Name: הדמיה של אתרי זיהום מוקדמים של מחלת פיצוץ האורז (Magnaporthe oryzae) על שעורה (Hordeum vulgare) באמצעות מיקרוסקופ בסיסי וטלפון חכם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: למד הדמיה של אתרי זיהום מוקדמים של מחלת פיצוץ האורז בזמן אמת על שעורה באמצעות מיקרוסקופ בסיסי וטלפון חכם. שיטה זו מאפשרת סינון מהיר של מוטנטים פטרייתיים ללא ציוד יקר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים על מימון מפרס USDA-NIFA 2016-67013-24816.

1. הכנת חומרים ניסיוניים
<ol><li>הכינו אגר שיבולת שועל (OMA) על ידי ערבוב שיבולת שועל עד לקבלת אבקה דקה. מוסיפים 25 גרם אבקת שיבולת שועל ו-15 גרם אגר ל-500 מ"ל של ddH2O, ואוטוקלב במחזור המדיה (לחילופין מביאים לרתיחה למשך 20 דקות). יוצקים את המדיה לצלחות פטרי סטריליות בקוטר 60 מ"מ. הערה: סוגי מדיה אחרים הגורמים לנבגים, כגון אגר V8, מקובלים עבור פרוטוקול זה.</li>
	<li>פילטר Plate M. oryzae נצמד ישירות ללוחות OMA באמצעות מלקחיים סטריליים, ומאפשר להם לכסות את הצלחת כולה (9-12 ימים). הניחו את הצלחות באינקובטור צמיחה ב 25 °C עם מחזורי יום:לילה 12:12 שעות כדי לעזור לגרום לנבגים. הערה: חלק מהמוטנטים גדלים לאט יותר ודורשים טיפול נוסף (למשל, מדיה מלאה תחילה, ואז העברה ל- OMA), ויכול לקחת שבוע נוסף כדי לייצר מספיק קונידיה.</li>
	<li>שתול ישירות זרעי שעורה (Hordeum vulgare Lacey) במצע גידול לח (למשל, מצע שתילה ללא אדמה) עם 10-15 זרעים לעציץ בגודל 6 אינץ'. מניחים את הסירים במגשים עם 1-2 אינץ' מים.</li>
	<li>הגדר את תנאי תא גידול השעורה כ- 22 ° C למשך 12 שעות (אור יום) ו- 19 ° C למשך 12 שעות (כהה) בלחות יחסית של 60%. ממשיכים להשקות מלמטה כדי לא להפריע לזרעים.</li>
	<li>מגדלים את השעורה עד לשלב העלה השני, בערך במשך 14 יום. בעזרת מספריים סטריליים, חותכים את צמח השעורה ממש מעל קו הקרקע. בעזרת מלקחיים ותער/אזמל חותכים בזהירות את מעטפת העלה הראשון הפתוח לאורך, ובעזרת המלקחיים מסירים אותו מבסיס העלה השני. הערה: יש לנקות את הכלים (מלקחיים, אזמל וכו') לפני השימוש עם אתנול 75%-80%. הנדן הוא שכבת האפידרמיס הדקה שמספקת את החיבור מהעלה הראשון לשני (עלה שני לשלישי וכו'; ראו איור 1).</li>
	<li>מניחים את העלה הראשון שטוח בכלי פטרי סטרילי בקוטר 60 מ"מ, המכיל מגבת נייר רטובה כדי לשמור על לחות בתוך הצלחת. בעזרת האזמל, חותכים את רוב העלה הראשון הרחק מהנדן, ומשאירים רק 0.5 אינץ' מרקמת העלה להרכבה.</li>
	<li>הדביקו את רקמת העלה לתחתית צלחת הפטרי. הערה: הנדן מתעקל, אך זה מקובל מכיוון שנדן מסולסל מחזיק את הטיפה הקונידיאלית ביתר קלות.</li>
	<li>אספו צלחות M. oryzae בנות 9-12 יום, והוסיפו 0.5-2 מ"ל מים סטריליים לצלחות. בעזרת לולאת חיסון סטרילית, מגרדים בעדינות את התפטיר כדי לשחרר את הקונידיה. בזהירות פיפטה את התרחיף conidial לתוך צינור microcentrifuge המכיל חתיכה קטנה של בד גבינה כדי לסנן כל חתיכות גדולות של תפטיר מן המתלה conidial. הערה: ניתן לאסוף נבגים כבר 7 ימים, אם הצמיחה והנבגים מספיקים כדי להגיע לריכוז הנבגים הרצוי. האיסוף יכול להתעכב לא יותר מ -14 יום אם עובדים עם מוטציה גנטית הגדלה לאט</li>
	<li>ריכוז הנבגים הרצוי הוא 5 x 10 4 נבגים למ"ל, אך טווח (1 x 10 4-1 x 10 5) מקובל. ריכוז גבוה מדי הופך את הדמיה של אתרי זיהום בודדים למאתגרת; מדללים את ריכוז הנבגים במים סטריליים במידת הצורך.</li>
	<li>בזהירות פיפטה את המתלה הקונידיאלי בתוך נדן העלה המגולגל. התחל עם 25 μL (ניתן להגדיל את גודל הטיפה בהתאם לגודל הנדן, עד 50 μL). הערה: מומלץ לבצע שלושה עד חמישה שכפולים של כל זן מוטנטי או קו שעורה. זה נפוץ עבור נזק להתרחש במהלך תהליך הצביעה, ולכן מומלץ שכפול נדן נוסף.</li>
	<li>ממלאים ארבע או חמש כוסות של 500 מ"ל ב-ddH2O, ומחממים עד לאידוי (באמצעות מיקרוגל או פלטה חשמלית). יש לנקוט משנה זהירות בעת הזזת כוסות המים החמים. החזיקו את מכסה צלחת הפטרי מעל אחת הכוסות המהבילות כדי ללכוד לחות בתוך הצלחת.</li>
	<li>ערמו את צלחות נדן העלים הנגועות והקיפו אותן בכוסות החמות שנותרו. זה יוצר סביבה לחה ולחה, הנדרשת לנבגים לנבוט. הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת אידוי העפעפיים כדי להבטיח שלא ייגעו מים חמים או אדים בנדן.</li>
