רישום זרם אשלגן תלוי מתח על קרדיומיוציטים H9C2 באמצעות טכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים

פרוטוקול זה מתעד בהצלחה את ההשפעות של האקוניטין על ה- IKv של תאי H9C2. קידום שלבים חדשים לחקר מנגנון הקרדיוטוקסיות של תרופות מנקודת המבט של תעלות יונים. טכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים היא תקן הזהב של מחקר תעלות יונים עם רגישות גבוהה, דיוק גבוה וספציפיות גבוהה.

ניתן להשתמש בטכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים כדי לחקור את המנגנונים הפרמקולוגיים או הרעילים של תעלות יונים ספציפיות עבור מחלות רב-מערכתיות, כגון מערכת הלב וכלי הדם ומערכת העצבים. כדי להתחיל, לעכל את התאים עם 0.25% טריפסין במשך 30 שניות, ברגע צלחת תרבית H9C2 הופך 80% נפגש. תרבית 2 כפול 10 עד 5 תאים למיליליטר עם מדיום רגיל או תרופה המכילה בינוני בצלחת 35 מילימטר עם צלחות זכוכית במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, עם אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני ו 70 עד 80% לחות יחסית.

מפעילים את משוך המיקרופיפטה ומחממים מראש למשך 30 דקות. ואז לשים נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה על מושך micropipette. בחר את התוכנית ולחץ על Enter בלוח הבקרה.

לחץ על תוכנית הרמפה בפינה השמאלית העליונה כדי לקבוע את ערך החום של נימי הזכוכית. כתוב את התוכנית למשיכת האלקטרודה על פי הערך שנקבע על ידי בדיקת הרמפה ולחץ על משיכה כדי להתחיל לייצר את הפיפטות. הפעל את הממיר האנלוגי הדיגיטלי, את מגבר האות, את המיקרו מניפולטור, את המיקרוסקופ ואת המצלמה.

פתח את יישום ההדמיה, את תוכנת מגבר האותות ואת תוכנת רכישת הנתונים ברצף. לחץ על רכישה ובחר ערוך פרוטוקול בתוכנת רכישת הנתונים. ערוך את התוכנית בממשק צורת הגל.

הזן ערכים עבור הרמה הראשונה, רמת הדלתא, משך הזמן הראשון ומשך הדלתא עבור epoch A, epoch B ו- epoch C.לאחר מכן לחץ על ממשק קצב המצב והגדר את נתוני הירארכיית הניסיון. לאחר מכן, לחץ על פרוטוקול העריכה כדי לבחור את כפתור הגירוי ולהגדיר את תוכנית חיסור הדליפה בתיבת הדו-שיח של חיסור דליפת PM. כדי ליצור את נתיב אחסון הנתונים, לחץ על קובץ ובחר הגדר שמות קבצי נתונים בתוכנת רכישת הנתונים.

לאחר מכן פתח את פרוטוקול lKv שהוקם על ידי בחירת רכישה ולחיצה על פרוטוקול פתוח בתוכנת רכישת הנתונים. לבסוף, לחץ על אפשרות הכלים ובחר בדיקת ממברנה כדי להתחיל להפעיל את הפרוטוקול. הוסיפו את התמיסה החוץ-תאית לאמבטיית התאים על מנגנון הידוק הטלאי של התא כולו והניחו את הכיסוי כלפי מעלה עם תאי H9C2 באמבטיה.

מלאו 30% מהפיפטה בתמיסה החוץ-תאית והתקינו אותה על מחזיק אלקטרודת ההקלטה המשולב במנגנון המדבקה. הדקו את הפיפטה עם מחזיק אלקטרודת ההקלטה. ואז להפיל את פיפטה לתוך האמבטיה עם מניפולטור מיקרו.

לחץ על ממשק היסט פיפטה של תוכנת מגבר האותות כדי לשמור על בסיס זרם ה- lKv באפס פיקואמפים. ספק לחץ חיובי מתאים באופן ידני עם מזרק 1.0 מיליליטר, המחובר למחזיק אלקטרודת ההקלטה, דרך צינור פלסטיק. הזז את הפיפטה מעט על ידי מניפולציה של המיקרומניפולטור בשלושה ממדים כדי ליצור קשר עם התא.

ברגע שהממברנה בודקת גל מרובע יורד בשליש עד חצי לאחר שהפיפטה נוגעת בקרום התא, הסר את הלחץ החיובי וספק באופן ידני לחץ שלילי מתאים. לאחר מכן לחץ על ממשק התיקון של תוכנת רכישת הנתונים כדי ליצור את gigaseal. השתמש בתוכנת מגבר האות האיטי לפיצוי קיבוליות במהלך תקרת התא כדי לפצות על הקיבול המהיר והאיטי.

החל פולסים קצרים של לחץ שלילי כדי לקרוע טלאי של קרום התא. בצע פיצוי קיבוליות של קרום תא שלם על ידי לחיצה על כפתור התא השלם של תוכנת מגבר האותות. לבסוף, שמור והקלט את הנתונים, על ידי לחיצה על כפתור הקלטת הנתונים.

פתח את נתוני ה- lKv השמורים באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים. שמור את יחסי המתח הנוכחי. לחץ על נתח כדי לבחור סטטיסטיקה.

בחר את הטווח כסמנים 1 2 לניתוח נתונים, לחץ על משרעת השיא ולחצני הממוצע ולאחר מכן לחץ על אישור כדי להציג את הנתונים בדף התוצאות. לבסוף, העתק את העמודה של נתוני ממוצע lKv לתוכנת ציור הפונקציות לניתוח נוסף. שמור את העקבות הנוכחיים המייצגים של lKv.

לחץ על ערוך כדי לבחור עקבות העברה, ולאחר מכן בחר את המעקב המלא באזור להעברה. לאחר מכן, לחץ על בחר בבחירת עקבות ובחר IN 0 באותות. לבסוף, לחץ על בסדר כדי להציג את הנתונים בדף התוצאות ולהעתיק את סך הנתונים לתוכנת ציור הפונקציות כדי לצייר את העקבות הנוכחיים.

שמור את פרוטוקול lKv. לחץ על עריכה כדי לבחור ליצור אות צורת גל גירוי ובחר בסדר. לאחר מכן חזור על השלב לציור עקבות נוכחיים מבלי לבחור את האות.

ה-lKv הופעל על ידי 150 אלפיות השנייה של גירוי דופק דה-פולריזציה ממינוס 40 לפלוס 60 מילי-וולט בפוטנציאל החזקה של מינוס 60 מילי-וולט. ה- lKv של קרדיומיוציטים של חולדות H9C2, הופיע לראשונה בסביבות מינוס 20 מיליוולט, ואז המשרעת גדלה עם דה-פולריזציה נוספת. בהשוואה לקבוצת הביקורת, משרעת ה-lKv הופחתה באופן נצפה לאחר חמש דקות של טיפול עם 1.5 מילימולר 4-AP.

בנוסף, ה-lKv ירד משמעותית בפוטנציאל הממברנה מ-10 ל-60 מילי-וולט באופן תלוי מינון, לאחר טיפול AC של 24 שעות. התא הבודד לאחר הקלטת תעלת יונים, יכול לשמש להערכה נוספת של אומיקה חד-תאית, כגון גנומיקה חד-תאית, תעתיק, פרוטאומיקה ומטבוליקה.