCs) המושתלים באורגנואידים מוחיים אנושיים שורדים, מתרבים ומתמיינים באופן דומה ל- NPCs המושתלים במוחו של עכבר n סוכרתי על מנתיתר המשולב gamma (NSG)20. אורגנואידים מוחיים מייצגים אפוא מערכת נטולת אכזריות, מאריכת חיים (>6 חודשים), חסכונית הלוכדת את סוגי התאים במוח האנושי. ככאלה, הם יכולים לייצג מושתל אידיאלי לבדיקה בשלב מוקדם של יכולת ההתחדשות של תאים עצביים.
מאמר זה מציג פרוטוקול להשתלה ולמעקב אחר NPCs אנושיים מתויגים באורגנואידים מוחיים אנושיים (איור 1). זה מתחיל עם הזרקת NPCs המסומנים GFP לתוך אורגנואידים מוחיים בוגרים (2-4 חודשים)18. התאים המושתלים מלווים במיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים חיים במשך תקופה של 4 חודשים. במהלך הזמן הזה, אנו מראים גם את ההתמדה של תאים באתר ההזרקה, אבל גם הגירה לאזורים דיסטליים של האורגנואיד. בנקודת הקצה, אנו מדגימים את השליפה, הצביעה וההדמיה של מקטעים היסטולוגיים הנגזרים מאורגנואידים אלה, כולל פרוטוקול למרווה של צבעים קיימים מבוססי AlexaFluor כדי לאפשר סבבי צביעה והדמיה נוספים, בהתבסס על עבודה קודמת21. פרוטוקול זה יכול, אם כן, להיות שימושי במדידת יכולת ההתמיינות של תאים בסביבת השתלה, עמידות השתל, הרחבת תאים באתרם ונדידת תאים מאתר ההשתלה. אנו צופים כי זה יהיה שימושי הן עבור רפואה רגנרטיבית / יישומי תרפיה תאית, כמו גם מודלים הגידול על ידי השתלת תאים סרטניים לתוך אורגנואידים ספציפיים לאזור הרלוונטי.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td>תערובת אנזימים פרוטאוליטיים-קולגנוליטיים</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 נוגדן נגד GFP BioLegend</td><td></td><td>338008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (שיבוט SMI 52)</td> <td>BioLegend</td><td>801804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 נוגדן נגד GFAP (שיבוט SMI 25)</td> <td>BioLegend</td><td>837510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-Nestin (שיבוט 10C2)</td> <td>BioLegend</td><td>656804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 אנטי טובולין ובטא; 3 (TUBB3) (שיבוט TUJ1)</td> <td>BioLegend</td><td>801209</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון מונוהידראט</td><td>פישר כימי</td><td>A104-500</td><td></td></tr><tr><td>ציטציה 5 תאים הדמיית קורא מולטימוד</td><td>אלכוהול</td><td></td> אתילי נטול נטול ביוטק <td></td></tr><tr><td>(נטול מים)</td> <td>ChapTec-DMEM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F12/ Glutamax</td><td>Thermo</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO),</td><td>סטרילי BioShop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 1.53c</td><td>-</td><td>-תמיסת</td><td></td></tr> <tr><td>פורמלין, חוצץ ניטרלי, 10%</td> <td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Gen5&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia H</td><td>Leica Biosystems-גורם</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>גדילה מופחת (GFR)</td><td>קורנינג</td><td>356231</td><td>פנול נטול אדום,</td></tr><tr><td>להב מיקרוטום MX35 נטול LDEV&nbsp;</td><td>אפרדיה&nbsp;</td><td></td><td></td>3053835</tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-Ca -Mg)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>Thermo</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>מעכב ROCK Y-27632</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; תבניות בסיס נירוסטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-038-209</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; UNISETTE ביופסיה עיבוד/הטמעה קלטת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>36-101-9255</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff ערכת התמיינות נוירונים במוח הקדמי</td><td>StemCell Technologies</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff אב עצבי</td><td>בינוני StemCell Technologies</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff SMADi ערכת אינדוקציה עצבית</td><td>StemCell Technologies</td><td>8581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtome</td><td>Thermo Scientificific-Tissue</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Prep</td><td>Fisher Scientific</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6&nbsp; מעבד רקמות AI</td><td>Sakura</td> <td>Finetek-Toluene</td><td></td></tr> <tr><td>(היסטולוגי)</td> <td>ChapTec-Trypan</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>כחול; 0.4% (משקל/נפח)</td><td>Thermo</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510.100</td><td></td></tr></tbody></table>