	<li>הגנו על נדן העלה מפני אור, כסו בקופסת גומי או פלסטיק בצבע אחיד (שחור מועדף), והשאירו למשך 48 שעות או נקודת הזמן הרצויה להדמיה. הערה: קופסת קרטון אינה מתאימה מכיוון שהיא אינה נועלת את הלחות/לחות וסופגת את האדים מכוסות המים החמים. גיגית פלסטיק ננעלת פועלת היטב להכלת הלחות, וניתן לכסות אותה בבד שחור או במיכל כהה גדול יותר כדי לחסום את האור.</li>
</ol>2. תהליך צביעה
<ol><li>הכינו את הכתם באופן הבא: הכינו דילול טרי של 45% חומצה אצטית והוסיפו 0.1% v/v טריפאן כחול. Aliquot 1 מ"ל של תמיסת הצבע לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה. הגדר בלוק חום או אמבט מים ל 40 ° C.</li>
	<li>בזהירות, באמצעות סכין גילוח או אזמל, לחתוך את נדן העלה מן הקלטת. בעזרת מלקחיים, הניחו את הנדן לתוך צינור המיקרוצנטריפוגה וודאו שהוא שקוע לחלוטין בתמיסת הצבע. המתינו שעתיים עד שהצבע יחדור לעלה. חממו את הדגימות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס בזמן תהליך הצביעה בבלוק חום או באמבט מים כדי להגביר את חדירת הצבע. הערה: הנדן מנסה לצוף בצינור המיקרו-צנטריפוגה; כדי למנוע כיסים לא מוכתמים של רקמת עלה, מלא את הצינורות, שקע את הנדן וסגור את הצינור. אין לשים נדנים מרובים באותו צינור מיקרו-צנטריפוגה.</li>
	<li>שטפו בזהירות את נדן העלים ב-60% גליצרול כדי להסיר את הצבע העודף. שלוש שטיפות (כל אחת בגליצרול טרי) מספיקות בדרך כלל. יש לשמור את הנדן בגליצרול עד שיהיה מוכן להרכבה על מגלשות.</li>
</ol>3. תהליך הרכבה והדמיה
<ol><li>הניחו את הנדן על מגלשת זכוכית נקייה והוסיפו כמה טיפות של 60% גליצרול. בעזרת מיקרוסקופ מנתח ושני זוגות מלקחיים, פותחים בזהירות את הנדן ומשאירים את המרכז המחוסן פונה כלפי מעלה. החזיקו את הנדן פתוח עם המלקחיים, והניחו את הכיסוי מעליו כדי למנוע מהנדן להסתלסל ולחסום את אתר הזיהום. הערה: נדן העלה שביר מאוד, וצעדים אלה צריכים להיעשות בזהירות כדי למנוע נזק לנדן.</li>
	<li>אטמו את הכיסוי באמצעות לק לאחסון לטווח ארוך, או סרט דבק לאחסון לטווח קצר. צפו בשקופיות תחת מיקרוסקופ אור מורכב.</li>
	<li>צלם תמונות בסיסיות באמצעות מיקרוסקופ וטלפון סלולרי. כאן, התמונות צולמו עם תושבת מתאם טלפון סלולרי וטלפון חכם. עבור מכשירי Android, התאם את יישום המצלמה להגדרות הבאות: מבזק כבוי, השבת את Top Shot, השבת התאמה אוטומטית של בהירות וצללים והגדר את רזולוציית התמונה למלאה. הערה: השימוש ביישום המצלמה בטלפון מקצר את חיי הסוללה מהר מהרגיל, ולכן מומלץ להשתמש במתח חיצוני.</li>
	<li>לאחר הרכבת הטלפון הסלולרי על המיקרוסקופ, צלם תמונה של מיקרומטר בקנה מידה במטרה שתשמש להשגת הנתונים. הנתונים במחקר זה נרכשו ביעד אוויר של 40x 0.65 NA, ומתאם הטלפון הותקן על עיני 10x. כוונן את גודל הטלפון ל- 2.5x ושמור על עקביות כדי לשמור על גודל פיקסלים קבוע.</li>
	<li>במרכז הנדן נמצא הריכוז הגדול ביותר של נבגים ומדביקים; לכן, יש לשאוף ל-9-12 תמונות של כל נדן כדי לקבל מספרים משמעותיים לניתוח סטטיסטי. מספר הנבגים והאפרסוריה משתנה בהתאם לריכוז הנבגים המופעלים.</li>
</ol>4. הערכה וספירה של תמונות באמצעות ImageJ (FIJI)
<ol><li>העבר את התמונות למחשב שבו פועל ImageJ (FIJI). כדי לפתוח את התמונות, גרור ושחרר את הקבצים בסרגל ImageJ.</li>
	<li>הגדר את קנה המידה של התמונות על-ידי טעינת תמונת המיקרומטר של הבמה וציור קו ישר בין שני סימונים עבור קנה המידה. פתח את 'קבע קנה מידה', הקלד את 'מרחק ידוע' עבור הקו שנמדד והקלד ביחידה של קנה המידה. במיקרומטר, בדוגמה זו, הקו הקטן ביותר היה 10 מיקרומטר. סמן את הגדר גלובל תיבה ולחץ על אישור. כל התמונות הבאות שנטענו יהיו באותו קנה מידה.</li>
	<li>לספירת דפרסים, נבגים או עצמים אחרים, בחרו בכלי נקודה . לאחר מכן, פתח את מנהל החזר ההשקעה. לחץ על מקש T בלוח המקשים כדי להוסיף נקודות לרשימה. ניתן לשמור אזורי עניין אלה במידת הצורך ולטעון אותם מחדש על אותה תמונה.</li>
	<li>בהתאם למטרות הניסוי, בצע מדידות נוספות, כגון אורך נבג, גודל אפרסוריה ואורך צינור נבט.</li>
</ol>

