Name: ניתוח ביטוי גנים בזקיקים אנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: למד שיטה יעילה לבידוד זקיקים שחלתיים אנושיים לניתוח ביטוי גנים באמצעות בידוד אנזימטי ומכני מבוקר. הטכניקה שומרת על שלמות הזקיקים ומאפשרת הערכת ביטוי גנים ספציפי במחקר ביולוגיה רבייה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מצוינות במדע (EOS) (ID: 30443682). I.D. הוא חוקר עמית ב- Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

פרויקט זה אושר על ידי הוועדה האתית של בית החולים ארסמה (בריסל, בלגיה). המטופלת שנכללה בפרוטוקול זה עברה הקפאת רקמת שחלה (OTC) לשימור פוריות לפני החשיפה לכימותרפיה בשנת 2000. המטופלת חתמה על הסכמה מדעת בכתב לתרום את שאריות הרקמה הקפואה שלה למחקר בתום תקופת האחסון.
1. הפשרה של רקמת שחלה בהקפאה
<ol><li>מכינים צלחת בת 6 בארות המכילה 5 תמיסות הפשרה. הבאר הראשונה מכילה 5 מ"ל של תמיסה cryoprotectant המורכבת מדיום Leibovitz-15, 0.1 mol / L סוכרוז, 1.5 mol / L dimethyl sulfoxide (DMSO), ו 1% אלבומין בסרום אנושי (HSA). הבארות הבאות מכילות 5 מ"ל של מדיום לייבוביץ-15 עם ריכוזים הולכים ופוחתים של הגנה קריופרוטקטיבית: 1 mol/L, 0.5mol/L ו-2 x 0mol/L DMSO. הערה: הפתרון cryoprotectant יכול להשתנות בהתאם לפרוטוקול המשמש במרפאת הפוריות.</li>
	<li>יש להסיר בקבוקון המכיל מקטע קליפת המוח השחלתית מחנקן נוזלי בהתאם לכללי הבטיחות (כפפות קריוגניות, משקפי מגן ונעליים סגורות), ולשמור את הצינורית בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 שניות.</li>
	<li>משרים את הבקבוקון במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות ב-RT בעצבנות עדינה לפני פתיחת הבקבוקון מתחת למכסה מנוע אנכי ומעבירים אותו ישירות לבאר הראשונה של צלחת 6 הקידוחים (על קרח).</li>
	<li>מעבירים את השבר ברצף לכל באר של צלחת 6 הקידוחים, כאשר כל באר מכילה ריכוזים הולכים ופוחתים של חומר קריופרוטקטיבי ב-5 מ"ל של תווך לייבוביץ-15. יש לסעיר בעדינות את הרקמה בכל מדיום למשך 5 דקות (על קרח).</li>
</ol>2. בידוד זקיקים
הערה: כל הניסויים נערכים באמצעות חומרים נטולי RNase ומתחת למכסה מנוע אנכי.
<ol><li>מעבירים את הרקמה המופשרת לצלחת פטרי מרושתת בקוטר 2 מ"מ מלאה ב-10 מ"ל תווך דיסקציה (לייבוביץ-15 בינוני, נתרן פירובט [2 מילימול/ל'], ל-גלוטמין [2 מילימול/ל'], HSA [0.3%], פניצילין G [30 מק"ג/מ"ל] וסטרפטומיצין [50 מק"ג/מ"ל]). התאם את גודל הרקמה עם אזמל במידת הצורך. הערה: בהתאם לפרוטוקול הקליני, גודל הרקמה הקפואה יכול לנוע בין 8 מ"מ x 4 מ"מ x 1 מ"מ ל 4 מ"מ x 2 מ"מ x 1 מ"מ. עבור פרוטוקול זה, שתי רצועות של 4 מ"מ x 2 מ"מ x 1 מ"מ שימשו.</li>
	<li>ערמו את שלוש החתיכות של חותך הרקמות, הניחו את השבר בין שני הגושים, וחתכו את השבר לשניים באמצעות להב, מחליקים דרך הבלוקים כדי לקבל שני שברים בעובי 0.5 מ"מ.</li>
	<li>השתמש במסוק הרקמות כדי לחתוך את השבר ולקבל חתיכות קטנות יותר. במידת הצורך, חותכים את החתיכות הנותרות באופן ידני עם אזמל עד שהרקמה מתנפצת לחלוטין.</li>
	<li>העבירו את הרקמה המקוטעת לצלחת פטרי מרושתת מלאה ב-7 מ"ל של מדיום עיכול (מדיום תרבית [מדיום 5A של McCoy, 3 מילימול/ליטר גלוטמין, 0.1% HSA, 30 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין G, 50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל טרנספרין, 4 נ"ג/מ"ל סלניום ו-50 מק"ג/מ"ל חומצה אסקורבית] בתוספת 0.2% קולגנאז ו-0.02% DNase).</li>
	<li>שים את המנה באינקובטור ב 5% CO2 ו 37 ° C. כל 10 דקות, הוציאו את צלחת הפטרי מהאינקובטור, ושטפו את הרקמה על ידי פיפט מעלה ומטה עם פיפטה של 1 מ"ל.</li>
	<li>לאחר 45 דקות של דגירה במדיום העיכול, מניחים את המנה תחת סטריאומיקרוסקופ עם טווח הגדלה של 5x-6.3x, ושולפים את הזקיקים באמצעות פיפטה מיקרוקפילרית. בחר את הזקיקים המעניינים, ובודד אותם על ידי מציצתם עם פיפטה בפה. הערה: יש לבצע צנרת פה בזהירות כדי למנוע אובדן חומר לתוך הצינור וזיהום.</li>
	<li>אם הזקיקים נשארים תקועים בחתיכת קליפת המוח, בודדו אותם מכנית עם שני מזרקים של 27 G על ידי קריעת קליפת המוח עם קצה המזרקים כדי לשחרר זקיקים מהסטרומה. הערה: אין לגעת בזקיקים עם המזרקים כדי למנוע פגיעה בהם.</li>