מודל אורגנואיד מוחי אנושי להשתלת תאים עצביים

A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation

התקדמות גישות השתלת תאים דורשת מערכות מודל המאפשרות הערכה מדויקת של העוצמה התפקודית של התאים המושתלים. עבור מערכת העצבים המרכזית, למרות שהשתלת קסנו נותרה חדישה, מודלים כאלה הם מאתגרים מבחינה טכנית, מוגבלים בתפוקה ויקרים. יתר על כן, האותות הסביבתיים הנוכחיים אינם מגיבים באופן מושלם עם תאים אנושיים. מאמר זה מציג מודל זול, נגיש ותואם תפוקה גבוהה להשתלה ומעקב אחר תאים עצביים אנושיים באורגנואידים מוחיים אנושיים. אורגנואידים אלה יכולים להיווצר בקלות מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם באמצעות ערכות מסחריות ומכילים את סוגי תאי המפתח של המוח. 
אנו מדגימים לראשונה את פרוטוקול ההשתלה הזה עם הזרקת תאי אב עצביים אנושיים שמקורם ב-EGFP (NPCs) לתוך אורגנואידים אלה. לאחר מכן נדון בשיקולים למעקב אחר גדילתם של תאים אלה באורגנואיד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים חיים, ונדגים את המעקב אחר NPCs מושתלים המסומנים ב-EGFP באורגנואיד במשך תקופה של 4 חודשים. לבסוף, אנו מציגים פרוטוקול לחתך, צביעה אימונופלואורסצנטית מחזורית והדמיה של התאים המושתלים בהקשר המקומי שלהם. מודל השתלת האורגנואידים המוצג כאן מאפשר מעקב ארוך טווח (לפחות 4 חודשים) אחר תאים אנושיים מושתלים ישירות במיקרו-סביבה אנושית עם פרוטוקול זול ופשוט לביצוע. זה, אם כן, מייצג מודל שימושי הן עבור טיפולים בתאים עצביים (השתלות) וככל הנראה, עבור מודלים של גידולים במערכת העצבים המרכזית (CNS) באופן מדויק יותר מבחינה מיקרו-סביבתית.