<ol><li>Roy, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+barley+blast+caused+by+Magnaporthe+oryzae+pathotype+Triticum+%28MoT%29+in+Bangladesh%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh.</a> Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).</li>
<li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li>
<li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li>
<li>Wilson, R. A., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Under+pressure%3A+investigating+the+biology+of+plant+infection+by+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).</li>
<li>Giraldo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+secretion+systems+facilitate+tissue+invasion+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Nature Communications. 4, 1996(2013).</li>
<li>Islam, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+wheat+blast+in+Bangladesh+was+caused+by+a+SouthAmerican+lineage+of+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae.</a> BMC Biology. 14 (1), 84(2016).</li>
<li>Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLangridge%2C+P+%22The+Barley+Genome.+Compendium+of+Plant+Genomes%22">The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes</a>. , Springer. Cham. 1-10 (2018).</li>
<li>Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+two+strains+of+Magnaporthe+grisea+with+rice%2C+goosegrass%2C+and+weeping+lovegrass%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass.</a> Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).</li>
<li>Gowda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+analysis+of+rice-blast+fungus+Magnaporthe+oryzae+field+isolates+from+southern+India%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Data%22%5BJournal%5D)">Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India.</a> Genomics Data. 5, 284-291 (2015).</li>
<li>Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+reporters+for+functional+analysis+in+rice+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Direct%22%5BJournal%5D)">Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves.</a> Plant Direct. 4 (2), 00188(2020).</li>
<li>Fernandez, J., Wilson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+no+feeding+frenzy%3F+Mechanisms+of+nutrient+acquisition+and+utilization+during+infection+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).</li>
<li>Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Delaware%22">University of Delaware</a>. , Doctoral dissertation (2022).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((al.The+plant+infection+test%3A+Spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675(2018).</li>
<li>Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inoculation+method+of+Magnaporthe+grisea+for+cytological+observation+of+the+infection+process+using+intact+leaf+sheaths+of+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).</li>
<li>Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+surface+attachment+in+spores+of+a+plant+pathogenic+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus.</a> Science. 239 (4837), 288-290 (1988).</li>
<li>Khang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+of+Magnaporthe+oryzae+effectors+into+rice+cells+and+their+subsequent+cell-to-cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement.</a> The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ישנן בדיקות נפוצות רבות הזמינות לבדיקת זני M. oryzae המספקות ראייה ברמה מקרוסקופית של תגובת זיהום תואמת או לא תואמת, כגון חיסוני תרסיס או טיפות, ושימוש במערכות דירוג לכימות גדלים13,14. בדיקה נפוצה נוספת עבור M. oryzae היא לבדוק את יכולתו של הפתוגן ליצור את מבנה החדירה המיוחד שלו, apppressorium15. מתוארת כאן שיטה קלה לצפייה בשינויים בתהליכי הדבקה מוקדמים במהירות וביעילות ברמה התאית, בצמח השעורה הקלוש יותר. שיטה זו ייחודית,...