	<li>מעבירים את הזקיקים עם המיקרו-נימים בצלחת בעלת 4 בארות המכילה טיפות של 15 מיקרוליטר של מדיום התרבית המכוילת המכוסה ב-500 מיקרוליטר תרבית שמן (1 עד 10 זקיקים לטיפה). שלב זה שומר על כדאיות הזקיק בתהליך האיסוף. בסוף ההליך, שטפו את הזקיקים פעמיים במשך 5 שניות בכל פעם בשתי טיפות של 15 מיקרוליטר של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) המכוסה על ידי 500 מיקרוליטר של תרבית שמן (על קרח).</li>
	<li>אספו 20 זקיקים עם כמות מינימלית של PBS באמצעות פיפטת הפה (מקסימום 10 μL) בצינור ריק, ושמרו את הצינור על קרח. הערה: עבור יציבות RNA, חיוני לבצע את שלב 2.8 ושלב 2.9 על קרח. בסביבות 20 זקיקים (<75 מיקרומטר) נדרשים כדי שיהיה מספיק RNA עבור RT-qPCR סטנדרטי (SYBR Green).</li>
	<li>לאחר מקסימום של 90 דקות דגירה בתווך העיכול, עצור את התגובה האנזימטית על ידי הוספת לצלחת פטרי עודף של תמיסה חוסמת קרה (4 ° C) (7.5 מ"ל) המורכבת ממדיום תרבית בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS). הערה: ניתן להוסיף את הפתרון החוסם ברגע שהנסיין מבחין בזקיקים שנדבקים לצלחת או זקיקים פגומים (צורה אסימטרית או זקיקים בצבע כהה יותר). מומלץ לבצע בידוד זקיקים בפרק זמן מקסימלי של 2.5 שעות כדי למנוע נזק לזקיקים ולבצע שאיבת RNA מיד לאחר הבידוד.</li>
</ol>3. מיצוי RNA
הערה: מיצוי RNA מתבצע בהתאם להוראות שסופקו עם ערכת מיצוי RNA על ידי התאמת נפחי elution.
<ol><li>להשהות את הזקיקים המבודדים על ידי הוספת 100 μL של תמיסת הליזה המסופקת עם ערכת מיצוי RNA לצינור המכיל את הזקיקים מתחת למכסה מנוע כימי, ולערבל במהירות גבוהה (2,500 סל"ד / דקה) כדי לשבור את מבנה הזקיקים. מוסיפים 50 μL אתנול (100%) לצינור, ומערבלים לזמן קצר במהירות גבוהה. הערה: מכיוון שחיץ הליזיס מכיל 2-מרקפטואתנול וחומצה תיוציאנית, שלב זה חייב להתבצע בזהירות תחת מכסה מנוע כימי.</li>
	<li>העבר את הנפח הכולל של הצינור (כ- 160 μL) למכלול מחסנית מיקרו-מסנן הכולל עמוד וצינור איסוף, וצנטריפוגה אותו למשך 10 שניות ב- 16,363 x גרם ב- 4 ° C. שטפו את העמוד עם 180 מיקרוליטר של תמיסת כביסה 1, שסופקה עם הערכה, וצנטריפוגו את הצינור למשך 10 שניות בטמפרטורה של 16,363 x גרם ב-4°C.</li>
	<li>הוסף 180 μL של תמיסת כביסה 2/3, שסופקה עם הערכה, לעמודה, וצנטריפוגה עבור 10 שניות ב 16,363 x גרם ב 4 ° C. בצע שלב זה פעמיים. צנטריפוגו את הצינור פעם אחרונה למשך דקה אחת כדי לייבש את המסנן, והניחו צינור איסוף חדש מתחת למחסנית.</li>
	<li>בצע את elution של חומצות הגרעין בשני שלבים:<ol><li>ראשית, הוסף 8 μL של תמיסת elution חם (75 ° C) למסנן, לחכות 1 דקה ב RT, וצנטריפוגה במשך 30 s ב 16,363 x גרם ב 4 ° C.</li>
		<li>חזור על שלב זה עם 7 μL של תמיסת אלוציה. הערה: הצינור המכיל את חומצות הגרעין המדוללות חייב להישמר על קרח. כדי למנוע זיהום DNA, שלב משלים של פירוק DNA מומלץ מאוד - שלב 3.5.</li>
	</ol></li>
	<li>יש לדגור על הצינור עם 2 IU DNase ו-1x DNase buffer למשך 20 דקות ב-37°C. חסום את הפעילות האנזימטית עם מגיב השבתה של 1/10 DNase למשך 2 דקות ב- RT.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינור למשך דקה וחצי ב 16,363 x גרם ב 4 ° C. לבסוף, לאסוף את התרחיף המכיל את RNA, ולהעביר אותו צינור חדש.</li>
	<li>להעריך את כמות הרנ"א הקיימת בדגימה באמצעות ספקטרופוטומטר (תוכנת NanoDrop 2000 > Nucleic Acid > RNA). השתמש 1 μL של תמיסת elution כמו ריק, ולמדוד את כמות RNA מופק זקיקים מבודדים עם 1 μL של תמיסה.</li>
	<li>בדוק את יחס 260/280 עבור טוהר RNA (סביב 2.0). אחסן את הדגימה ב -80 ° C, או ישירות רטרותמלל אותה כדי לבצע RT-qPCR. הערה: כדי להעריך את שלמות הרנ"א, ניתן לעבד את הדגימה באמצעות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית ברזולוציה גבוהה לפני או אחרי הקפאה ב-80°C. בעבודה זו, לאחר רטרותמלול, RT-qPCR בוצע עם המחזור הבא: החזק את הבמה עם 20 שניות ב- 50 ° C ו- 10 דקות ב- 95 ° C 40 מחזורי PCR עם 15 שניות ב-95°C ודקה אחת ב-60°C שלב עקומת התכה עם 15 שניות ב- 95 ° C, דקה אחת ב- 60 ° C, 30 שניות ב- 95 ° C ו- 15 שניות ב- 60 ° C</li>
</ol>