כאימות לזהות האורגנואיד המוחי, חלקים היסטולוגיים של אורגנואיד מוחי בוגר (בן חודשיים) הוכתמו עבור PAX6 (סמן של NPCs23 גבי) ו-SATB2 (סמן של נוירונים בוגרים, פוסט-מיטוטיים, בשכבה העליונה24). כצפוי, תאי PAX6+ היו נוכחים בחלק הפנימי של האורגנואיד, ותאי SATB2+ היו נוכחים בשכבות העליונות (איור 2). תוצאות אלה תומכות בכך שהאורגנואידים המוחיים בהם נעשה שימוש היו אכן המוח הקדמי הגבי כמפורט בערכת ההתמיינות. כדי לבסס את התלות במינון של מערכת השתלת אורגנואידים מוחיים, אורגנואידים מוחיים בני חודשיים הוזרקו עם מספר גדל והולך של NPCs שמקורם ב- EGFP+ iPSC. נמצאה תלות ברורה במינון של פלואורסצנטיות GFP במספר תאי הקלט, עם זיהוי עקבי של טלאי תא EGFP+ ב-10,000 תאים ומעלה (איור 3). ההתמדה והנדידה של NPCs המושתלים הוערכו לאחר מכן על ידי מעקב אחר האורגנואידים המושתלים לאורך זמן. לשם כך, 50,000 NPCs שמקורם ב-iPSC הושתלו באורגנואידים מוחיים בני 2-3 חודשים שנוצרו מאותו קו iPSC. האורגנואידים והבקרות שהוזרקו צולמו עבור EGFP חיובי בנקודות הזמן שצוינו במהלך 3-4 החודשים הבאים. בסדרת ההשתלות הזו ראינו התמדה של האתר המוזרק לאורך 4 חודשי המעקב (איור 4A). מדבקות תאי EGFP+ נוספות הופיעו 9 ימים לאחר ההשתלה ונמשכו עד לנקודת הסיום של המחקר (3-4 חודשים, תלוי באורגנואיד), מה שמצביע על נדידת התאים והשתלבותם באתרים החדשים שלהם (איור 4A). בהגדלה גבוהה יותר, ניתן היה להבחין במורפולוגיה עצבית ברורה עם הקרנות ארוכות לתוך האורגנואיד (איור 4B), המאשרות את האינטגרציה של התאים שהוזרקו.
כדי לקבוע את מצב ההתמיינות של התאים המוזרקים באיחור לאחר ההזרקה, אורגנואיד המעקב בן 4 החודשים והשליטה בו תוקנו, הוטמעו בפרפין, נחתכו לפרוסות בעובי 15 מיקרומטר והורכבו על שקופיות זכוכית. לאחר מכן עובדו הפרוסות ונצבעו בסבב אחד של צביעה פלואורסצנטית (EGFP, TUJ1, NESTIN) או במשך שני מחזורי צביעה רצופים כדי להוסיף סמנים נוספים (MAP2, GFAP). הצביעה הראשונית בסיבוב אחד אישרה את נוכחותם של תאי EGFP+ באתר ההזרקה, כולל תערובת של תאים ששמרו על מצב NPC (NESTIN+TUJ1−) ואלה שהתמיינו לקראת גורל עצבי (NESTIN−TUJ1+) (איור 5). הן עבור אורגנואידי הבקרה והן עבור אורגנואידים שהוזרקו, נצפו מעט מאוד NPCs מסוג NESTIN+ (רובם, אם כי לא כולם, היו NPCs מושתלים של EGFP+ במקום ההזרקה), כאשר רוב תאי העצב TUJ1+ לא בשלים (איור 5). הצביעה הדו-סיבובית נתנה פירוט רב יותר, וחשפה תאי עצב בוגרים (NESTIN−TUJ1+MAP2+GFAP−) סביב רוב האזור החיצוני של האורגנואיד, עם אזורים של תאי עצב לא בוגרים (NESTIN−TUJ1+MAP2−GFAP−) לכיוון האמצע (איור 6A,B). אסטרוציטים (NESTIN−TUJ1−MAP2−GFAP+) היו נוכחים הן באורגנואידים המוזרקים והן באורגנואיד הבקרה, והיו מפוזרים סביב הקצוות החיצוניים (איור 6A,B). הפרוסה שעבורה בוצעה הצביעה הדו-עגולה באורגנואיד המוזרק הראתה מושבת לוויין קטנה של תאי EGFP+ הרחק מאתר ההזרקה שאימץ את הפנוטיפ של תאי עצב בוגרים (איור 6B,C). חלקם נראו קרובים לאסטרוציטים; אולם לא היו תאי EGFP+ עם חפיפה מלאה לצביעת GFAP, מה שמרמז על כך שהם היו סמוכים ולא יצרו את האסטרוציטים עצמם (איור 6B,C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig01.jpg"> איור 1: מודל השתלה של תאים מסומנים באורגנואידים מוחיים. סקירה סכמטית של יצירת תאים מסומנים על ידי התמרה לנטיוויראלית, השתלתם באורגנואידים מוחיים, ומעקב על ידי הדמיה של תאים חיים ואימונופלואורסנציה. קיצור: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig02.jpg"> איור 2: אימונופלואורסנציה של חתכים היסטולוגיים שמראים ארכיטקטורה של אורגנואידים מוקדמים ומאוחרים. אורגנואיד מוחי בן חודשיים תוקן, הוטמע בפרפין, נחתך ומוכתם ב-PAX6, SATB2 ו-DAPI. קטע לא מוכתם שימש להגדרת זמן החשיפה והאינטגרציה כדי למנוע אות חיובי כוזב מאוטופלואורסצנטיות. תאי PAX6+ היו נוכחים בחלק הפנימי של האורגנואיד, בעוד שתאי SATB2+ היו נוכחים בשכבות העליונות. תמונות Z-stack צולמו כל 4.2 מיקרומטר דרך כל קטע הרקמה של 15 מיקרומטר. מקטעים אופטיים שולבו באמצעות אפשרות ערימת הפוקוס בתוכנת Gen5 עם אפשרויות ברירת מחדל. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: PAX6 = חלבון קופסה 6 מזווג; SATB2 = חלבון קושר רצף עשיר AT-עשיר מיוחד 2; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2.jpg"> איור 3: השתלה תלוית מינון של NPCs באורגנואידים מוחיים. האורגנואידים הושתלו עם 0 (בקרה שלילית), 1,000, 5,000, 10,000 או 50,000 NPCs שמקורם ב-GFP+ iPSC. שבוע לאחר ההשתלה, האורגנואידים צולמו על ציטיישן 5 עם קוביית מסנן GFP. הבקרה השלילית שימשה להגדרת זמן החשיפה והאינטגרציה כדי למזער את הפלואורסצנטיות העצמית. צבעים כהים יותר מצביעים על פלואורסצנטיות רבה יותר של EGFP ביחס לבקרה השלילית. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. אלה הן תמונות 4x של אורגנואידים שלמים. לאחר ההדמיה, בוצע חיסור רקע כדור מתגלגל ברדיוס פיקסל של 50 לפני התצוגה כדי לתקן את עוצמת הרקע המשתנה על פני האורגנואידים. אתרי הזרקה המזוהים כאזורי ההזרקה הגבוהים ביותר מסומנים בחץ אדום היכן שהייתה קליטה. קיצורים: NPCs = תאי אב עצביים; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; EGFP = GFP משופר; iPSC = תא גזע פלוריפוטנטי מושרה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2.jpg"> איור 4: מעקב אחר גדילת תאים מושתלים, נדידה והתמדה באמצעות דימות תאים חיים פלואורסצנטיים. (A) אורגנואידים שעברו בקרה והשתלה (50,000 GFP+ iPSC שמקורם ב-iPSC) לוו בהדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים במשך 2-4 חודשים משתי קבוצות השתלות עצמאיות. אורגנואידי בקרה שליליים שימשו להגדרת זמן החשיפה והאינטגרציה כדי למזער את האוטופלואורסצנטיות בכל נקודת זמן. תמונות EGFP צולמו באמצעות קוביית מסנן GFP על Cytation 5 בזמנים שצוינו לאחר ההשתלה. צבעים כהים יותר מצביעים על פלואורסצנטיות רבה יותר של EGFP ביחס לבקרה השלילית באותה נקודת זמן. חיסור רקע כדור מתגלגל ברדיוס פיקסל של 50 בוצע לפני התצוגה כדי לתקן את עוצמת הרקע המשתנה על פני האורגנואידים. האורגנואידים מוקמו בערך באותו כיוון בכל נקודת זמן, והתמונות סובבו כדי לשמור על עקביות התצוגה ולהראות בבירור את צמיחת התאים המושתלים. אתרי ההזרקה המזוהים כאזורי הקליטה הגבוהה ביותר בנקודת הזמן המוקדמת ביותר מסומנים בחץ אדום. אורגנואיד בקרה שלילי לדוגמה מוצג בתחתית האיור. (B) דוגמה 20x תמונות מוצגות מאורגנואידים מושתלים בשבוע 1 ובשבוע 15 לאחר ההשתלה. הניגודיות המקומית שופרה לפני התצוגה באמצעות FIJI כדי להבטיח ראות עצבית. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: NPCs = תאי אב עצביים; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; EGFP = GFP משופר; iPSC = תא גזע פלוריפוטנטי מושרה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig05.jpg"> איור 5: אימונופלואורסנציה של החתכים ההיסטולוגיים החושפת את ההתמדה של NPCs המושתלים באתר ההזרקה יחד עם נדידה והתמיינות עצבית. תמונות פלואורסצנטיות חד-ערוציות מ-(A) אורגנואידים שלא הוזרקו ו-(B) אורגנואידים מושתלים. תמונת השכבת-על מימין מציגה את שלושת ערוצי העניין (NESTIN, TUJ1 ו-EGFP), אך אינה כוללת את DAPI. מינימום התצוגה הוגדר כך שלא יכלול את האות מהתאים השליליים (נקבע עבור EGFP מהבקרה שלא הוזרק ועבור ערוצים אחרים בהתבסס על שילובי סמנים ידועים). מקסימום התצוגה התבסס על האות הגבוה ביותר שנצפה עבור נוגדן זה בכל תא. טווחי התצוגה נשמרו קבועים בין האורגנואידים שלא הוזרקו והמושתלים כדי לאפשר השוואה ישירה. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: NPCs = תאי אב עצביים; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; TUJ1 = בטא-III טובולין; EGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2.jpg"> איור 6: הערכת מצב התמיינות תאים מושתלים ולוקליזציה באמצעות אימונופלואורסנציה מחזורית של החתכים ההיסטולוגיים. תמונות פלואורסצנטיות חד-ערוציות מהאורגנואידים הלא מוזרקים, (A) תואמי גיל ו-(B) מושתלים מוצגות בסבב הראשון והשני של הצביעה כפי שצוין. מינימום התצוגה הוגדר כך שלא יכלול את האות מהתאים השליליים (נקבע עבור EGFP מהבקרה שלא הוזרק ועבור ערוצים אחרים בהתבסס על שילובי סמנים ידועים). מקסימום התצוגה התבסס על האות הגבוה ביותר שנצפה עבור נוגדן זה בכל תא. טווחי התצוגה (וכמובן, פרמטרי ההדמיה) נשמרו קבועים בין הבקרה לבין אורגנואידים מוזרקים כדי לאפשר השוואה ישירה. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. תמונה עם שכבת-על (למעט DAPI) מוצגת עבור כל סיבוב צביעה עבור כל אורגנואיד מימין. (B) עבור האורגנואיד המוזרק שבו בוצע רישום תמונה, כל התמונות נחתכות לאזור שנצפה בשני סבבי הצביעה. (ב,ג) עבור האורגנואיד המוזרק, אזורי תאי EGFP+ מסומנים בכחול. דיאגרמה של אופן השימוש ב- DAPI כדי להתאים לתכונות במהלך רישום תמונה מוצגת ב- (C), ואחריה מיזוג כולל של התמונה הרשומה. קיצורים: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; TUJ1 = בטא-III טובולין; EGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר; MAP2 = חלבון הקשור למיקרוטובול 2; GFAP = חלבון גליה פיברילרי חומצי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>שיבוט</td>
			<td>פלואורופור</td>
			<td>ריכוז</td>
		</tr><tr><td>אנטי-נסטין</td>
			<td>10ג2</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 ל-2,000</td>
		</tr><tr><td>אנטי-TUBB3</td>
			<td>TUJ1</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1 ל-2,000</td>
		</tr><tr><td>אנטי-GFP</td>
			<td>FM264G</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1 ל-200</td>
		</tr><tr><td>אנטי-GFAP</td>
			<td>SMI 25</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 מתוך 500</td>
		</tr><tr><td>אנטי-MAP2</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1 ל-1,000</td>
		</tr><tr><td>אנטי-PAX6</td>
			<td>O18-1330</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1 מתוך 100</td>
		</tr><tr><td>אנטי-SATB2</td>
			<td>EPNCIR130A</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 מתוך 500</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: ריכוזי נוגדנים להכתמה. קיצורים: TUBB3 = בטא-טובולין III; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; GFAP = חלבון גליה פיברילרי חומצי; MAP2 = חלבון הקשור למיקרוטובול 2; PAX6 = קופסה 6 חלבון; SATB2 = חלבון קושר רצף מיוחד עשיר ב-AT, 2.