Magnaporthe oryzae, פטריית פיצוץ האורז, מדביקה מגוון גידולי דגנים, כולל שעורה, חיטה ואורז1. פתוגן זה גורם למחלות הרסניות ומהווה איום עולמי על גידולים יקרי ערך אלה, וגורם לאובדן יבול מוחלט אם אינו מבוקר. מעבדות רבות ברחבי העולם מתמקדות במחלת פיצוץ האורז בגלל האיום הגלובלי שלה ותכונותיה כמודל מצוין לאינטראקציות צמחיות-פטרייתיות2. הוא רוצף במלואו, והגנטיקה של מחזור ההדבקה שלו, במיוחד האירועים המוקדמים, נקבעה 3,4. מחזור החיים מתחיל בנבג הנובט על פני העלה, ויוצר את מבנה החדירה המיוחד הנקרא אפפרסוריום. האפרסוריום חודר לרקמת העלה, והזיהום ממשיך עם התפתחות נגעים המתחילים בתהליך של נבג ומפיצים מחלה4. מניעת כל אחד מהאירועים המוקדמים הללו תעכב באופן דרסטי את המחלה ההרסנית הזו. כתוצאה מכך, רוב המחקר הנוכחי על מחלת הפיצוץ התמקד בשלבי ההדבקה המוקדמים, החל מהקונידיה הנבטה היוצרת אפפרסויום ועד להתפתחות הקורים הפולשניים והקומפלקס הביוטרופי הבין-פנים (BIC)5.
המחקר הנרחב על מחלת הפיצוץ נערך באורז, למרות ש-M. oryzae הוא פתוגן משמעותי למגוון גידולים, וזנים חדשים שהתפתחו מתגלים כאיום עולמי על חיטה6. בעוד שאורז הוא אחד משלושת הגידולים העיקריים המשמשים להאכלת האוכלוסייה, יחד עם חיטה ותירס, שעורה היא דגן הדגנים הרביעי במונחים של מזון לבעלי חיים וייצור בירה7. ככל שתעשיית בירות הקראפט גדלה, כך גדל הערך הכלכלי של שעורה. ישנם יתרונות ברורים של שימוש ב - M. oryzae ושעורה כמערכת פתו-סיסטם לחקר מחלת הפיצוץ. ראשית, ישנם זנים של M. oryzae שמדביקים רק שעורה, כמו גם זנים שיכולים להדביק מיני דשא מרובים. לדוגמה, 4091-5-8 מדביק בעיקר שעורה, בעוד Guy11 ו 70-15 יכול להדביק גם שעורה ואורז8. זנים אלה דומים גנטית, ותהליך ההדבקהדומה 9. שנית, בתנאי מעבדה וחממה סטנדרטיים, קל יותר לגדל שעורה, מכיוון שאין לה את הדרישות המסובכות של אורז (בקרת טמפרטורה תמציתית, לחות גבוהה, ספקטרום אור ספציפי). ישנם גם אתגרי הדמיה עם אורז בשל הידרופוביות של פני העלה, אשר שעורה אינה מציגה10.
פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה לבידוד וניצול יעיל של נדן עלי שעורה לניתוח מיקרוסקופי של שלבי הדבקה מרובים, תוך שימוש בציוד מעבדה משותף ובסמארטפון לאיסוף נתונים. שיטה זו לבדיקת נדן עלי שעורה ניתנת להתאמה למעבדות ברחבי העולם מכיוון שהיא דורשת אספקה מינימלית, ועם זאת מספקת תמונה ברורה של האינטראקציה המיקרוסקופית בין הפתוגן לבין התאים הראשונים שהוא מדביק. בעוד שמבחני פתוגניות, כגון תרסיס או חיסון טיפתי, יכולים לספק מבט מאקרו על יכולתו של הפתוגן ליצור נגעים, בדיקה זו מאפשרת לחוקר לדמיין שלבים ספציפיים של זיהום מוקדם, החל מאירועים טרום חדירה ועד קולוניזציה של תאי אפידרמיס. יתר על כן, חוקרים יכולים בקלות להשוות זיהום עם פטרייה מסוג בר זיהום עם מוטציה מופחתת באלימות.