<ol><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+follicular+development%3A+From+activation+of+resting+follicles+to+preovulatory+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+d%27Endocrinologie%22%5BJournal%5D)">Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation.</a> Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).</li>
<li>Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+human+ovarian+folliculogenesis+and+its+implications+in+assisted+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).</li>
<li>Rosewell, K. L., Curry, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ovarian+matrix+metalloproteinase+mRNAs+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization.</a> Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).</li>
<li>Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+localisation+of+c-kit+and+KITL+in+the+adult+human+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary.</a> Journal of Ovarian Research. 8, 31(2015).</li>
<li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+primordial+follicles+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue.</a> Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).</li>
<li>Bonnet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+sheep+granulosa+cells+and+oocytes+during+early+follicular+development+obtained+by+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection.</a> BMC Genomics. 12, 417(2011).</li>
<li>Chiti, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+and+tailored+human+follicle+isolation+procedure+improves+follicle+recovery+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival.</a> Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71(2017).</li>
<li>Kim, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+follicle+isolation+methods+for+mouse+ovarian+follicle+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro.</a> Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+follicle+isolation+for+bioengineering+of+human+artificial+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary.</a> Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).</li>
<li>Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+isolation+methods+reveal+plasticity+of+granulosa+cell+steroidogenic+capacity+during+mouse+in+vitro+follicle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth.</a> Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).</li>
<li>McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+small+preantral+follicles+from+the+bovine+ovary+using+a+combination+of+fragmentation%2C+homogenization%2C+and+serial+filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration.</a> Journal of Visualized Experiments. (187), e64423(2022).</li>
<li>Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+%28IVG%29+of+human+ovarian+follicles+in+frozen+thawed+ovarian+cortex+tissue+culture+supplemented+with+follicular+fluid+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+grown+human+ovarian+follicles+from+cancer+patients+support+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth.</a> Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).</li>
<li>Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+experience+of+ovarian+tissue+cryopreservation+procedure%3A+Alternatives%2C+perspectives+and+feasibility%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility.</a> Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).</li>
<li>Demeestere, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+function+and+spontaneous+pregnancy+after+combined+heterotopic+and+orthotopic+cryopreserved+ovarian+tissue+transplantation+in+a+patient+previously+treated+with+bone+marrow+transplantation%3A+Case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report.</a> Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).</li>
<li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human%3A+A+model+from+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li>
<li>Grosbois, J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+PI3K+and+Hippo+signaling+pathways+during+in+vitro+human+follicle+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation.</a> Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).</li>
<li>Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+intercellular+contact-mediated+communication+in+cultured+human+early+stage+follicles+exposed+to+mTORC1+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor.</a> Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).</li>
<li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+function+and+oocyte+retrieval+after+autologous+transplantation+of+ovarian+cortical+strips+to+the+forearm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm.</a> Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).</li>
<li>Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+cryopreservation+versus+ovarian+tissue+cryopreservation+for+adult+female+oncofertility+patients%3A+A+cost-effectiveness+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).</li>
<li>Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+follicle+health+and+development+in+cultured+cryopreserved+ovarian+cortical+tissue%3A+A+study+of+ovarian+tissue+from+patients+undergoing+fertility+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Fertility%22%5BJournal%5D)">Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation.</a> Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).</li>
<li>Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ovarian+follicle+growth%3A+A+comprehensive+analysis+of+key+protocol+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables.</a> Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).</li>
<li>Rice, S., Ojha, K., Mason, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+biopsies+as+a+viable+source+of+pre-antral+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles.</a> Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).</li>
<li>Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pre-antral+follicles+from+human+ovarian+medulla+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue.</a> Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).</li>
<li>Dong, F. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+research+on+the+isolation+methods+of+frozen-thawed+human+ovarian+preantral+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).</li>
<li>Lierman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicles+of+various+maturation+stages+react+differently+to+enzymatic+isolation%3A+a+comparison+of+different+isolation+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols.</a> Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+isolated+early+human+follicles+cultured+in+collagen+gels+for+24+hours%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours.</a> Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+study+of+fully+and+partially+isolated+early+human+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Morphological study of fully and partially isolated early human follicles.</a> Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).</li>
<li>McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+isolation+and+in+vitro+growth+of+preantral+and+small+antral+human+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles.</a> Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).</li>
<li>Vanacker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+isolation+of+human+primordial+and+primary+ovarian+follicles+with+Liberase+DH%3A+Protocol+for+application+in+a+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting.</a> Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).</li>
<li>Amargant, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+stiffness+increases+with+age+in+the+mammalian+ovary+and+depends+on+collagen+and+hyaluronan+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices.</a> Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