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להשתלה ולמעקב אחר תאים עצביים מסומנים באורגנואידים מוחיים אנושיים.

The advancement of cell transplantation approaches requires model systems that allow an accurate assessment of transplanted cell functional potency. For ...

עם העניין הגובר בטיפולים תאיים, יש צורך בשיטות חדשות להערכת הפונקציונליות של תאים אלה. פרוטוקול זה מאפשר הערכה חוץ גופית ארוכת טווח של קליטת תאים אלה בהקשר עצבי. היתרונות העיקריים של טכניקה זו היא כי כל המרכיבים באים ממוצא אנושי.כמו כן, ניתן לעקוב בקלות אחר ההשתלה, וניתן לשנות בקלות את הסביבה מהאורגנואידים, מה שמאפשר בדיקת תרופות שונות או סוגים שונים של טיפולים. מי שתדגים את הטכניקה הזו תהיה איליאנה איבנז, דוקטורנטית מוכשרת במעבדה שלי. התחל על ידי הסרת התרחיף התא היחיד של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים או תאי אב עצביים שמקורם ב- iPSC, או NPCs, מהקרח וצנטריפוגה אותם ב -300 גרם למשך חמש דקות ב -4 מעלות צלזיוס.הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 3 מיליגרם לכל מיליליטר של מטריצת קרום מרתף מסיס כדי לקבל נפח סופי של שני מיקרוליטר לכל הזרקה. מיד להחזיר את המתלה על הקרח עד לשימוש. מעבירים את המזרק המצונן מראש מהמקפיא של 20 מעלות צלזיוס לדלי קרח לשימוש נוסף.לאחר מכן, הסר את צלחת אורגנואיד המוח מן האינקובטור ולהעביר את האורגנואיד לתוך צלחת 35 מ"מ באמצעות קצה רחב משעמם. כדי לייצב את האורגנואידים ולהקל על ההזרקה, הסר את המדיום ככל האפשר מבלי לפגוע באורגנואיד. הניחו את צלחת ה-35 מ"מ המכילה את האורגנואיד תחת מיקרוסקופ מנתח כדי להקל על ההזרקה.ברגע שהאורגנואידים מוכנים להזרקה, השהו מחדש בעדינות את תאי ה-NPC המסומנים ב-EGFP באמצעות קצה פיפטה P20 מקורר, והעבירו שני מיקרוליטרים של תאים אלה למגלשת זכוכית סטרילית מצוננת מראש. קח מזרק אינסולין מלא מראש מן הקרח לצייר לאט את 2 מיקרוליטר של תרחיף התא עם שיפוע של המחט פונה כלפי מטה. פתח את מכסה הצלחת המכילה את האורגנואיד לפני מיקוד המיקרוסקופ עליו.החזיקו את הצלחת ביד אחת, הניחו את שיפוע המחט למעלה. ועם היד השנייה, להזריק את התא לאט לתוך משטח אורגנואידים. לאחר הזרקת התאים, מחזירים את המכסה לצלחת ודגרים על האורגנואיד המוזרק למשך דקה עד שתיים.לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 500 מיקרוליטר של מדיום האורגנואיד לצלחת לפני העברת האורגנואיד לצלחת של 24 בארות עם קצה בור רחב. לדגור על האורגנואיד ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עם שינוי בינוני מלא כל יום שני. טען אורגנואיד בקרה שאינו מוזרק או שלילי במיקרוסקופ פלואורסצנטי.והגדירו את עוצמת ההארה בין 1 ל-2 ואת זמן החשיפה בין 80 ל-100 אלפיות השנייה למינימום אוטופלואורסצנטיות. לאחר מכן, טען את אורגנואיד הבקרה החיובי והעלה את זמן החשיפה כדי להבטיח שהתאים המסומנים גלויים. מקם מחדש את האורגנואיד עם קצה פיפטה רחב כדי למצוא את החלבון הפלואורסצנטי הירוק המשופר או אזור EGFP פלוס להזרקה.הסר את המדיום לחלוטין מהאורגנואיד לפני טעינת האורגנואיד. ולדמיין אותו עם ההגדרות שנבחרו. לאחר השלמת ההדמיה, הוסף מיד מדיום חדש כדי למנוע מהאורגנואיד להתייבש.לאחר חזרה על הסרת המדיום וההדמיה של כל האורגנואידים, מחזירים את האורגנואידים לדגירת תקינה ולשינויים בינוניים. חזור על ההדמיה במרווחי הזמן הרצויים. הניחו את המגלשה בצנצנת מכתימה של קופלין מלאה בטולואן למשך שתי דקות, וחזרו על שלב זה.לאחר מכן, העבירו את מגלשת הזכוכית לצנצנת זכוכית עם מגלשת קופלין מלאה ב-100% אלכוהול אתילי למשך שתי דקות. וחזור על שלב זה לפני העברת המגלשה לצנצנת קופלין מלאה במים למשך שתי דקות. חזור על הכביסה במים.