<table><tbody><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>טלפון סלולרי&nbsp;</td><td>גוגל&nbsp;</td><td>פיקסל 4A</td><td>כל סמארטפון עם מצלמה אחורית הניתנת להרכבה במחזיק A יספיק.</td></tr><tr><td>מתאם מיקרוסקופ לטלפון סלולרי</td><td>Vankey</td><td>B01788LT3S</td><td>https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix = vankey + %2Caps% 2C63 & sr=8-2 -spons& psc=1& spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>AmScope</td><td>FM690TC</td><td>40x&ndash; מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי זקוף 2500x</td></tr><tr><td>שיבולת שועל שיבולת שועל מגולגלת מיושנת</td><td>Quaker N</td><td>/ A</td><td>https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 & hvadid=312253390021& hvpos= & hvnetw=g& hvrand=98212627704 6839544& hvpone=& hvptwo=& hvq mt=& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint =& hvlocphy=9007494& hvtargid = PLA-568492637928& psc=1</td></tr><tr><td>ProMix BX</td><td>ProMix</td><td>1038500RG</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית מלבנית</td><td>שקופיות CLS2975245</td><td></td><td></td>קורנינג</tr>, <tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומטר במה&nbsp;</td><td>OMAX</td><td>A36CALM7</td><td>שקופית כיול מיקרוסקופ 0.1 מ"מ ו-0.01 מ"מ</td></tr><tr><td>טריפאן כחול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה של אתרי זיהום מוקדמים של מחלת פיצוץ האורז (magnaporthe oryzae) על שעורה (hordeum vulgare) באמצעות מיקרוסקופ בסיסי וטלפון חכם

Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease (Magnaporthe oryzae) on Barley (Hordeum vulgare) Using a Basic Microscope and a Smartphone

הבנת האופן שבו צמחים ופתוגנים מתקשרים, והאם אינטראקציה זו מגיעה לשיאה בהגנה או במחלה, נדרשת כדי לפתח אסטרטגיות חזקות ובנות קיימא יותר לבריאות הצמח. ההתקדמות בשיטות המדמה בצורה יעילה יותר דגימות פתוגן צמחי במהלך זיהום וקולוניזציה הניבה כלים כגון בדיקת נדן עלי האורז, אשר היה שימושי בניטור זיהומים ואירועי התיישבות מוקדמת בין האורז לבין הפתוגן הפטרייתי, Magnaporthe oryzae. פתוגן המי-ביוטרופי זה גורם לאובדן מחלות חמורות באורז ובמונוקוטים הקשורים אליו, כולל דוחן, שיפון, שעורה ולאחרונה גם חיטה. בדיקת נדן העלים, כאשר היא מבוצעת כראוי, מניבה חתך צמח שקוף אופטית, בעובי מספר שכבות, המאפשר לחוקרים לבצע הדמיה של תאים חיים במהלך מתקפת פתוגן או לייצר דגימות קבועות מוכתמות עבור תכונות ספציפיות. חקירות תאיות מפורטות של האינטראקציה בין שעורה ל-M. אוריזה פיגרו אחרי אלה של פונדקאי האורז, למרות חשיבותו הגוברת של דגן זה כמקור מזון לבעלי חיים ולבני אדם וכמשקאות מותססים. כאן דווח על פיתוח של בדיקת נדן עלי שעורה למחקרים מורכבים של אינטראקציות M. oryzae במהלך 48 השעות הראשונות לאחר החיסון. בדיקת נדן העלים, ללא קשר למין הנחקר, היא עדינה; מסופק פרוטוקול המכסה הכל, החל מתנאי גידול שעורה וקבלת נדן עלה, ועד חיסון, דגירה והדמיה של הפתוגן על עלי הצמח. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לסינון בתפוקה גבוהה באמצעות משהו פשוט כמו טלפון חכם למטרות הדמיה.