שימור בהקפאה של רקמת השחלה הוא גישה מבטיחה לשימור פוריותן של חולות סרטן. במרפאה, רקמת קליפת המוח המופשרת מושתלת בחזרה למטופלת לאחר הפוגה, ומאפשרת את חידוש תפקוד השחלות והפוריות19,20. מלבד השימוש הקליני, ניתן לתרום גם שאריות של שברי שחלות למחקר בסוף תקופת האחסון כדי לחקור את המנגנונים המווסתים את הפוליקולוגנזה. יתר על כן, רקמה זו שימושית במיוחד לפיתוח חלופות להשתלה כאשר היא אינה אפשרית, כגון מערכות תרבית חוץ גופית או שחלות מלאכותיות. עם זאת, שינויים בתוך ...

השחלה היא איבר מורכב המורכב מיחידות תפקודיות ומבניות, כולל הזקיקים בתוך קליפת המוח והסטרומה. פוליקולוגנזה, התהליך של הפעלת זקיקים, גדילה והבשלה ממצב שקט קדמוני לזקיק בוגר המסוגל להיות מופר ולתמוך בהתפתחות עוברית מוקדמת, נחקר רבות במחקר1. חשיפת המנגנונים המניעים תופעה זו עשויה לשפר את טיפולי הפוריות לנשים2. ניתוחים על רקמה אנושית קבועה מאפשרים הערכה של ביטוי חלבונים ולוקליזציה של גנים בתוך היחידות התפקודיות של השחלה 3,4. עם זאת, נדרשות טכניקות ספציפיות כדי לנתק את הזקיקים מקליפת המוח שמסביב כדי להעריך במדויק את רמות ביטוי הגנים בתוך זקיקי השחלות. לפיכך, במחקר קודם פותחה טכניקת בידוד זקיקים המאפשרת ניתוח של ביטוי גנים ישירות מהיחידה התפקודית של השחלה5. גישות שונות פותחו, כגון עיכול אנזימטי ו / או בידוד מכני, כמו גם מיקרודיסקציה לכידת לייזר, המאפשרים בידוד זקיק בתוך פיסת רקמה 6,7,8,9. בידוד זקיקים נמצא בשימוש נרחב, ברקמת שחלה אנושית או חייתית, כדי להעריך את פרופילי ביטוי הגנים של זקיקים בכל שלבי ההתפתחות10,11,12. עם זאת, הליך בידוד אופטימלי צריך לקחת בחשבון את המבנה השביר של הזקיק בתוך קליפת המוח הצפופה, ולכן, צריך להתבצע בזהירות כדי למנוע כל נזק7. כתב יד זה מתאר פרוצדורה, שאומצה מפרוטוקול שתואר על ידי מעבדתו של וודרוף, לבידוד זקיקים אנושיים מקליפת המוח השחלתית שהוקפאה והופשרה לצורך ביצוע ניתוחי ביטוי גנים13.
השלב הראשון של בידוד זקיק השחלות מרקמה אנושית קפואה הוא הליך ההפשרה. תהליך זה מבוצע על בסיס הפרוטוקול הקליני המשמש להשתלת רקמת שחלה קפואה, כפי שתואר קודם לכן14,15. התהליך נועד להסיר את החומרים cryoprotectant על ידי שטיפת קליפת השחלה בריכוז יורד של המדיום. לאחר מכן, הרקמה מקוטעת לפני בידוד אנזימטי ומכני כדי לאחזר את הזקיקים. זקיקים בשלבים שונים ניתן להבחין באמצעות סטריאומיקרוסקופ עם הגדלה גבוהה אופטיקה באיכות טובה על מנת לבודד את אלה המעניינים. כל זקיק מבודד נמדד באמצעות סרגל המשולב במיקרוסקופ, וניתן לאגד את הזקיקים בהתאם לשלב ההתפתחותי שלהם: זקיקים ראשוניים (30 מיקרומטר), זקיקים ראשוניים (60 מיקרומטר), זקיקים שניוניים (120-200 מיקרומטר) וזקיקים אנטראליים (>200 מיקרומטר)16. סיווג נוסף יכול להתבצע על פי המורפולוגיה של הזקיקים: לזקיקים ראשוניים יש שכבה אחת של תאי גרנולוזה שטוחים (GCs), לזקיקים ראשוניים יש שכבה אחת של GCs קובואידיים, לזקיקים משניים יש לפחות שתי שכבות של GCs קובואידיים, ונוכחות חלל בין ה- GCs מאפיינת את השלב האנטראלי. כאשר זקיקים של עניין נבחרים, מיצוי RNA מבוצע. הכמות והאיכות של הרנ"א מוערכות לפני תגובת שרשרת כמותית של פולימראז בזמן אמת (RT-qPCR) (איור 1).