לאחר מכן, הניחו מיכל פלסטיק באמבט המים, וודאו שהפלסטיק אינו נוגע בתחתית האמבטיה. יוצקים את חיץ הציטראט לתוך מיכל הפלסטיק ונותנים לו להגיע 95 עד 100 מעלות צלזיוס. ברגע שהמאגר מגיע לטמפרטורה הרצויה, מקם את המגלשות בתוך החיץ, וכסה באופן רופף את המיכל במכסה, תוך השארת המגלשות בתוך אמבט המים למשך 30 עד 40 דקות.לאחר הדגירה, להסיר את מיכל פלסטיק מן אמבט המים ולתת לו להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. שטפו את המגלשות שלוש פעמים במשך שתי דקות כל אחת עם PBS. הסר את PBS עם רקמת נייר מבלי לגעת בדגימה.הכינו את חיץ החדירה ומלאו איתו צנצנת זכוכית מכתימה מגלשה. לטבול את השקופיות במאגר החדירה ולדגור במשך 10 דקות. חזור על שלוש שטיפות של PBS במשך שתי דקות כל אחת.לאחר מכן, הכינו תערובת צביעה שתכסה כל דגימה והוסיפו 25 מיקרוליטר למגלשת האורגנואיד לפני הדגירה על המגלשה בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר הדגירה, חזרו על שלוש שטיפות של PBS במשך שתי דקות כל אחת, והסירו את המלחים על ידי שטיפת המגלשה במים מזוקקים בתוך צנצנת מכתימה מזכוכית. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של תושבות נוזל ו- DAPI לכל דגימה לפני הדמיה של השקופית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.לצנצנת הזכוכית קופלין המלאה באמצע הדרך בחיץ מרווה פי 2, מוסיפים 45 מיליליטר PBS, ומניחים את המגלשות בתוך צנצנת זו. דוגרים על הצנצנת למשך הלילה בחום של 4 מעלות. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק אם הפלואורופורים היו מרווים ביעילות לפני חזרה על הצביעה וההדמיה.תלות ברורה במינון של פלואורסצנטיות GFP הייתה קיימת במספר תאי הקלט, עם EGFP עקבי בתוספת זיהוי טלאי תאים ב -10, 000 תאים ומעלה. האורגנואידים המוזרקים והבקרות שצולמו עבור EGFP חיובי הראו את ההתמדה של האתר המוזרק לאורך ארבעת חודשי המעקב. מדבקות תאים חיוביות נוספות של EGFP הופיעו תשעה ימים לאחר ההשתלה ונמשכו עד לנקודת הסיום של המחקר, מה שמצביע על נדידת התאים והשתלבותם באתרים החדשים שלהם.בהגדלה גבוהה יותר, ניתן היה להבחין במורפולוגיה עצבית ברורה עם הקרנות ארוכות לתוך האורגנואיד, המאשרות את האינטגרציה של התאים המוזרקים. הצביעה הראשונית של סיבוב בודד אישרה את נוכחותם של תאי EGFP פלוס באתר ההזרקה, כולל תערובת של תאים ששמרו על מצב NPC, ואלה שהתמיינו לקראת גורל עצבי. עבור אורגנואידי הבקרה וההזרקה, נצפו מעט מאוד נסטין פלוס NPCs, עם רוב TUJ1 בתוספת נוירונים בוגרים לא בוגרים.שני הכתמים העגולים נתנו פירוט רב יותר, וחשפו נוירונים בוגרים סביב רוב האזור החיצוני של האורגנואיד, עם אזורים של נוירונים לא בוגרים לכיוון האמצע. אסטרוציטים היו נוכחים באורגנואידים שהוזרקו ובקרה, והיו מפוזרים סביב הקצוות החיצוניים. הפרוסה שעבורה בוצעה הצביעה העגולה באורגנואיד המוזרק הראתה מושבת לוויין קטנה של EGFP בתוספת תאים מרוחקים מאתר ההזרקה שאימצו את הפנוטיפ של נוירונים בוגרים.נראה כי חלק מהמושבות הללו נמצאות בקרבת אסטרוציטים. עם זאת, אף תא EGFP פלוס עם חפיפה מלאה לצביעת GFP לא הציע שהם היו סמוכים ולא יצרו את האסטרוציטים עצמם. כאשר אתה מזריק את האורגנואיד הוא שאתה צריך להימנע מהפעלת כוח רב מדי או לעשות את זה מהר מדי, כפי שאתה יכול להרוס את האורגנואיד לחלוטין.לכן, לאחר מעקב אחר החיים, ניתן לשייך את האורגנואידים ולהשתמש בהם לניתוח ציטומטריית זרימה, או גישות ריצוף תא בודד. זה יאפשר לנו לדעת את המצב המולקולרי של התאים. טכניקה זו יכולה להיות שימושית ביותר לקידום הטיפול התאי למחלות נוירודגנרטיביות, גם למידול גידולי מוח או גרורות.