תיאור של זרימת העבודה הראשונית עבור טכניקה זו מוצג באיור 1. הנדן נקטף מצמחי שעורה רגישים "לייסי" בני 14 יום (H. vulgare). הקונידיה נקטפה מצלחות M. oryzae OMA בנות 10 ימים, עם תרחיף קונידיאלי שהוכן באמצעות ddH2O סטרילי לריכוז סופי של 5 x 104 נבגים למ"ל. תרחיף החיסון הוחל ישירות על נדן העלים, שהיו מאובטחים ללוחות פטרי סטריליים. הצלחות נשמרו בתא חם ולח במשך 48 שעות ללא אור. לאחר תקופת הדגירה נצבעו נדן העלים בכחול טריפאן והוכן להדמיה.
<p class="jove_co...

זהו פרוטוקול פשוט של בדיקת נדן עלי שעורה באמצעות ריאגנטים מינימליים וציוד מעבדה נפוץ (כולל טלפון חכם בסיסי). המטרה היא לדמיין את תהליך ההדבקה המוקדם של מחלת הפיצוץ במעבדות ללא גישה לציוד מיקרוסקופיה מתקדם.

הדמיה של אתרי זיהום מוקדמים של מחלת פיצוץ האורז (Magnaporthe oryzae) על שעורה (Hordeum vulgare) באמצעות מיקרוסקופ בסיסי וטלפון חכם

Understanding how plants and pathogens interact, and whether that interaction culminates in defense or disease, is required to develop stronger and more ...