<table><tbody><tr><td>צלחת פטרי מרושתת 2 מ"מ</td><td>Corning</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>2100 מכשיר ביואנלייזר</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>2100 תוכנת מומחה</td><td></td><td>Agilent גרסה B.02.08.SI648</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 4 בארות</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6789</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>Carl Roth</td><td>&nbsp; EKX5.1</td><td></td></tr><tr><td>Agilent סך הכל RNA 6000 ערכת פיקו</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>מכלולי צינור שואב עבור פיפטות מיקרו-נימיות</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז IV</td><td>LifeTechnologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4527-10kU</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GoScript טרנסקריפט הפוך טרנסקריפטאז</td><td>Promega</td><td>A5003</td><td></td></tr><tr><td>HSA</td><td>CAF DCF&nbsp;</td><td>LC4403-41-080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz-15</td><td>LifeTechnologies</td><td>11415-049</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>McCoy' s 5A + ביקרבונט + Hepes</td><td>LifeTechnologies</td><td>12330-031</td><td></td></tr><tr><td>קוצץ רקמות McIlwain</td><td>Stoelting</td><td>51350</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-נימי RI EZ-Tips 200 ומיקרו; m</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-2200/1</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-נימי RI EZ-Tips 75 ומיקרו; m</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-2075/1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c תוכנת הפעלה</td><td>ThermoFisher</td><td>גרסה 1.6</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר NanoDrop</td><td>ThermoFisher</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>PowerTrack SYBR ירוק מאסטר מיקס</td><td>ThermoFisher</td><td>A46109</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים: GDF9</td><td></td><td></td><td>F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG</td></tr><tr><td>פריימרים: HPRT</td><td></td><td></td><td>F: CCTGGCGTCGTCGTGATTAGATGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA</td></tr><tr><td>פריימרים: Kit Ligand</td><td></td><td></td><td>F: TGTTACTTTCGTCATTCTCTCTGG R: AGTCCTCTCCATGCAAGTT</td></tr><tr><td>QPCR בזמן אמת Quantstudio 3</td><td>ThermoFisher</td><td>A33779</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד RNA כוללת RNAqueous-micro</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>סלניום</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומיצין סולפט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S1277</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Series II&nbsp; מעטפת מים CO2&nbsp; אינקובטורים</td><td>ThermoFisher</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>תומאס סטדי-ריגס פורס רקמות</td><td>תומס סיינטיפיק</td><td>6727C10</td><td></td></tr><tr><td>טרנספרין</td><td>רוש&nbsp;</td><td></td><td></td>10652202001</tr></tbody></table>

ניתוח ביטוי גנים בזקיקים אנושיים

Gene Expression Analyses in Human Follicles

השחלה היא איבר הטרוגני המורכב מסוגי תאים שונים. כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המתרחשים במהלך folliculogenesis, לוקליזציה של חלבונים ביטוי גנים יכול להתבצע על רקמה קבועה. עם זאת, כדי להעריך כראוי את רמות ביטוי הגנים בזקיק אנושי, יש לבודד מבנה מורכב ועדין זה. לפיכך, פותח פרוטוקול מותאם שתואר בעבר על ידי מעבדתו של וודרוף כדי להפריד זקיקים (הביצית ותאי הגרנולוסה) מסביבתם. רקמת קליפת המוח השחלתית מעובדת תחילה באופן ידני כדי להשיג שברים קטנים באמצעות שני כלים: חותך רקמות ומסוק רקמות. לאחר מכן הרקמה מתעכלת אנזימטית עם 0.2% collagenase ו-0.02% DNase למשך 40 דקות לפחות. שלב העיכול הזה מבוצע ב 37 ° C ו 5% CO2 והוא מלווה pipetting מכני של המדיום כל 10 דקות. לאחר הדגירה, הזקיקים המבודדים נאספים ידנית באמצעות פיפטה מיקרוקפילרית מכויילת תחת הגדלה במיקרוסקופ. אם זקיקים עדיין נמצאים בחתיכות הרקמה, ההליך הושלם עם microdissection ידני. הזקיקים נאספים על קרח בתווך תרבית ונשטפים פעמיים בטיפות של תמיסת מלח חוצצת פוספט. הליך עיכול זה חייב להיות מבוקר בקפידה כדי למנוע הידרדרות זקיק. ברגע שנראה שמבנה הזקיקים נפגע או לאחר מקסימום של 90 דקות, התגובה נעצרת עם תמיסת חסימה של 4 מעלות צלזיוס המכילה 10% נסיוב בקר עוברי. יש לאסוף לפחות 20 זקיקים מבודדים (בגודל של פחות מ-75 מיקרומטר) כדי לקבל כמות מספקת של RNA כולל לאחר מיצוי RNA עבור תגובת שרשרת כמותית של פולימראז בזמן אמת (RT-qPCR). לאחר החילוץ, הכימות של סך הרנ"א מ-20 זקיקים מגיע לערך ממוצע של 5 ננוגרם/מיקרוליטר. לאחר מכן הרנ"א הכולל משועתק לאחור ל-cDNA, והגנים המעניינים מנותחים עוד יותר באמצעות RT-qPCR.