a-human-cerebral-organoid-model-of-neural-cell-transplantation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Palma-Tortosa, S., et.al. תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח האנושית הבוגרת כמודל ex vivo להשתלה ואימות של תאי גזע אנושיים. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים השתלה של תאי אב עצביים שמקורם בתאי גזע לפרוסות רקמת קליפת המוח האנושית. ההליך כולל בידוד והשעיה מחדש של תאי אב במטריצת קרום מרתף, ולאחר מכן הזרקתם לפרוסה קליפת המוח המונחת על מכלול טרנסוול. לאחר הדגירה כדי לאפשר התמצקות מטריצה והתמיינות עצבית, הרקמה המושתלת מוכנה לניתוח נוסף.

השתלת אבות עצביים שמקורם בתאי גזע לפרוסות קליפת המוח האנושיות

מקור: Ibanez-Rios, M.I., et al., מודל אורגנואיד מוחי אנושי של השתלת תאים עצביים. J. Vis. Exp. (2023)סרטון זה מדגים את ההזרקה של תאי אב עצביים (NPCs) המסומנים פלואורסצנטית לאורגנואידים מוחיים אנושיים באמצעות תערובת מטריצת תאים. השיטה ניתנת לשחזור וללא בעלי חיים, ומאפשרת השתלה עם הפרעה אורגנואידית מינימלית. הוא מציע פלטפורמה רבת ערך למידול השתלות עצביות ומחלות מערכת העצבים המרכזית (CNS).