הפרוטוקול שלנו הוא שיטה פשוטה המאפשרת לחוקרים לדמיין שלבי הדבקה מוקדמים של מוטנטים פטרייתיים מסוג בר וגנטי ללא שימוש בציוד יקר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש בציוד מעבדה בסיסי כדי לענות על שאלות ביולוגיות מורכבות ולסינון מהיר של מוטנטים פטרייתיים לניתוח נוסף. חלק קשה של טכניקה זו היא הטיפול של הנדן.הנדן הוא שכבה דקה של תאים שיכולים להינזק בקלות, ולכן טיפול זהיר חיוני לניסוי מוצלח. כדי להתחיל, לבחור את השעורה גדל עד שלב העלה השני. ובאמצעות מספריים סטריליים, חותכים את צמח השעורה ממש מעל קו הקרקע.בעזרת מלקחיים ואזמל, חותכים בזהירות את נדן העלה הראשון הפתוח לאורך. ובאמצעות המלקחיים, להסיר אותו מבסיס העלה השני. בעזרת אזמל, חותכים את רוב העלה הראשון הרחק מהנדן, ומשאירים רק 0.5 אינץ' מרקמת העלה להרכבה.הניחו את העלה הראשון שטוח בכלי פטרי סטרילי בקוטר 60 מ"מ המכיל מגבת נייר רטובה כדי לשמור על לחות בתוך הצלחת. הדביקו את רקמת העלה לתחתית צלחת הפטרי. בחרו צלחת תרבית Magnaporthe oryzae בת תשעה עד 12 ימים והוסיפו לה 0.5 עד שני מיליליטר מים סטריליים.בעזרת לולאת חיסון סטרילית, מגרדים בעדינות את התפטיר כדי לשחרר את הקונידיה. בזהירות פיפטה את התרחיף conidial לתוך צינור microcentrifuge המכיל חתיכת קטנה של בד גבינה כדי לסנן כל חתיכות גדולות של תפטיר מן התרחיף conidial. במידת הצורך, דללו את ריכוז הנבגים במים סטריליים לחמש פעמים 10 עד לנבג הרביעי למיליליטר, מכיוון שריכוז גבוה מדי הופך את הדמיה של אתרי זיהום בודדים למאתגרת.בהתאם לגודל הנדן, בזהירות פיפטה 25 עד 50 מיקרוליטר של ההשעיה conidial בתוך נדן עלה מגולגל. לאחר מכן, ממלאים ארבע או חמש כוסות 500 מיליליטר במים מזוקקים כפול ומחממים עד לאידוי. החזיקו את מכסה צלחת הפטרי מעל אחת הכוסות המהבילות כדי ללכוד לחות בתוך הצלחת.ערמו את צלחות נדן העלים הנגועות והקיפו אותן בכוסות החמות שנותרו, מכיוון שזה יוצר סביבה לחה ולחה לנבגים לנבוט. הגן על מערך זה מפני אור על ידי כיסויו בקופסת גומי או פלסטיק בצבע אחיד והשארתו ללא הפרעה למשך 48 שעות או נקודת הזמן הרצויה להדמיה. הכינו את הכתם על ידי ערבוב 45% חומצה אצטית מדוללת טרייה ו-0.1% טריפאן כחול.Aliquot מיליליטר אחד של תמיסת הצבע לתוך צינורות microcentrifuge. בעזרת אזמל, חותכים בזהירות את נדן העלה מהקלטת. בעזרת מלקחיים, הכניסו את הנדן לצינור המיקרוצנטריפוגה וודאו שהוא שקוע לחלוטין בתמיסת הצבע.הניחו לצינורות לעמוד במשך שעתיים בבלוק חום של 40 מעלות צלזיוס או באמבט מים כדי שהצבע יחדור לעלה. לאחר מכן, שטפו בזהירות את נדן העלה שלוש פעמים בגליצרול טרי 60% כדי להסיר את הצבע העודף. יש לשמור את הנדן בגליצרול עד שיהיה מוכן להרכבה על מגלשות.הניחו את הנדן על מגלשת זכוכית נקייה והוסיפו כמה טיפות של 60% גליצרול. בעזרת מיקרוסקופ מנתח ושני זוגות מלקחיים, פותחים בזהירות את הנדן ומשאירים את המרכז המחוסן פונה כלפי מעלה. מחזיקים את הנדן פתוח עם המלקחיים, מניחים את החלקת הכיסוי למעלה כדי למנוע מהנדן להסתלסל ולחסום את אתר הזיהום.אטמו את חלקת הכיסוי באמצעות לק לאחסון לטווח ארוך או סרט אחסון לטווח קצר. צפו בשקופיות תחת מיקרוסקופ אור מורכב. צלם תמונות בסיסיות באמצעות טלפון חכם על-ידי הרכבת מתאם טלפון סלולרי למיקרוסקופ.עבור מכשירי Android, התאם את הגדרות יישום המצלמה כדי להבהב, השבת את התמונה העליונה, השבת את הכוונון האוטומטי של בהירות וצללים והגדר את רזולוציית התמונה למלאה. לאחר הרכבת הטלפון הסלולרי, צלם תמונה של מיקרומטר בקנה מידה עם מטרה רצויה לרכישת הנתונים. כוונן את זום הטלפון ל- 2.5x ושמור על עקביות כדי לשמור על גודל פיקסלים עקבי.במרכז הנדן נמצא הריכוז הגדול ביותר של נבגים ומפרשים מזהמים. לכן, יש לשאוף לתשע עד 12 תמונות של כל נדן כדי לקבל מספרים משמעותיים לניתוח סטטיסטי. אתרי ההדבקה של הנדן צולמו באמצעות טלפון חכם ומתאם מיקרוסקופ סמארטפון לאחר צביעה בכחול טריפאן.החום והחומצה האצטית בתהליך הצביעה מרככים את רקמת העלה בעדינות. השטיפות לאחר הצביעה בגליצרול 60% לא רק מסירות את הכתם העודף, אלא גם מסייעות להפחית את פיזור האור שנגרם על ידי העלה ולשפר את איכות התמונה. סטיות מפרוטוקול הצביעה עלולות לגרום לתוצאות לא אופטימליות, כפי שמתואר כאן.שעורה נגועה בסוג בר 4091 ייצרה תאים נגועים בהצלחה שזוהו על ידי נוכחות של קורים נגועים בתוך רקמת מעטפת העלה. במקרה של זיהום J99A מוטנטי, התפתחות מוצלחת של יתדות אפרסוריה וחדירה הבחינו אך לא יצרו קורים פולשניים. העיתוי חשוב לבדיקות מבוססות זיהום.צמחים מיושנים כראוי ונבגי פטריות חיוניים להצלחה. במחקר זה הסתכלנו על נוכחות או היעדר מבני הזיהום. ניסויים נוספים יכולים לענות על שאלות לגבי הפנוטיפ של מבנה הזיהום ושל הקורים הפולשים.המתודולוגיה שלנו אינה חדשה, אלא גרסה פשוטה ונגישה של ניסוי מורכב ויקר יותר.

visualizing-early-infection-sites-rice-blast-disease-magnaporthe

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מקור: Wen, J., Pasman, et al., Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ תאורה מובנה לרכישת תמונות פלואורסצנטיות תלת מימדיות החושפות את ארגון חלבוני הנביטה בתוך נבג החיידקים.

הדמיה של חלבוני נביטה בקרום הפנימי של נבגי חיידקים

סרטון זה מדגים טכניקה לביסוס זיהום הפטרייה הפתוגנית Magnaporthe grisea בעלי צמח האורז. תרחיף הקונידיה הפטרייתי מרוסס על חלקים של עלה אורז, והתקדמות המחלה מוערכת על ידי ניקוד היווצרות נגעים נמקיים.

טכניקת חיסון ריסוס לביסוס זיהום פטרייתי בעלי צמח האורז

סרטון זה מדגים את ביסוס זיהום עלי צמח האורז באמצעות חיסון פצוע עם תפטיר Magnaporthe grisea. צינור הנבט שמקורו בנבג פטרייתי חודר לשכבת האפידרמיס, וכתוצאה מכך נוצר זיהום ברקמות ונגעים על העלים. שיטה זו מסייעת לסינון פתוטיפ ומשפרת את הבנת עמידות הצמחים להשבחה מולקולרית.