באמצעות הליך בידוד זה, הנסיין יכול לשלוף זקיקים מסביבת סטרומה כדי לבצע ניתוחים ספציפיים של ביטוי גנים. בהתבסס על גודל ומורפולוגיה של זקיקים, ניתן להבדיל בין השלבים השונים של folliculogenesis. הנסיין יכול לבחור זקיקים מעניינים על פי גודלם באמצעות פיפטה מיקרוקפילרית מותאמת. על ידי שימוש במיקרו-נימים של מקסימום 75 מיקרומטר, ניתן להבחין בין זקיקים ראשוניים וזקיקים ראשוניים לזקיקים משניים, אנטראליים ובוגרים. יתר על כן, הנסיין יכול לאשר את שלב הזקיק על פי מורפולוגיית הזקיק. כאשר חוקרים את הפעלת הזקיקים נבחרים זקיקים שקטים וזקי...

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המתאר כיצד לבודד זקיקי שחלות אנושיות מרקמת קליפת המוח שהוקפאה והופשרה כדי לבצע ניתוחי ביטוי גנים.

The ovary is a heterogeneous organ composed of different cell types. To study the molecular mechanisms occurring during folliculogenesis, the localization ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לבודד זקיקי שחלות מתאי הסטרומה הסובבים אותם כדי להעריך ניתוחי ביטוי גנים על תאי נבט אלה. טכניקה זו, תוך שימוש בבידודים אנזימטיים ומכניים מבוקרים, מאפשרת שליפת זקיקים תוך שמירה על שלמותם. בעקבות פרוטוקול זה, החוקר יכול להעריך ביטויי גנים ספציפיים מתאים אלה.הטכניקה יכולה לשמש כדי להבין עוד יותר את הגירעון של ביטוי גנים בזקיקים הקשורים למחלות המשפיעות על תפקוד השחלות או לאחר חשיפה לחומרים רעילים. התחל להכין צלחת שש בארות על ידי הוספת חמישה מיליליטר של תמיסה cryoprotectant לבאר הראשונה וחמישה מיליליטר של ליבוביץ 15 בינוני עם ריכוזים הולכים ופוחתים של cryoprotectant לארבע הבארות הבאות. יש להסיר בקבוקון המכיל מקטע קליפת המוח השחלתית מחנקן נוזלי בהתאם לכללי הבטיחות.לאחר 30 שניות בטמפרטורת החדר, או RT, השרו את הבקבוקון במים מזוקקים פעמיים למשך שתי דקות. בתוך מכסה מנוע אנכי, להתסיס בעדינות ולפתוח את בקבוקון שבר קליפת המוח השחלתית לפני העברת התוכן לתוך הבאר הראשונה של צלחת שש בארות מונח על קרח. לאחר מכן, העבירו את מקטע קליפת המוח השחלתית בבאר הראשונה ברצף לכל באר של צלחת שש בארות המכילה ריכוזים הולכים ופוחתים של cryoprotectant בחמישה מיליליטר של ליבוביץ 15 בינוני.בעדינות לסעיר את הרקמה בכל מדיום במשך חמש דקות. לבידוד זקיקים, העבירו את רקמת השחלה המופשרת לצלחת פטרי מרושתת בקוטר שני מילימטר מלאה ב-10 מיליליטר תווך דיסקציה, 30 מיקרוגרם למיליליטר פניצילין G ו-50 מיקרוגרם למיליליטר סטרפטומיצין. התאם את גודל הרקמה עם האזמל, במידת הצורך.ערמו את שלושת חלקי חותך הרקמה והניחו את שבר השחלה בין שני הגושים. חותכים את השבר לשניים באמצעות להב, מחליקים דרך הבלוקים כדי להשיג שני שברים בעובי 0.5 מילימטר. חותכים את הרקמה באמצעות מסוק רקמות כדי לקבל את החתיכות הקטנות יותר.במידת הצורך, חותכים את החתיכות הנותרות ידנית עם האזמל עד שהרקמה מרוסקת. לאחר שהרקמה מרוסקת, העבירו את הרקמה המקוטעת לצלחת פטרי מרושתת מלאה בשבעה מיליליטר של אמצעי עיכול לפני שתניחו את התבשיל באינקובטור בטמפרטורה של 5% פחמן דו חמצני ו -37 מעלות צלזיוס. קח את צלחת פטרי מן האינקובטור כל 10 דקות.לשטוף את הרקמה על ידי pipeting את מדיום העיכול למעלה ולמטה עם פיפטה של מיליליטר אחד. לאחר 45 דקות של דגירה בתווך העיכול, מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו עם טווח הגדלה של פי חמישה עד 6.3 ושולפים את הזקיקים באמצעות פיפטה מיקרו נימית. בחר את הזקיקים המעניינים ולבודד אותם על ידי מציצתם עם פיפטה בפה.