הזרקת תאי אב עצביים פלואורסצנטיים לאורגנואידים מוחיים אנושיים לצורך מידול השתלה

Organoids מוחי לייצג מערכת מודל חדש לחקור מוקדם המוח האנושי לפיתוח במבחנה. מאמר זה מספק את המתודולוגיה מפורט לייצר ביעילות organoids הומוגנית מסוג הקדמי הגבי מתאי גזע pluripotent המושרה האנושי כולל שלבים קריטיים איפיון ואימות.

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

מחקר זה מציג ומתאר פרוטוקולים לגזור שני מסוימים נוירונואידים אנושיים האדם כמודל רלוונטי ומדויק עבור לימוד 1) התפתחות האדם הגלינובלסטומה בתוך אורגנואידים האדם באופן בלעדי בבני אדם ו 2) תא העצב הדואמיאנרגיות בידול היוצר אורגאיד תלת מימדי.

ארגונית עצבית אנושית לחקר סרטן המוח ומחלות ניווניות

כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנוידים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (IPSCs). כדי להשיג אורגנוידים במוח בכמויות גדולות ובאיכות גבוהה, אנו משתמשים ביו-רה-קטרים מיני תוצרת בית.

דור אורגנויד במוח מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים במיני ביו-רהקטורים תוצרת בית

במחקר זה, אנו מספקים טכניקה מפורטת למערכת תרבית אורגנואידים פשוטה אך חזקה בקליפת המוח באמצעות תרביות hPSC סטנדרטיות ללא הזנה. זהו פרוטוקול מהיר, יעיל וניתן לשחזור ליצירת אורגנואידים המדגימים היבטים של סנסנציית המוח במבחנה.

דור חזק וניתן לשחזור של אורגנואידים במוח קליפת המוח למידול סנסנציה עצבית במוח במבחנה

פרוטוקול זה מתאר תרביות אורגנוטיפיות ארוכות טווח של קליפת המוח האנושית הבוגרת בשילוב עם השתלה תוך-קורטיקלית ex vivo של אבות קורטיקליים פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזע, אשר מציגים מתודולוגיה חדשנית לבדיקה נוספת של טיפולים מבוססי תאי גזע להפרעות נוירודגנרטיביות אנושיות.

תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח האנושית הבוגרת כמודל Ex vivo להשתלה ואימות של תאי גזע אנושיים

אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים של פרימטים מספקת גישה מדויקת ויעילה להחדרת שינויים גנטיים חולפים לסוגי אבות ונוירונים שונים במערכת מודל הקרובה להתפתחות ניאו-קורטקס פיזיולוגי של פרימטים (פתו). זה מאפשר את המחקר של תהליכים נוירו-התפתחותיים ואבולוציוניים והוא יכול להיות מיושם גם עבור מודלים המחלה.

מיקרו-הזרקה ממוקדת ואלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים פרימטים לשינוי גנטי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת אורגנואידים במוח האנושי בשלבי הבשלה מרובים לתוך קרום כוריואלנטואי אפרוח (CAM). אורגנואידים במוח גודלו בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים לא מונחים.

אורגנואיד מוח אנושי מוקדם לא מונחה מידול נישה נוירו-וסקולרית לתוך קרום עובר אפרוח מתירני Chorioallantoic

כאן, אנו מציגים את המניפולציה הגנטית החריפה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים חתוכים על ידי אלקטרופורציה. מודלים אלה של אורגנואידים בקליפת המוח נוחים במיוחד להזרקה מכיוון שניתן לזהות בקלות מבנים דמויי חדרים לאחר החיתוך, מה שמאפשר חקירה תפקודית של התפתחות קליפת המוח האנושית, הפרעות נוירו-התפתחותיות ואבולוציה קליפת המוח.

אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים

למדו פרוטוקול להשתלת תאים עצביים באורגנואידים מוחיים אנושיים. השיטה מאפשרת מעקב ארוך טווח באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ומספקת פלטפורמה גמישה להערכת טיפולים תרופתיים שונים.

מודל אורגנואיד מוחי אנושי להשתלת תאים עצביים

גלה סרטונים נוספים