ביסוס זיהום עלי צמח האורז באמצעות חיסון פטרייתי באמצעות פציעה

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לבדוק התקפה אלימה צמח עם המחלה צמח Magnaporthe grisea. דוח זה לתרום הקרנת בקנה מידה גדול pathotypes של פטריות מבודד, לשמש נקודת התחלה מצוינת להבנת מנגנוני עמידות הצמחים במהלך ההתרבות מולקולרית.

הבדיקה זיהום צמח: ריסוס, בתיווך הפצע חיסון עם הפתוגן של צמח Magnaporthe Grisea

פרוטוקול זה מאפשר הכנת קטעים רוחביים של זרעי דגנים (למשל, אורז) לניתוח של מורפולוגיה של אנדוספרם וגרגר עמילן באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת.

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

עבודה זו מתארת את השימוש בטכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR-Cas9 כדי נוקאאוט גן אנדוגני OsABCG15 ואחריו Agrobacterium שונה-פרוטוקול טרנספורמציה בתיווך לייצר קו זכר סטרילי יציב באורז.

אגרובקטריום -תווךטרנספורמציה גנטית, ייצור טרנסגנית, ויישום שלה לחקר התפתחות הרבייה הגברית באורז

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקת ניקוי של יורה אורז, שקשה להכין לתצפיות מבניות פנימיות בגלל האופי הקשה, העבה או השכבתי של הרקמות. שיטה זו מאפשרת תצפיות פלואורסצנטיות מתמשכות ועמוקות, אפילו בצמחי אורז בוגרים.

תצפית פלואורסצנטית עמוקה בצילומי אורז באמצעות טכנולוגיית סליקה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה אופטימלית לתצפית היסטולוגית של גלים המושרים על ידי פלזמודיופורה brassicae. מקטעי ויברטומים של היפוקוטיל מנוקים לפני הדמיה פלואורסצנטית כדי לחקור את המעורבות של גורמי שעתוק ופיטוהורמונים במהלך התקדמות המחלה. פרוטוקול זה מתגבר על מגבלות הטמעת הרגם, ומאפשר הדמיה של חלבונים פלואורסצנטיים בצמחים.

שילוב של מיקרוסקופיית ניקוי ופלואורסצנציה להדמיית שינויים בביטוי גנים ותגובות פיזיולוגיות לפלסמודיופורה brassicae

במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי אפופלסטי (ROS) ברקמות אורז בתגובה חיסונית מולקולרית המופעלת על ידי תבניות מולקולריות הקשורות לפתוגן. שיטה זו פשוטה, סטנדרטית ומייצרת תוצאות הניתנות לשחזור בתנאים מבוקרים.

זיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי בתגובה חיסונית באורז עם בדיקת כימילומינסנציה

כתב יד זה מפרט פרוטוקול חיסון אופטימלי המשתמש בנדן עלי תירס מנותק למחקרים ציטולוגיים, פיזיולוגיים ומולקולריים הניתנים לשחזור של אינטראקציות תירס עם פתוגנים צמחיים פטרייתיים. מעטה העלים מאפשר תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תאיות בין הצמח החי לפטרייה ברקמות לא מקובעות.

נדן תירס מנותק להדמיית תאים חיים של זיהום על ידי פתוגנים פטרייתיים של תירס פוליארי

מאמר זה מתאר פרוטוקול ליצירת חיסון פטריות מיקוריזה ארבוסקולר (AM) כדי לחקור סבילות מוגברת למלח באורז.

ייצור חיסון פטרייתי של מיקוריזה ארבוסקולרית (AM) והערכה פנוטיפית של סימביוזה של אורז ו-AM בתנאי מלח

למד הדמיה של אתרי זיהום מוקדמים של מחלת פיצוץ האורז בזמן אמת על שעורה באמצעות מיקרוסקופ בסיסי וטלפון חכם. שיטה זו מאפשרת סינון מהיר של מוטנטים פטרייתיים ללא ציוד יקר.

הדמיה של אתרי זיהום מוקדמים של מחלת פיצוץ האורז (Magnaporthe oryzae) על שעורה (Hordeum vulgare) באמצעות מיקרוסקופ בסיסי וטלפון חכם (וידאו) | JoVE Journal

הדמיה של אתרי זיהום מוקדמים של מחלת פיצוץ האורז (Magnaporthe oryzae) על שעורה (Hordeum vulgare) באמצעות מיקרוסקופ בסיסי וטלפון חכם

גלה סרטונים נוספים