אם הזקיקים נשארים תקועים בחתיכת קליפת המוח, בודדו אותם מכנית עם שני מזרקים באורך 27 מד על ידי קריעת קליפת המוח עם קצה המזרקים ושחרור זקיקים מהסטרומה. בעזרת נימי המיקרו, מעבירים את הזקיקים המבודדים לצלחת בעלת ארבע בארות המכילה 15 מיקרוליטר של מדיום התרבית המכוילת המכוסה ב-500 מיקרוליטר של תרבית שמן. לאחר העברת אחד עד 10 זקיקים, לשטוף אותם פעמיים בשתי טיפות של 15 מיקרוליטר של PBS מכוסה 500 מיקרוליטר של תרבית שמן במשך חמש שניות כל אחד.בעזרת פיפטת הפה, לאסוף 20 זקיקים עם PBS מינימלי בצינור ריק ולשמור את הצינור על קרח. לאחר 90 דקות של דגירה במדיום העיכול, לעצור את התגובה האנזימטית על ידי הוספת פתרון חוסם קר. מתחת למכסה המנוע הכימי, להשעות את הזקיקים המבודדים ב -100 מיקרוליטר של תמיסת הליזיס המסופקת עם ערכת מיצוי RNA.מערבלים את הזקיקים המבודדים במהירות של 2500 סל"ד לדקה כדי לשבור את המבנה שלהם, ואז מוסיפים 50 מיקרוליטר של אתנול 100% לצינור. ולסובב בקצרה את הצינור במהירות גבוהה. לאחר הערבול, העבירו את הנפח הכולל של הצינור למכלול מחסנית מיקרו פילטר, הכולל עמוד וצינור איסוף.וצנטריפוגה את ההרכבה למשך 10 שניות ב 16, 363 גרם בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את העמוד עם 180 מיקרוליטר של Wash Solution 1 שסופק עם הערכה לפני צנטריפוגה של הצינור למשך 10 שניות. לאחר מתן שתי שטיפות של 180 מיקרוליטר של Wash Solution 2, 3 לעמודה, יבש את המסנן על ידי צנטריפוגה של הצינור בפעם האחרונה והנח צינור איסוף חדש מתחת למחסנית.כדי לבצע את elution של חומצות הגרעין, תחילה להוסיף שמונה מיקרוליטר של 75 מעלות צלזיוס Elution פתרון למכלול המסנן. לאחר דקה, צנטריפוגה את ההרכבה למשך 30 שניות. חזור על שלב זה עם שבעה מיקרוליטרים של תמיסת אלוציה.לאחר שתסיים, הוסף שתי יחידות בינלאומיות DNase ו- DNase חיץ לצינור ודגור על הצינור במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. חסום את הפעילות האנזימטית עם מגיב השבתה של DNase אחד על 10 למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור במשך 1.5 דקות ב 16, 363g בארבע מעלות צלזיוס ולהעביר את המתלה המכיל את RNA לצינור חדש.באמצעות ספקטרופוטומטר, להעריך את כמות RNA בדגימה. השתמש בתמיסת Elution מיקרוליטר אחת כתמיסת RNA ריקה ומיקרוליטר אחד המופק מזקיקים מבודדים. בדוק אם יחס 260/280 הוא סביב 2.0 עבור טוהר RNA.ולאחסן את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס או ישירות רטרותמלל אותה לביצוע RT-qPCR. באמצעות פרוטוקול זה, שני מקטעי השחלות ההומוגניים של 4x2x1 מילימטר מאותה מטופלת עובדו כדי לבודד את הזקיקים. כימות הרנ"א גילה כי 4.8 ננוגרם למיקרוליטר מסך הרנ"א הופק מזקיקים בגודל של פחות מ-75 מיקרומטר עם יחס טוהר של 1.89.מזקיקים של פחות מ-200 מיקרומטר הופקו 10.5 ננוגרם למיקרוליטר מסך הרנ"א ביחס טוהר של 1.74. ערכי מספר שלמות הרנ"א, או RIN, היו 7.1 ו-7.9 בצינורות 1 ו-2 בהתאמה, מה שאימת את איכות הרנ"א מהדגימות שלנו. לאחר הפעלת מחזור סטנדרטי במערכת PCR בזמן אמת, ספי המחזור, או CT, שהתקבלו היו 30.87 ו- 29.56 עבור HPRT, 33.5 ו- 31.77 עבור ליגנד קיט, ו- 30.71 ו- 30.57 עבור GDF9.העיכול האנזימטי של הרקמה הוא נקודה קריטית. על הנסיין להעריך באופן רציף ולהבטיח את שלמות הזקיק במהלך התגובה על ידי הפסקתו בעת הצורך. מלבד ניתוח ביטוי גנים, זקיקים מבודדים משמשים לפיתוח מערכות ניסיוניות לשימור פוריותם של חולי סרטן, כמו זקיק בתרבית חוץ גופית או שחלות מלאכותיות.טכניקת הבידוד דרשה עקומת למידה לשליפת מספר גבוה של זקיקים שלמים. מומלץ לחוקרים לוודא שהרקמה מרוסקת היטב לפני העיכול.

gene-expression-analyses-in-human-follicles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מתאר את התרבות העיקרית / שיתוף התרבות של רקמת השחלה עכבר, באמצעות השחלות מעכברים בילוד וזקיקים בשחלות בודדות מעכברים לפני גיל בגרות מיניים. טכניקות התרבות לתמוך בפיתוח באופן פיסיולוגי מאוד, המאפשר חקירה של ההשפעה של סוכנים חיצוניים בשחלה, ושל יחסי גומלין בין זקיקים בשחלות.

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

כתב יד זה מתאר גישה ניסיונית מורפולוגית וביוכימית לאפיין ביציות סוסים. באופן ספציפי, העבודה הנוכחית מדגימה כיצד לאסוף ביציות של בוגר בוגרת ובוגרת על ידי אולטראסאונד מונחה איסוף ביצית (OPU) וכיצד לחקור הפרדה כרומוזום, מורפולוגיה ציר, acetylation היסטון גלובלי, ביטוי mRNA.

ניתוח של הפרדת כרומוזום, אצטון היסטון, ומורפולוגיה ציר ב סוס ביציות

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

פלואורסצנטיות RNA מולקולה אחת בהכלאה במקום (smFISH) היא שיטה לכימות מדויק של רמות ולוקליזציה של RNAs ספציפיים ברמת התא הבודד. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקולי המעבדה המאומתים שלנו לעיבוד ספסל רטוב, הדמיה וניתוח תמונה לכימות תאים בודדים של RNAs ספציפיים.

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לזיהוי וטיהור תאי שחלה מזקיקים אנטראליים. אנו מרחיבים שיטות לעיבוד שחלות שלמות לשימור בהקפאה של רצועות קליפת המוח תוך קצירת זקיקים אנטראליים שלמים המטופלים באופן אנזימטי כדי לשחרר סוגים רבים של תאים שוכנים זקיקים, כולל גרנולוסה, תיקה, אנדותל, המטופויטים ותאי סטרומה.

חילוץ, תיוג וטיהור של תאים ספציפיים לשושלת מזקיקים אנטראליים אנושיים

קידום המחקר של פוליקולוגנזה פרה-אנטרלית דורש שיטות יעילות לבידוד זקיקים משחלות בודדות. מוצג כאן פרוטוקול מכני יעיל לבידוד זקיקים משחלות בקר באמצעות מסוק רקמות והומוגנייזר. שיטה זו מאפשרת איסוף של מספר רב של זקיקים פרה-אנטרליים בני קיימא משחלה אחת.

בידוד זקיקים פרה-אנטרליים קטנים משחלת הבקר באמצעות שילוב של פיצול, הומוגניזציה וסינון סדרתי

בפרוטוקול זה, שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) הותאמו לחקירה זוגית של שעתוק השחלות הספציפי לתא ואפיגנום באמצעות מודל עכבר NuTRAP שחצו לקו עכבר Cyp17a1-Cre.

חקירה זוגית ספציפית לתא של העכבר, השחלות אפיגנום ושעתוק

מאמר זה מציג מודל תרבית משותפת של תאי תקה וגרנולוזה בקר. לשיטה זו יש פוטנציאל לשמש בסיס אמין לניתוחים המתמקדים בחקר תקשורת פרקרינית והובלת מצע בין התאים הסומטיים בתוך הזקיק.

מערכת קו-תרבית מותאמת להבנת אינטראקציות בין תאי גרנולוזה-תקה בשחלת הבקר

פרוטוקול זה מתאר שיטות סטנדרטיות לבידוד ועיבוד נוזל זקיקים, תאים סומטיים וביציות לא בשלות מהליכי הפריה חוץ גופית, המאפשרים ניתוחים מולקולריים ותאיים באיכות גבוהה. גישות אלו תומכות במחקר תרגומי על פוריות, הזדקנות רבייה ותפקוד לקוי של השחלות באמצעות חומרים המושלכים בדרך כלל בטיפול קליני.

אוסף נוזל זקיקי אנושי, תאים סומטיים של זקיקים וביציות לא בשלות מאנשים העוברים הפריה חוץ גופית

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

למד שיטה יעילה לבידוד זקיקים שחלתיים אנושיים לניתוח ביטוי גנים באמצעות בידוד אנזימטי ומכני מבוקר. הטכניקה שומרת על שלמות הזקיקים ומאפשרת הערכת ביטוי גנים ספציפי במחקר ביולוגיה רבייה.

ניתוח ביטוי גנים בזקיקים אנושיים

גלה סרטונים נוספים